Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
1 DNA e RNA Replicação – Transcrição – Tradução Introdução à Biologia Molecular Alexandre Havt Estrutura dos Ácidos Nucléicos � Moléculas com informações para a síntese de proteínas � DNA – armazém ou biblioteca celular � Contém informações para a construção das células e tecidos � Duplicação dos genes garante a perpetuação das espécies � Transcrição – síntese de RNA � RNA mensageiro (mRNA) � RNA transportador (tRNA) � RNA ribossômico (rRNA) � Tradução – síntese de proteínas a partir das informações dos RNAs � Descoberta da estrutura do DNA em 1953 Watson e Crick Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA 2 Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA RNA ribossômico - rRNA � Ribossomos � Procariotos � Citoplasma � Mitocôndrias � Procariotos � 3 tipos de moléculas de rRNA • 16S + 21 proteínas – 30S • 23S • 5S � Citoplasma de eucariotos � 4 tipos de moléculas de rRNA • 18S + 33 proteínas – 40S • 5S • 28S • 5,8S � Mitocondriais � 55S • Propriedades similares ao das bactérias Eucariotos +34 proteínas – 50S 70S +50 proteínas – 60S 80S RNA transportador - tRNA � Função � Transportar aminoácidos para a síntese protéica � Assegurar a incorporação dos mesmos na posição correta • anticódon � Células com pelo menos 20 tRNA � Pequenas moléculas � 80 nucleotídeos � 4S � Formados por blocos monoméricos � RNA e DNA • 5 Nucleotídeos � Proteínas • 20 aminoácidos � Monômeros adicionados 1 por vez � Cadeia de formação tem ponto de partida específico com crescimento unidirecional para um terminal fixo � Direção 5´ - 3´ � Produto primário é frequentemente modificado Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas 3 Replicação do DNA Replicação do DNA � Duplicação do material genético para a divisão celular � Replicação é semiconservativa • Uma fita parental e uma nova fita sintetizada � Forquilha de replicação � Helicases - Separação das duplas fitas � Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação � Primase – síntese de iniciador � Topoisomerase • Desenrolam supertorção � Ligases – união dos fragmentos de Okasaki � DNA polimerases • α - associação com primase para formação do iniciador • δ - polimerização das fitas líder e lenta • γ - polimerização DNA mitocondrial • β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo Replicação do DNA Eucariótico Síntese de RNA Transcrição Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA � RNA polimerases devem reconhecer � O ponto de início da transcrição � Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita � Região promotora do DNA � Controla a ligação da RNA polimerase � Identifica o ponto de início da transcrição � Controla a frequência da transcrição • Sequências regulatórias no promotor • Sequências perto do promotor • Reforçadores Interagem com proteínas que estabilizam a ligação RNA-polimerase ao promotor 4 Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos Síntese de proteínas Tradução Síntese Protéica - Tradução � Ocorre nos ribossomos – rRNA � Direcionado pela sequência dos códons de mRNA � Cada tRNA traz um aminoácido específico ao seu anticódon � Aminoacil-tRNA 5 Código Genético GGlyGluAlaVal AGlyGluAlaVal CGlyAspAlaVal UGlyAspAlaValG GArgLysThrMet AArgLysThrIle CSerAsnThrIle USerAsnThrIleA GArgGlnProLeu AArgGlnProLeu CArgHisProLeu UArgHisProLeuC GTrpParadaSerLeu AParadaParadaSerLeu CCysTrySerPhe UCysTyrSerPheU (3’)GACU(5’) Terceira baseSegunda basePrimeira base Formação do aminoacil-tRNA � Aminoacil-tRNA � tRNA ligado covalentemente a um aminoácido na terminação 3’ � Cada aminoácido com seu tRNA • Alanil-tRNAala • Metionil-tRNAimet � 20 Aminoacil-tRNA-sintetases � Processo dependente de ATP � Ocorre em 2 passos • Formação do complexo: � enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato • Transferência do aminoácido ativo � Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose � Nucleotídeo de adenina (CCA) Processo da Tradução � Envolvimento de 3 passos � Iniciação � Alongamento � Terminação Iniciação Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação � Códons de parada � Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com • UAA • UGA • UAG � Fatores de liberação unem-se ao ribossomo � Hidrólise da ligação peptidiltransferase • Cadeia peptídica • tRNA � Peptídeo sintetizado é liberado � Dissociação das subunidades do ribossomo • Liberação do mRNA 6 Polissomos � Ligação de vários ribossomos ao mRNA � Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA � Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos Técnicas de Biologia Molecular � Reação de Polimerase em Cadeia – PCR � Função - Multiplicação de trecho específico de DNA • Problema – análise de ácidos nucleicos �Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos � Primers � Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus) • Enzima termoestável em temperatura até 117 °C • Temperatura ótima 72 °C � Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas � 1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in Enzymology � 1989 – primeiro termociclador � 1994 – Nobel em química para Karis Mulis Karis Mulis Técnicas de Biologia Molecular � Fundamentos do PCR � Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C � Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer) � Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C � Reagentes essenciais � Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM DTT, 50% glicerol � Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl � Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima � Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s iguais � Primers específicos à sequência que se deseja amplificar Técnicas de Biologia Molecular � Vídeo da reação de PCR Técnicas de Biologia Molecular � Fundamentos da Transcriptase Reversa � Vírus de RNA tipo VI • Enzima transcriptase reversa • Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA �AMV - Vírus da Mieloblastose aviária �M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus) � Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do mRNA � Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA) � Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT mRNA cDNA CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT mRNA cDNA GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA cDNA RNAse I GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA cDNA PCR 7 Técnicas de Biologia Molecular � Isolamento de RNA � Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível – evitar RNAse � Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg) � Método muito utilizado Reagente TRIZOL Isolamento de RNA por TRIZOL � Fenol + Isotiocianato de guanidine � Membranas celulares e nucleares destruídas � Manutenção da integridade do RNA � Maceração da amostra com TRIZOL � Clorofórmio – separação em 3 fases � RNA – sobrenadante � DNA – camada intermediária � Protéinas – camada inferior � Precipitação com Isopropanol � Lavagem com Etanol 75% � Leitura em espectrofotômetro � 260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL]) � Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( ≅ 2,00) Amostra 100 mg + 1 mL de TRIZOL Homogeneizar • Centrifugar 12.000 g 10 min. 2- 8 °C• Remover sobrenadante p/ novo tubo • Acrescentar 200 uL de clorofórmio � Vórtex por 15 sec. � Incubar RT °C p/ 2-3 min � Centrifugar 12.000 g p/ 15 min • Remover sobrenadante transparente para novo tubo • Acrescentar 500 uL de isopropanol • Incubar RT °C 10 min • Centrifugar 12.000 g p/ 15 min à 2 – 8 °C • Descartar sobrenadante • Acrescentar 3x 1mL de etanol 75% • Centrifugar 3x a 7.500 g por 5 minutos à 2 – 8 °C • Descartar 3° sobrenadante • Evaporar etanol •Solubilizar pellet com ddH2O autoclavada •Leitura espectrofotômetro Análise por Eletroforese � Principio básico � O DNA tem carga negativa � Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o catodo � Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando- o por tamanho • Moléculas menores migram mais rápido • Moléculas maiores migram mais lento � A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de tamanho conhecido Análise por Eletroforese � Principio básico � Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão eletrolítico • Tris-Acetato-EDTA – TAE • Tris- Borato-EDTA • Solubilização do gel por esfriamento � Aumento da viscosidade da amostra com glicerol � Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue � Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo Cuba de Eletroforese Horizontal 8
Compartilhar