Prévia do material em texto
Bioquímica, Biologia Molecular e Biotecnologia Responsável pelo Conteúdo: Prof. Dr. Bruno Cavelheiro Araujo Revisão Textual: Prof. Ms. Luciano Vieira Francisco Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia • Estrutura Molecular e Função das Proteínas e Ácidos Nucleicos; • Organização Gênica de Procariotos e Eucariotos; • Introdução à Biotecnologia. · Proporcionar conhecimento introdutório fundamental para melhor compreensão e acompanhamento da Disciplina Fundamentos da Biologia Molecular e Biotecnologia, principalmente relacionado aos elementos básicos da Biologia Molecular e sua aplicação na Bio- tecnologia tradicional e moderna. OBJETIVO DE APRENDIZADO Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Mantenha o foco! Evite se distrair com as redes sociais. Mantenha o foco! Evite se distrair com as redes sociais. Determine um horário fixo para estudar. Aproveite as indicações de Material Complementar. Não se esqueça de se alimentar e se manter hidratado. Aproveite as Conserve seu material e local de estudos sempre organizados. Procure manter contato com seus colegas e tutores para trocar ideias! Isso amplia a aprendizagem. Seja original! Nunca plagie trabalhos. Orientações de estudo Para que o conteúdo desta Disciplina seja bem aproveitado e haja uma maior aplicabilidade na sua formação acadêmica e atuação profissional, siga algumas recomendações básicas: Assim: Organize seus estudos de maneira que passem a fazer parte da sua rotina. Por exemplo, você poderá determinar um dia e horário fixos como o seu “momento do estudo”. Procure se alimentar e se hidratar quando for estudar, lembre-se de que uma alimentação saudável pode proporcionar melhor aproveitamento do estudo. No material de cada Unidade, há leituras indicadas. Entre elas: artigos científicos, livros, vídeos e sites para aprofundar os conhecimentos adquiridos ao longo da Unidade. Além disso, você também encontrará sugestões de conteúdo extra no item Material Complementar, que ampliarão sua interpretação e auxiliarão no pleno entendimento dos temas abordados. Após o contato com o conteúdo proposto, participe dos debates mediados em fóruns de discussão, pois irão auxiliar a verificar o quanto você absorveu de conhecimento, além de propiciar o contato com seus colegas e tutores, o que se apresenta como rico espaço de troca de ideias e aprendizagem. UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Contextualização Considerada uma das disciplinas mais importantes na área da Biologia, principalmente pela sua aplicabilidade em diversos segmentos sociais, tais como agricultura, pecuária e saúde, Fundamentos da Biologia Molecular e Biotecnologia tem como objetivo principal fornecer uma visão global de como podemos utilizar diversas ferramentas moleculares para solucionar problemas reais da sociedade moderna, além de buscar otimizar diversos processos relacionados a esses e muitos outros segmentos. Assim, nesta Unidade introduziremos os principais conceitos da Biologia Molecular e a história da Biotecnologia tradicional e moderna, sendo estes pontos fundamentais para a busca do conhecimento mais específico dos temas abordados. 8 9 Estrutura Molecular e Função das Proteínas e Ácidos Nucleicos Proteínas e Aminoácidos As proteínas são macromoléculas complexas e, com exceção da água, são as moléculas mais abundantes nos seres vivos. Entre muitas funções biológicas, as proteínas participam de processos de replicação de DNA, determinam a forma e conferem estruturação celular, atuam em processos de permeabilidade das membranas biológicas, regulam a concentração de metabólitos celulares, controlam funções gênicas, catalisam reações, funções imunitárias, entre muitas outras. Sabe-se que as proteínas são sintetizadas a partir da expressão de genes específicos, os quais transmitem a informação genética, desencadeando uma série de processos que resultam na síntese das sequências de aminoácidos. Os aminoácidos são as unidades básicas das proteínas, são de composição orgânica e geralmente compostos por um grupamento amínico (-NH2) e um grupamento carboxílico (-COOH), ligados ao carbono α – primeiro carbono depois do grupo carbóxilo (Figura 1). De forma geral, as células possuem a capacidade de sintetizar proteínas com funções muito diversas, como enzimas, proteínas estruturais, hormônios, anticorpos e proteínas ligantes – exemplo, a hemoglobina –, pela combinação apenas dos vinte aminoácidos existentes (Quadro 1). Importante! Que nós, seres humanos, somos capazes de sintetizar apenas onze dos vinte aminoácidos existentes? Enquanto os outros nove devem ser consumidos na dieta? E que, devido a isso, são denominados aminoácidos essenciais? Você Sabia? O carbono α, além de estar ligado aos grupamentos amínico e carboxílico, está ligado a uma molécula de hidrogênio e a um grupamento variável, denominado cadeia lateral, que é representado pela letra R. Essa cadeia lateral (R) é quem determina a identidade do aminoácido que, dependendo de sua composição química, é classificado em polar, não polar ou neutro, ácido e básico. Figura 1 – Estrutura química básica de um aminoácido Fonte: Adaptado de commons.wikimedia.org 9 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Quadro 1 – Relação dos vinte aminoácidos essenciais e não essenciais, sua classificação de acordo com suas características bioquímicas e suas respectivas siglas Não essenciais Class. Siglas Essência Class. Siglas Ácido aspártico Ácido ASP Fenilalanina Neutro PHE Ácido glutâmico Ácido GLU Histidina Básico HIS Alanina Neutro ALA Isoleucina Neutro IIEU Arginina Básico ARG Lisina Básico LYS Asparagina Polar ASN Leucina Neutro LEU Cisteína Polar CYS Metionina Neutro MET Glicina Neutro GLY Treonina Polar THR Glutamina Polar GLN Triptofano Neutro TRP Prolina Neutro PRO Valina Neutro VAl Serina Polar SER Tirosina Polar TRY A formação de uma molécula proteica se dá pela ligação entre o grupamento carboxílico de um aminoácido e um grupamento amínico de outro aminoácido, formando uma ligação peptídica e como resultado dessa ligação ocorre a perda de uma molécula de água (Figura 2). Com isso, a molécula formada por essa ligação sempre apresentará um grupamento ácido em uma de suas extremidades, denominado extremidade carboxiterminal, e um grupamento básico na outra extremidade da molécula, denominado extremidade aminoterminal. A molécula resultante da junção de dois aminoácidos é denominada dipeptídio, a junção de alguns poucos aminoácidos é denominada oligopeptídios e os polipeptídios são formados pela união de muitos aminoácidos – em alguns casos chegando a milhares. Figura 2 – Ligação entre dois aminoácidos resultando em um dipeptídio e perda de uma molécula de água Fonte: Adaptado de commons.wikimedia.org 10 11 Organização Estrutural das Proteínas As proteínas podem ser basicamente classificadas em dois grandes grupos com relação à sua solubilidade e função: proteínas fibrosas, que desempenham papel estrutural nas células e tecidos animais, como tecido conjuntivo e de composi- ção da pele; proteínas globulares, que desenvolvem funções bioquímicas, como transporte pelas membranas celulares, catálise de reações – todas as enzimas são proteínas globulares – e desempenham ainda funções como moléculas mensagei- ras – hormônios. Com relação aos níveis de organização estrutural, as proteínas podem ainda ser divididas em quatro níveis (Figura 3): · Estrutura primária: relacionada à disposição – sequência – dos aminoáci- dos na cadeia polipeptídica, considerando também as ligações peptídicas, assim como as pontes de sulfeto. A conformação estrutural primária é es- pecífica para cada proteína, geralmente sendo determinada geneticamente; · Estrutura secundária: refere-se à organização espacial dos aminoácidos, ou seja, é como os aminoácidos se organizam entre si na sequência pri- mária da proteína. Este arranjo estrutural é possíveldevido à capacidade de rotação das ligações do carbono α e de seus grupamentos amínico e carboxílico, os quais estabilizados por pontes de hidrogênio. Em alguns ca- sos, a cadeia polipeptídica acaba por interagir consigo, formando estruturas globulares, entre as mais comuns estão a alfa-hélice, na qual as cadeias laterais dos aminoácidos estão viradas para fora; e a folha-ß, na qual os aminoácidos assumem a conformação de uma folha pregueada; · Estrutura terciária: refere-se ao enovelamento da molécula de proteína, incluindo o seu arranjo tridimensional. Este nível estrutural é observado quando diferentes estruturas secundárias se dispõem entre si e são estabilizadas por pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e ligações iônicas; · Estrutura quaternária: caracterizada por um complexo multiproteico, composto por diversas moléculas proteicas enoveladas e unidas por liga- ções não covalentes. Figura 3 – Nível organizacional das proteínas Fonte: Adaptado de thewhyinbiochemistry.wordpress.com 11 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Ácidos Nucleicos Os ácidos nucleicos são moléculas de grande importância biológica e que desempenham funções vitais em todos os organismos. Todos os seres vivos – procariontes ou eucariontes – possuem dois tipos de ácidos nucleicos: o Ácido Desoxirribonucleico (DNA) e o Ácido Ribonucleico (RNA). O ácido nucleico é uma molécula de grande extensão, constituída por unidades menores, denominadas nucleotídeos, que são sucessivamente conectadas umas às outras por ligações específicas – fosfodiéster. Os nucleotídeos são basicamente compostos por um açúcar – pentose: ribose ou desoxirribose –, um radical “fosfato” – ácido fosfórico – e uma base nitrogenada. O DNA é encontrado principalmente no núcleo celular e é considerado o grande depósito de informação genética dos organismos, desempenhando função essencial na transmissão de informação para processos relacionados à síntese proteica – tais processos serão melhores descritos na Unidade intitulada A síntese proteica. O DNA é formado por quatro diferentes nucleotídeos e quatro bases nitrogenadas – Adenina, Timina, Guanina e Citosina, representadas pelas respectivas letras A, T, G e C – e toda a informação gênica de um organismo está acumulada na sequência dessas quatro bases nitrogenadas, de modo que se alterará de acordo com a disposição e quantidade das quais. A conformação estrutural de uma molécula de DNA é de dupla hélice, ou seja, duas sequências de bases – nucleotídeos – em forma de fita helicoidal, formando pares de bases, unidos por pontes de hidrogênio. Nessa conformação, devido a interações químicas, a Adenina (A) só poderá parear com a Timina (T) e vice-versa – bases púricas –, enquanto a Guanina (G) só poderá parear com a Citosina (C) e vice-versa – bases pirímidicas. A orientação química das duas fitas helicoidais que formam a molécula de DNA é extremamente importante. Em uma das extremidades há um grupamento fosfato ligado ao carbono 5 do açúcar – extremidade 5’ – e na outra extremidade há uma hidroxila ligada ao carbono 3 do açúcar – extremidade 3’. A estrutura dupla hélice do DNA apresenta conformação estrutural na qual as ligações fosfodiésters – extremidades – 3’ e 5’ estão sempre dispostas em sentidos opostos – regra do anteparalelismo. Uma breve história da molécula de DNA está disponível em: https://goo.gl/k85NnBEx pl or O DNA nuclear é uma extensa sequência nucleotídica – que em seres humanos, se aberta linearmente, poderia alcançar até um metro de extensão –, contendo milhares de genes e, devido a isso, todos os organismos possuem um mecanismo de compactação do ácido nucleico. Esse processo pode ser dividido em quatro etapas: i) Primeiramente, a fita de DNA circunda uma proteína específica, denominada histona, originando a estrutura denominada nucleossomo; ii) vários nucleossomos 12 13 se unem uns aos outros, presos pela fita de DNA, formando uma espécie de colar de contas, igualmente conhecido como solenoide; iii) os solenoides se compactam, formando uma espécie de fibra cromossômica de alta densidade – nesse estágio as fibras possuem aproximadamente 300 nm e podem ser visualizadas a partir de equipamentos específicos –; iv) por fim, ocorre a formação dos loops, dados pela união das fibras, constituindo uma cromátide – com, aproximadamente, 700 nm –, como o cromossomo metafásico possui duas cromátides, o tamanho final pode chegar a 1.400nm. Assista ao esquema visual do processo de compactação do DNA em: https://youtu.be/gbSIBhFwQ4sEx pl or Como vimos, o DNA é a molécula responsável pelo armazenamento da informação genética e a estrutura – ácido nucleico – que executa a função de converter essa informação em produto, ou seja, na determinação do fenótipo é o RNA. Da mesma forma que a molécula de DNA, o RNA é um ácido nucleico, no entanto, o açúcar que o constitui é a ribose – enquanto no DNA é a desoxirribose –; além disso, é formado por apenas uma cadeia de nucleotídeos – fita simples – e pode ser encontrado principalmente no núcleo e citoplasma celular. Outro fator que diferencia o RNA do DNA é a substituição da base nitroge- nada Timina (T) pela base nitrogenada Uracila (U). O RNA pode ser dividido em três classes principais: i) RNA mensageiro (mRNA), que contém a informação genética proveniente do DNA e a conduz até o citoplasma da célula; ii) RNA transportador (tRNA), que conduz a informação genética por meio da sequência de aminoácidos até os ribossomos; e iii) RNA ribossômico (rRNA), que estrutura o ribossomo, propiciando as condições moleculares adequadas para síntese dos peptídeos. Todas essas funções descritas estão intimamente relacionadas ao pro- cesso de síntese proteica. Por possuir apenas uma fita simples, o RNA apresenta regiões complementares den- tro da mesma molécula que, da mesma forma que o DNA, são unidas por pontes de hidrogênio, formando os pa- res de bases Adenina e Uraci- la (AU) e Guanina e Citosina (GC). As estruturas químicas das moléculas de DNA e RNA estão representadas na Figura 4: Figura 4 – Estrutura química básica da dupla hélice do DNA e da fi ta simples de RNA Fonte: Adaptado de mundoeducacao.bol.uol.com.br 13 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Organização Gênica de Procariotos e Eucariotos Como sabemos, algumas características diferenciam organismos procariontes de eucariontes. Os procariotos são organismos unicelulares caracterizados pela ausência de um núcleo individualizado e são representados pelas eubactérias e as arqueobactérias. O grupo dos eucariotos é considerado amplamente heterogêneo – composto por protozoários, fungos, vegetais e animais –; de forma geral, são mais complexos que os procariotos e formados por organismos dos quais a principal característica esta na presença de um núcleo bem definido e organizado. Para ambos os grupos o DNA é responsável pelo armazenamento da informa- ção genética total, de modo que o conjunto desse material é denominado genoma. Tanto os genes de procariotos quanto de eucariotos são as unidades básicas de um genoma e são definidos como a sequência nucleotídica necessária para sintetizar um polipeptídio específico – proteína – ou uma fita de RNA estável. Com isso, cada gene possui uma região codificadora composta pela sequência de nucleotídeos – informação genética –, a qual codificará uma sequência de aminoácidos de uma cadeia polipeptídica ou de uma molécula de RNA. Além disso, o gene apresenta uma região reguladora que determinará e controlará a transcrição gênica – síntese de moléculas de RNA a partir de moléculas de DNA –, a qual sempre orientada da região 5’ para a região 3’ da molécula de DNA. Organização Gênica de Procariotos Como dito, este grupo é composto pelas eubactérias e arqueobactérias. Esses dois grupos basicamente diferenciam-se pela estrutura de suas paredes celulares – função de proteção da célula – e por algumas características do metabolismoproteico, já que as arqueobactérias possuem mecanismos de síntese de proteínas mais semelhantes aos dos organismos eucariontes. Comparado aos eucariotos, o genoma de procariotos é muito menor e menos complexo. As regiões do DNA de procariotos que controlam a transcrição podem ser divididas em promotor, que é o local da fita de DNA onde a molécula de RNA-polimerase – enzima responsável pela transcrição – se liga, dando início ao processo de transcrição; e terminador, que é a região do DNA que determina o término da leitura da molécula de RNA- polimerase, sinalizando o término do processo de transcrição. Existem ainda outras regiões específicas e que agem no processo de expressão, como os operadores, que estão relacionados à repressão da expressão, e as Upstream Activator Sequences (UAS), que são sítios de ligação relacionados ao reconhecimento de proteínas ativadoras da transcrição. 14 15 Em procariotos, a sequência nucleotídica de um DNA reflete exatamente na sequência de aminoácidos de uma proteína ou molécula de RNA – colinearidade. Assim, cada códon – conjunto de três nucleotídeos que sintetiza um aminoácido – codificará um aminoácido do peptídeo. Com isso, para codificar uma proteína, por exemplo, com cem aminoácidos, faz-se necessário um gene com trezentos nucle- otídeos, ou seja, a sequência codificadora do DNA é agrupada e contínua, sem se- quências de interferência – íntrons. Esse arranjo molecular em procariotos é deno- minado óperons e permite que o organismo expresse apenas os genes que codifi- cam proteínas com funções correspondentes e apenas necessários no momento, por exemplo, bactérias presentes em um meio contendo lactose expressarão os genes e, consequentemente, produzirão as enzimas necessárias apenas à utilização deste substrato, adaptando-se rapidamente ao meio e economizando recursos e energia, já que não expressarão esses genes na ausência desse produto. Diferente ao observado para eucariotos, a maioria dos procariotos apresenta genoma composto por apenas um cromossomo, formado por uma dupla fita de DNA circular fechada em suas extremidades, classificando-os como haploides. Como reflexo da haploidia, alterações na molécula de DNA de procariotos como, por exemplo, mutações gênicas, são obrigatoriamente expressas no fenótipo – características físicas – do organismo. Organização Gênica em Eucariotos Comparada aos procariotos, a organização gênica de eucariotos é, em geral, maior e mais complexa, com regiões reguladoras extensas contendo inúmeros elementos e distantes das regiões codificadoras. As sequências gênicas de eucariotos – e em alguns raros casos de procariotos – apresentam regiões intervenientes, denominadas íntrons, que dividem a sequência gênica em vários segmentos. Os íntrons não codificam diretamente um peptídeo, são transcritos em um tipo de RNA (pré-mRNA) e durante o processamento do mRNA ocorre a remoção destes íntrons, de modo que o agrupamento das regiões que realmente codificam proteínas ou RNA estável (mRNA, tRNA, rRNA) é denominado éxons. O genoma dos eucariotos está contido principalmente no núcleo celular, organizado em dois ou mais cromossomos; no entanto, algumas organelas, como mitocôndrias e cloroplastos, apresentam genomas menores e específicos. Salvo algumas exceções – como algumas leveduras haploides e plantas poliploides –, a maioria dos eucariotos possui cromossomos homólogos, lineares e de número variável, os quais organizados em pares e unidos pela fusão de núcleos germinativos, classificando-os como organismos diploides (2n). Assim, nas células somáticas – que formam os tecidos e órgãos – para cada característica existem pelo menos dois genes, provenientes de duas células germinativas (n). Como dito, a síntese proteica em eucariotos é mais complexa que em procariotos e será melhor detalhada na unidade intitulada A síntese proteica. A Figura 5 apresenta o esquema básico de um gene de procarioto e eucarioto: 15 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Figura 5 – Esquema básico da estrutura de um gene procariótico e eucariótico Fonte: Acervo do Conteudista Introdução à Biotecnologia O conceito de Biotecnologia foi originalmente proposto por Eveky, em 1919. Segundo esse autor, o termo Biotecnologia é: “A Ciência e os métodos que permitem a obtenção de produtos a partir de matéria-prima, mediante a intervenção de organismos vivos”. Com o passar do tempo, as definições foram se alterando e, de certa forma, tornando-se mais simples e aplicáveis. Em 2003, o Biotechnology Industry Organization (BIO) descreveu Biotecnologia como: “[...] “Bio” + “Tecnologia”, isto é, o uso de processos biológicos para solucionar problemas ou desenvolver produtos úteis”. Mas talvez a definição que mais se enquadre para os dias atuais seja: “A atividade que utiliza agentes biológicos no desenvolvimento e melhoria de produtos úteis para a sociedade” (Figura 6): Figura 6 – Modelo esquemático do conceito e aplicações da biotecnologia Fonte: bteduc.bio.br 16 17 Biotecnologia é uma realidade cada vez mais comum nos dias atuais e pode ser considerada uma atividade ampla, de grande geração de empregos e que atrai altos investimentos. Nos últimos anos, basicamente todos os setores sofreram algum tipo de inovação biotecnológica, entre os quais destacam-se: energia, indústria, meio ambiente, agricultura, pecuária, alimentação e saúde (Figura 7): Biotecnologia Produção de fármacos Melhoramento genético Clonagem Produção das vacinas Análises do DNA Cultura de tecidos e células Controle biológico Transformação genética Fermentações industriais Uso de microrganismos na agricultura Figura 7 – Aplicação da Biotecnologia em diversos setores da sociedade Fonte: Acervo do Conteudista De forma geral, a Biotecnologia pode ser dividida em tradicional e moderna. Apesar da inovação e expansão da Biotecnologia nos dias atuais, sua aplicação se dá de forma tradicional desde a Antiguidade – em alguns casos, há cinco mil anos –, dado pelo seu emprego, por exemplo, na produção e conservação de alimentos fermentados como pão, queijo, vinho e vinagre. A partir da Idade Média (séc. XII) vários acontecimentos importantes marcaram a história da Biotecnologia no mundo, como a destilação do álcool (séc. XII). Na Idade Moderna podemos destacar a produção comercial de cerveja – que, por sinal, era bem diferente da nossa – e o cultivo de fungos (séc. XVII). Mas foi a partir da Idade Contemporânea, com o surgimento de novas áreas do conhecimento, como a Microbiologia e a Bioquímica, que houve maior propagação de várias técnicas biotecnológicas. Como exemplos, podemos citar a criação da vacina contra a varíola (1796), processos de pasteurização de alimentos (1863), primeiro transplante de órgão (1899), descoberta do Salvarsan – primeiro agente quimioterápico (1906) –, descoberta da penicilina por Fleming (1928), entre muitos outros episódios. Com o avanço de tecnologias, o alto crescimento industrial e o aumento de pesquisas nessa área, deu-se início à Biotecnologia moderna. Sem dúvida, o grande marco desta Era corresponde aos experimentos realizados por Boyer e Cohen em 17 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia 1973, entre os mais significativos está a transferência de um gene de uma espécie de sapo para uma bactéria, sendo que esse experimento “abriu portas” para a criação de uma nova área do conhecimento, a Engenharia Genética. Recentemente, muitas técnicas moleculares são aplicadas na Biotecnologia, como o sequenciamento do genoma humano (2001), importante no tratamento de patologias genéticas; indução de pluripotencialidade celular em células somáticas (2006); e criação de alimentos transgênicos, como a batata (2010). Com o decorrer dos anos, técnicas moleculares tornaram-se mais aplicáveis e acessíveis à sociedade, permitindo processos antes inimagináveis como, por exemplo, o sequenciamento genético individual – por pessoa – de algum órgão ou tecidocom potencial desenvolvimento de patologias dadas pela carga genética do paciente, como alguns tipos de câncer. Tais técnicas, além de específicas, propiciam um tratamento individual e adequado para cada tipo de patologia e paciente. Quais produtos e serviços que utilizamos rotineiramente são provenientes de proces- sos biotecnológicos?Ex pl or 18 19 Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Livros Biologia Molecular da Célula ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre, RS: Artmed, 2010. Entendendo a Biotecnologia BORÉM, A.; SANTOS, F. R. Entendendo a Biotecnologia. 3. ed. Viçosa, MG: Universidade Federal de Viçosa, 2008. Fundamentos de Biologia Molecular MALACINSKI, G. M. Fundamentos de Biologia Molecular. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. Vídeos CURSO de Biologia Molecular 1/5 https://youtu.be/NX99OMztZlA ORGANIZAÇÃO do Gene Procarioto https://youtu.be/LMYr1_sECFg REGULAÇÃO e Expressão Gênica em Eucariotos https://youtu.be/zjho2fVUWBo 19 UNIDADE Introdução à Biologia Molecular e Biotecnologia Referências DE ROBERTS, E. M. F.; HIB, J. Base da Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro: ORT, 2012. ZAHA, A. Biologia Molecular básica. 3. ed. Porto Alegre, RS: Mercado Aberto, [20--]. ZÁRATE, C. B.; SAHAGÚN, D. O.; BORUNDA, J. S. A. Biología Molecular: fundamentos y aplicaciones. Desarrollo Santa Fe: McGraw-Hill, 2009. 20