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Questões – Biotec 
Q1) A sequência da proteína alunina é mostrada abaixo. Deseja-se fazer uma 
clonagem direcional. 
ATGTAACGGGGAGCTGGAGCTTTGGGCCGAATTTCCAATTAAAGATGATTTT
TACAGTCAATGAGCCACGTCAGGGAGCGATGGCACCCGCAGGCGGTATCA
ACTGATGCAAGTGTTCAAGCGAATCTCAACTCGTTTTTTCCGGTTTCCCGG
CCCTGCGAATTCTTGGCAGCGCTGCACCCTTTAACTTAAACCTCGGCCGGC
CGCCCGCCGGGGGCACAGAGTGTGCGCCGGGCCGCGCGGCAATTGGTC
CCCGCGCCGACCTCCGCCCGCGAGCGCCGCCGCTTCCCTTCCCCGCCCC
GCGTCCCTCCCCCTCGGCCCCGCGCGTCGCCTGTCCTCCGAGCCAGGAT
CCCGCTGACAGCCGCGGCGCCGCGAGCTTCTCCTCTCCTCACGACCGAG
GGTGTTCAAGTGTGCAATTATCTCAACTCTCCTCCAGTC 
Deseja-se amplificar essa sequência e inseri-la num vetor fusionada à 
sequência de outra proteína (proteína X). A sequência do vetor é mostrada 
abaixo. Proteína X STOP STOP STOP TAC AGG GAA TTC AGC ATC TAG ATT 
TGG GAT CCG CGG AAGT CG ACT AGA TAA CTG AAA EcoRI XbaI BamHI 
Sac II Sal I Represente os primers utilizados para a amplificação e justifique os 
sítios de restrição escolhidos. 
R: Os sítios de restrição escolhidos foram Xbal, Sac II e Sal I. EcoRI e BamHI 
não podem ser escolhidos dado que reconhecem uma sequência contida na 
proteína de interesse e a utilização desses causaria uma digestão indesejável 
da sequência. 
O primer senso (5´3´) se liga na fita complementar e o primer antisenso na fita 
original. 
Sequência do primer senso com o Xbal: 
5´TCTAGAATGTAACGG 3´ 
Sequência do primer antisenso com o Sal I: 
5´GTCGACGACTGGAGG 3´ 
Q2) Discuta as diferenças entre o processo de clonagem de sequências 
oriundas de bactérias e de células de mamífero. 
R: O processo de clonagem oriundas de bactérias e de células de mamífero 
apresenta inúmeras diferenças. A diferença mais marcante é que as bactérias 
não realizam modificações pós-traducionais, como glicosilação, por exemplo, 
importantes para a atividade biológica, estabilidade, imunogenicidade da 
proteína produzida, sendo a clonagem em bactérias vantajosa apenas quando 
a proteína de interesse não apresenta tais modificações ou quando essas 
modificações não são essenciais para seu funcionamento. Além disso, outras 
diferenças são: 
- Presença de Introns: As bactérias não possuem íntrons (sequências não 
codificantes), o que facilita a clonagem, visto que o DNA genômico pode ser 
diretamente inserido em vetores de clonagem. Nas células de mamífero, por 
sua vez, os genes possuem íntrons e exons. Dessa forma, a sequência 
codificante da proteína estará presente no RNA mensageiro final (após 
processamento por splicing). Portanto, para a obtenção de moldes de DNA que 
contenham a sequência finalizada, ocorre a síntese de DNA complementar a 
partir da reação de transcrição reversa (pela transcriptase reversa e um primer 
poli-T, para o anelamento com a cauda poli-A dos RNA mensageiros maduros). 
- Elementos Reguladores: As bactérias utilizam promotores bacterianos 
simples, como o promotor de T7 ou lac. Já as células de mamíferos requerem 
promotores eucarióticos, como o promotor de citomegalovírus (CMV), e podem 
precisar de elementos adicionais como enhancers e poliadenilação. 
Q3) Discuta os mecanismos epigenéticos de controle da expressão gênica em 
eucariotos. 
R: Os controles epigenéticos estão relacionados com a acessibilidade de 
informação gênica. Um dos mecanismos epigenéticos é a acetilação de 
histonas, que consiste em adicionar um grupamento acetil em proteínas 
histonas, o qual dilui a carga parcial positiva da superfície da proteína. Em 
condições normais, a histona possui uma carga parcial positiva que faz com 
que ela possua uma boa interação com o DNA, de carga parcial negativa. Com 
a acetilação, há o relaxamento da interação entre o DNA e a proteína histona. 
Dessa forma, quanto mais acetiladas são as histonas de um determinado 
segmento gênico, mais relaxado ele estará e assim, mais acessível a 
informação estará. Outro mecanismo de controle epigenético é a metilação de 
DNA, no qual consiste na metilação de seguimentos do DNA, dificultando o 
reconhecimento desse seguimento gênico. Então, quanto mais metilado o 
DNA, mais difícil a maquinaria de transcrição entender sua atuação naquele 
seguimento. Dessa forma, a metilação de DNA está associada a repressão da 
expressão gênica. Além desses mecanismos, há também o controle da 
expressão gênica pelos microRNAs, que são não codificantes e produzidos no 
núcleo das células por um complexo de RNA-polimerase específico. Ele é 
processado de forma a gerar pequenos segmentos que serão utilizados pelo 
complexo proteico RISC, que testa a complementariedade do microRNA com 
RNA mensageiros presentes no citoplasma da célula. Se houver um RNA 
mensageiro complementar, o complexo enzimático degrada este RNAm. 
Q4) Discuta o processo de transcrição gênica. 
R: A transcrição gênica consiste na formação de um RNA a partir do DNA. A 
enzima responsável pela síntese de RNA é a RNA polimerase, que atua 
incorporando um nucleotídeo na cadeia pela ponta 3´OH da fita que está sendo 
produzida. Existem os RNA mensageiros, os ribossomais e os transportadores, 
além dos RNAs não codificantes. Para a formação de RNA mensageiros, a 
RNA polimerase 2 atua. No caso dos procariotos, há uma subunidade do 
complexo RNA-polimerase, o fator sigma, que reconhece sequências 
específicas de DNA. Dessa forma, uma vez que a RNA polimerase com o fator 
sigma associa-se a essas regiões, tem o inicio da transcrição. Ao longo da 
transcrição, há a dissociação do fator sigma do complexo RNA-polimerase. Há 
diferentes tipos de fator sigma e cada um vai reconhecer uma sequência 
específica no genoma da célula. Além disso, a associação do fator sigma com 
a fita de DNA que determina qual fita de DNA será utilizada. Em eucariotos, 
quem determina a orientação da transcrição são os fatores de transcrição, que 
diferentemente do fator sigma, não fazem parte do complexo RNA-polimerase. 
Nos eucariotos, há a associação dos fatores de transcrição nas regiões 
regulatórias dos genes, o que culmina na recrutação do complexo RNA-
polimerase. Além disso, os RNAs de procariotos são policistrônicos, ou seja, 
contém mais de uma informação para a síntese proteica, enquanto os RNAs de 
eucariotos são monocistrônicos, carregam a informação para a síntese de 
apenas uma proteína. Além disso, os RNAm de eucariotos possuem 
capeamento 5´, uma metilação de uma guanina na posição 5´, e a adição de 
uma cauda poli-A na ponta 3´. Tais modificações funcionam como marcadores 
de maturidade do RNA mensageiro. Além disso, em eucariotos, há o processo 
de edição do RNA mensageiro por splicing. 
Q5) Descreva a técnica de PCR. 
R: A técnica de PCR consiste em uma técnica para a amplificação da massa de 
DNA. É uma reação enzimática exponencial, na qual a partir de quantidades 
ínfimas de DNA, gera-se uma massa utilizada para análise ou manipulação. 
Essa técnica pode ser dividida em 3 fases: exponencial (máximo de eficiência 
da reação), linear (eficiência diminuída devido a diminuição de insumos da 
reação) e a fase platô, na qual a adição de ciclos da reação não acarreta em 
aumento apreciável da massa de DNA. Para a reação ocorrer, são necessários 
os seguintes componentes: Primers senso e antissenso, DNA polimerase, 
moldes de DNA, Mg2+ (determinante na interação entre o molde de DNA e a 
DNA-polimerase) e um tampão de reação. A DNA polimerase utilizada deve 
apresentar alta fidelidade e processividade, como a Taq polimerase. A reação 
ocorre em etapas: 
- Dissociação das duplas fitas de DNA molde (desnaturação): Ocorre em 
temperaturas em torno de 95°C. 
-Associação dos primers em suas respectivas fitas: Resfriamento da reação 
para permitir o anelamento (temperatura determinada pela sequência a qual os 
primers anelam). 
- Incorporação da DNA polimerase (temperatura ótima de ação da enzima – em 
torno de 70°C). 
- Formação das duplas fitas de DNA. 
OBS: Os primers mais utilizados são os oligo dT, que são pequenas sequecias 
repetidas de T, anelandoem sequecias repetidas de A. O uso desse tipo de 
primer faz com que apenas moléculas de RNAm maduras sejam convertidas a 
DNAc. 
*Q6) Discuta as características do cultivo de células animais em escala 
laboratorial e industrial. 
O cultivo de células animais em escala laboratorial e industrial possui algumas 
características distintas. No cultivo em escala laboratorial, é importante 
fornecer nutrição adequada para as células e controlar as características físico-
químicas do ambiente, como pH, osmolaridade e temperatura. Se as células 
forem originárias de um tecido sólido, é necessário utilizar uma superfície de 
adesão, como frascos de cultura ou placas de Petri. No entanto, se as células 
forem originárias de um tecido líquido e viverem em suspensão, não é 
necessária uma superfície de adesão. Em escala laboratorial, pode-se utilizar 
antibióticos no meio de cultivo, mas na indústria isso não é viável, pois todos os 
componentes adicionados ao meio de cultura devem ser removidos nas etapas 
de purificação devido a possíveis respostas alérgicas. Já no cultivo em escala 
industrial, são utilizados biorreatores, que permitem um controle mais preciso 
das condições de cultivo. As células são cultivadas em meio de cultivo 
submerso, ou seja, imersas no meio. É necessário um controle fino dos meios 
de cultura, incluindo a fonte de nutrientes, pH, osmolaridade e temperatura, 
geralmente em torno de 37ºC, que é a temperatura fisiológica do corpo 
humano. Além disso, a concentração de gases, como CO2 (predominante nos 
tecidos animais) e, dependendo da concentração de células, a alimentação 
com O2 pode ser necessária, sendo controlada para manter as condições 
ideais. Na escala produtiva industrial do cultivo de células animais, o objetivo é 
amplificar a biomassa celular até atingir a capacidade de um biorreator de alta 
capacidade. Essa amplificação é feita de forma gradual, através do 
escalonamento de biomassa, em que é utilizado um biorreator de inóculo para 
aumentar a quantidade de células e reduzir o tempo morto de processo no 
biorreator de produção. 
Q7) Diferencie anticorpos produzidos por hibridomas de anticorpos 
recombinantes, apresentando as vantagens e desvantagens. 
R: Os anticorpos produzidos por hibridomas são anticorpos com estrutura 
totalmente derivada de origem animal, dado que os hibridomas são uma 
mistura de células de baço animal (células produtoras de anticorpos - mortais) 
e células de mieloma (imortais) a partir da fusão por polietilenoglicol. Para a 
formação dos hibridomas, é feita essa mistura. No entanto, pode haver células 
de baço combinadas com células de baço e células de mieloma combinadas 
com células de mieloma. Para a seleção de clones produtores de Mabs, há o 
cultivo desses híbridos em um meio de seleção HAT (hipoxantina-aminopterina-
timidina), que faz com que apenas os híbridos de células de baço com células 
de mieloma sobrevivam. As células de baço apresentam a via timidina-quinase 
(TK) ativa e também apresentam uma via de salvação, enquanto que as células 
de mieloma não apresentam via TK ativa, apenas via de salvação. A 
aminopterina do meio HAT inibe a via de salvação. Dessa forma, híbridos de 
células de mieloma com células de mieloma (TK-/TK-) não conseguem 
sobreviver, apenas os híbridos de células de baço com células de mieloma 
(TK+/TK-), devido a via TK das células de baço ser ativa. Os híbridos formados 
por células de baço apenas morrem com o tempo, dado que são células 
mortais. Já os anticorpos recombinantes são produzidos através da tecnologia 
de DNA recombinante e são moléculas que não contém toda estrututa derivada 
de um anticorpo natural. Os anticorpos recombinantes podem ser quiméricos, 
os quais possuem a região Fab oriunda de um animal e a Fc oriunda de 
humanos e os anticorpos humanizados, o qual apresenta informação referente 
a toda estrutura de um anticorpo humano, com exceção das regições CDR. 
Para o desenvolvimento de anticorpos recombinantes, é utilizada a técnica 
Phage Display ou Varredura de fagos. Nesta técnica, um animal é desafiado 
com um antígeno para qual desejamos produzir o anticorpo e os linfócitos 
produzidos por esse animal são isolados. Cada linfócito terá seu RNAm isolado 
e submetido a transcrição reversa para obtenção do DNAc. Esses DNAc serão 
amplificados por PCR e os fragmentos de DNA serão clonados em um vetor de 
expressão que produz moléculas do capsídeo de um fago. Os fagos produzidos 
a partir da clonagem então terão na superfície do seu capsídeo a expressão da 
fração Fab clonada nesse vetor. Os fagos contendo as informações infectam 
uma cultura de E. coli e as bactérias infectadas são plaqueadas em ágar, onde 
crescerão colônias nas quais cada uma foi infectada por apenas um fago 
distinto. Para isolar a colônia que possui o fago que expressa a fração Fab de 
interesse, utiliza-se um papel de filtro com o antígeno imobilizado e a interação 
do fago com o antígeno indica a colônia a ser isolada. Após o isolamento das 
colônias reativas, faz-se a extração do DNA plasmidial e através de uma 
reação de sequenciamento, identifica-se a sequencia produtora da região Fab 
ou CDR. 
Anticorpos produzidos através de hibridomas: 
Vantagens – Processo mais barato, produção estável e de longo prazo, 
aplicação na pesquisa e análises clínicas. Desvantagens – imunogenicidade 
em humanos, produção limitada 
Anticorpos recombinantes: 
Vantagens - Permitem engenharia, não necessita de imunização animal, baixa 
imunogenicidade. Desvantagens – Tecnologia mais avançada, mais caro, 
produção inicial requer o acesso à sequencia do anticorpo desejado. 
Q8) Diferencie vacinas recombinantes das vacinas clássicas, apresentando as 
vantagens das recombinantes. 
R: As vacinas clássicas são vacinas que utilizam o antígeno inativado ou 
atenuado. Para a sua produção, é necessário obter grande quantidade do 
antígeno e submetê-lo a técnicas de inativação ou atenuação. As vacinas 
recombinantes são divididas em alguns grupos, como as vacinas de 
subunidade proteica, vacinas de partículas pseudovirais, vacinas de 
organismos carreadores e as vacinas de ácidos nucleicos. A vacina de 
subunidade proteica é a mais simples e basta a presença do antígeno para a 
ativar o sistema imune. Dessa forma, obtendo a sequência codificante para 
esta proteína e a utilizando para a construção de vetores de expressão, 
podemos produzir a proteína isolada e utilizá-la como insumo para a produção 
da vacina. A vacina de organismos carreadores utiliza vetores virais, não 
patogênicos mas altamente imunogênicos. Se introduzirmos no genoma desse 
organismo a informação codificante da proteína do patógeno, ele continua 
tendo suas propriedades de não patogenicidade, mas terá em sua estrutura a 
ptn do patógeno. Os vetores virais podem ser replicativos, q se replicam in vivo 
e os não replicativos. A vacina de partículas pseudovirais consistem na 
utilização de uma estrutura complexa que possui toda a composição 
tridimensional do patógeno. Dessa forma, é necessário que na plataforma de 
produção, consigamos expressar de forma conjunta todas a proteínas 
necessárias para a montagem do capsídeo ou do envelope viral. Ela tem a 
vantagem de não carregar material genético. Por fim, as vacinas de ácidos 
nucleicos consistem na administração da informação para que as células do 
organismo do paciente expressem a proteína que será o agente vacinal em si. 
Elas são capazes de ativar tanto mecanismos humorais quanto citotóxicos. As 
vacinas de DNA são compostas por um vetor de expressão (precisa ter os 
componentes necessário para a ativação da transcrição da sequência 
codificante obtida nessa molécula) e uma vez administrado, essa molécula 
atravessa a membrana da célula e atinge o núcleo, onde será transcrita. O 
RNAm transcrito pode ser secretado da célula ou ficar na superfície, 
desencadeando diferentes tipos de reações imunes. Asvacinas de RNA 
consistem em moléculas prontas para a tradução. Pode ser de dois tipos: 
vacinas contendo o RNAm não replicativo e vacinas contendo RNAm 
autoreplicativo, que contém a sequencia codificante para a proteína e para a 
RNA replicase, uma enzima que amplifica a quantidade desse RNA. As 
vantagens das vacinas recombinantes são: Livres de partículas virais 
infecciosas, produção em larga escala e mais rapidamente e capacidade de 
adaptação de modelos previamente estabelecidos. 
 
*Q9) Escreva um método para imunização contra a malária por via oral através 
do uso de organismo transgênico e dizer a vantagem e a desvantagem desse 
método. 
*Q10) Descrever como obter hormônio de crescimento em glândula mamária 
de animal transgênico e dizer as desvantagens. 
Q11) Discuta os mecanismos fisiológicos da tradução de mRNA em proteínas 
em eucariotos e procariotos, ressaltando suas semelhanças e diferenças. 
 R: Após a síntese de RNAm, ele vai ser decodificado por códons em sua 
sequência. Cada códon no RNAm é referente a um aminoácido. O código 
genético é degenerado. Os RNAt são os responsáveis por mediar o processo 
de reconhecimento dos códons e a correspondência do seu aminoácido 
específico. O RNAt tem a sequência do anticódon que vai parear o códon do 
RNAm e cada RNAt vai carregar o seu AA específico de forma que no 
ribossomo tem-se a adição de um novo AA na cadeia de proteína que está 
sendo gerada, sempre a partir da junção do grupamento amino-terminal do AA 
que está sendo incorporado na porção carboxi-terminal da sequencia do 
polipeptídeo que está sendo produzido, fazendo a ligação peptídica. Em 
eucariotos, o processo de iniciação da tradução é CAP-dependente , ou seja, 
depende do capeamento 5´no RNAm. Dessa forma apenas RNAm que tenham 
CAP e cauda poli A são traduzidos. O processo de tradução vai ser terminado a 
partir do momento em que o ribossomo encontrar o códon de parada, que será 
reconhecido por uma proteína chamada fator de liberação de ribossomo que 
sinaliza o ribossomo para liberar a cadeia polipeptídica e se desmontar, 
liberando as unidades ribossomais e o RNAm. Em relação às semelhanças 
entre eucariotos e procariotos, temos Código genético universal ( Ambos 
utilizam o mesmo código genético - trincas de nucleotídeos codificam 
aminoácidos específicos), as mesmas etapas da tradução, ribossomos 
(compostos por RNA ribossômico e proteínas) como as estruturas responsáveis 
pela tradução em ambos os domínios, o uso de RNAt O RNA transportador 
(tRNA) carrega os aminoácidos e reconhece códons do mRNA por meio de 
anticódons complementares e fatores de tradução: Ambos os tipos de células 
utilizam proteínas auxiliares para iniciação, elongação e terminação. Em 
relação às diferenças, nos procariotos, a tradução do mRNA ocorre no 
citoplasma e está frequentemente acoplada à transcrição, ou seja, a síntese 
proteica pode começar enquanto o RNA ainda está sendo transcrito. Já nos 
eucariotos, a transcrição ocorre no núcleo, e o mRNA precisa ser processado 
(com adição de cap 5’, cauda poli-A e remoção de íntrons por splicing) e 
transportado para o citoplasma antes que a tradução tenha início, o que 
impede esse acoplamento. Outra diferença importante está na forma como o 
ribossomo identifica o local de início da tradução. Em procariotos, o ribossomo 
reconhece uma sequência específica chamada Shine-Dalgarno, localizada a 
montante do códon de início, que alinha corretamente o mRNA à subunidade 
menor do ribossomo. Já em eucariotos, o ribossomo se liga inicialmente à cap 
5’ do mRNA e escaneia até encontrar o códon de iniciação (geralmente AUG) 
dentro de um contexto chamado sequência de Kozak, que favorece a correta 
iniciação. Além disso, os ribossomos diferem entre os dois grupos: os 
ribossomos procariotos têm coeficiente de sedimentação de 70S, compostos 
por subunidades 30S e 50S, enquanto os ribossomos eucariotos são 
maiores, de 80S, com subunidades 40S e 60S. Outro ponto de distinção é que 
os mRNAs procariotos são frequentemente policistrônicos, ou seja, um 
único mRNA pode codificar diversas proteínas diferentes, cada uma com seu 
próprio códon de iniciação e sequência Shine-Dalgarno. Em contraste, os 
mRNAs eucarióticos são geralmente monocistrônicos, codificando apenas 
uma proteína por molécula de mRNA. 
Q12) A produtividade de um grupo de células animais para uma determinada 
proteína expressa está caindo ao longo do tempo, mas o número de células e a 
viabilidade delas não mudou, o que pode estar acontecendo? 
R: Se a produtividade de uma proteína em um grupo de células animais está 
diminuindo ao longo do tempo, mesmo sem alterações no número ou na 
viabilidade celular, isso indica que o problema provavelmente está relacionado 
à expressão ou ao processamento da proteína, e não à saúde ou quantidade 
das células. Uma das causas mais comuns, especialmente em sistemas de 
expressão recombinante, é o silenciamento epigenético do transgene, o que 
pode ocorrer por metilação do DNA, modificações nas histonas ou rearranjos 
genéticos. Isso leva à redução da expressão da proteína-alvo ao longo do 
tempo. Além disso, se o vetor de expressão não estiver integrado ao genoma 
ou se houver perda da pressão seletiva (como a retirada de antibiótico), pode 
haver perda do transgene pelas células. Outra possibilidade é a queda na 
eficiência da transcrição do mRNA da proteína, que pode ocorrer por 
problemas nos elementos regulatórios do vetor (como promotores e 
enhancers), instabilidade do mRNA ou regulação negativa por microRNAs. 
Mesmo que o mRNA esteja sendo produzido adequadamente, a tradução pode 
ser comprometida por limitação de nutrientes, escassez de tRNAs, ou inibição 
de fatores de iniciação da tradução — por exemplo, a fosforilação da proteína 
eIF2α em resposta a estresse celular pode reduzir a síntese proteica sem 
comprometer a viabilidade celular. Além disso, a proteína pode estar sendo 
sintetizada, mas ser rapidamente degradada por mecanismos intracelulares, 
como o sistema ubiquitina-proteassomo ou a via lisossomal, especialmente se 
houver falhas no enovelamento ou nas modificações pós-traducionais. 
Problemas na secreção da proteína ou acúmulo no retículo endoplasmático 
também podem ativar a chamada resposta ao estresse do RE, que reduz a 
síntese global de proteínas para preservar a homeostase celular. Por fim, é 
importante considerar que células mantidas em cultura por muitas passagens 
podem sofrer alterações epigenéticas ou mudanças no perfil metabólico, 
levando a uma deriva fenotípica que afeta a expressão do gene de interesse. 
Mesmo que a viabilidade celular permaneça alta, alterações no meio de cultura, 
acúmulo de metabólitos tóxicos ou mudanças na composição de nutrientes 
também podem influenciar a expressão proteica. Portanto, a redução da 
produtividade proteica com manutenção da viabilidade celular pode ser 
causada por uma combinação de fatores, incluindo silenciamento gênico, 
instabilidade do mRNA, inibição da tradução, degradação proteica ou 
alterações metabólicas e epigenéticas nas células. A investigação detalhada 
desses processos, por meio de análises como RT-qPCR para expressão 
gênica, Western blot para detecção da proteína, e testes de integridade do 
vetor, é fundamental para identificar a causa do problema. 
 
Q13) Como você faria o processo de produção de um oligopeptídeo não 
glicosilado que forma pontes dissulfetos podendo ser com bactéria ou levedura 
levando em consideração três características: custo-rendimento, 
disponibilidade de fermentadores e quantidade de pessoas a usarem o 
biofármaco produzido. Depois indique o que poderia ser alterado para melhorar 
a expressão, e se algo der errado o que poderia ser feito para corrigir. 
R: Neste processo, idealmente não deve-se utilizar leveduras, pois 
considerando que nossa proteína não é glicosilada, a primeira etapa do 
processo de fermentaçãoque é a glicosilação não poderia ocorrer. Levando 
isto em consideração podemos utilizar bactérias que não realizam glicosilação, 
no entanto estes organismos embora sejam capazes de produzir pontes 
dissulfeto, tendem a gerar este produto de forma insolúvel como corpos de 
oclusão. Isto levaria a um maior custo nas etapas de purificação, o que poderia 
afetar o custo rendimento do método. Não haveria necessidade de 
fermentadores, e a produção seria grande o suficiente pra quantidade de 
pessoas a usarem o fármaco. Considerando que poderia ocorrer a formação de 
corpos de oclusão, podemos realizar pequenas modificações que diminuiriam a 
probabilidade da formação dos mesmos, desde realizar a alteração do meio de 
cultivo diminuindo fontes de carbono, ou mesmo utilizando um promotor de 
menor afinidade. No entanto, no caso de ainda assim estes corpos de oclusão 
serem gerados, poderíamos realizar um tratamento químico para desenovelar e 
depois realizar uma ultrafiltração para renaturar. Porém isto aumentaria o custo 
do método, e levando isto em consideração poderíamos usar esta proteína de 
maneira imobilizada, o que poderia servir como estratégia de redução de custo 
e otimização do método. Além disto, uma maneira simples de resolver seria 
trocando a bactéria utilizada, normalmente utilizamos E.coli por termos mais 
estudos envolvendo a mesma e também por esta se encontrar mais disponivel 
no mercado, no entanto no caso de necessitarmos que em hipotese alguma 
esses corpos de oclusão sejam feitos, trocando a bacteria de E.coli para 
alguma outra, não haveria esta formação, pois este comportamento é exclusivo 
de E.coli. 
Q14) Explique detalhadamente o processo de clonagem. 
R: O processo de clonagem consiste na inserção de fragmentos de DNA em 
moléculas de vetores, como plasmídeos. Os vetores utilizados para a clonagem 
precisam apresentar um gene de resistência, importante para selecionar as 
células que receberam ou não o vetor, uma sequência que é a origem de 
replicação, importante pois, uma vez no interior das células, esses plasmídeos 
podem ser replicados de forma independente no DNA genômico, e uma região 
polylinker, que contém sequências que são reconhecidas pelas chamadas 
endonucleases de restrição, enzimas que vão cortar o DNA a partir do 
reconhecimento de sequências específicas. A molécula do inserto pode ser 
obtida através da técnica de PCR e é digerida com as enzimas de restrição, 
assim como a molécula do vetor. As pontas de ambas moléculas resultantes da 
digestão vão se anelar entre si, gerando então uma molécula de DNA híbrida. 
Uma vez tendo essa molécula, podemos introduzi-la numa bactéria onde 
teremos a amplificação do número dessas moléculas no interior das células. A 
junção das pontas coesivas do vetor e do inserto é dada pela DNA ligase e 
teremos a reconstrução da ligação fosfodiéster. Para a inserção desses sítios 
de enzimas de restrição nos insertos gerados por PCR,teremos que utilizar 
iniciadores (primers), que contém parte da sua sequência que anela 
especificamente no DNA molde e outra parte desse primer contém a sequência 
da enzima que vai ser utilizada (o sítio de restrição é adicionado ao lado da 
sequência inicial do primer na extremidade 5’. Então num primeiro momento, 
teremos um iniciador que tem uma parte anelando no alvo e uma parte que fica 
não anelada e isso serve tanto para o primer foward (à esquerda) quanto para 
o primer reverso (à direita). A partir da amplificação da reação de PCR, 
geraremos um produto dupla fita que contém a esquerda, o sítio de restrição da 
enzima que será utilizada (enzima 1) e a direita um segundo sítio para uma 
segunda enzima (enzima 2). Essas enzimas devem ser escolhidas a partir da 
análise da sequência de interesse. Então, por exemplo, se tivermos uma 
sequência codificante (no DNA) de uma proteína que codifica o sítio de 
restrição de uma enzima X, por exemplo, não poderemos utilizar essa enzima 
no método de clonagem. Isso porque uma vez que quando colocarmos esse 
produto na presença da enzima X, ele vai cortar tanto o local planejado (de 
interesse) quanto o sítio interno (sequência codificante). Então sempre temos 
que escolher enzimas que não estão presentes na sequência do nosso inserto. 
A partir da reação de PCR que gera o inserto contendo as duas enzimas de 
restrição que estão flanqueando a sequência de interesse, vamos então digerir 
o incerto e o vetor com as mesmas enzimas, promovendo a ligação do inserto 
digerido com o vetor digerido, gerando então a molécula de DNA híbrido. Uma 
vez então tendo essa o DNA híbrido, introduziremos em células de bactérias 
através, porexemplo, de um choque térmico. Essa é uma das técnicas (a mais 
simples) da chamada transformação de bactérias que é a introdução de DNA 
exógeno nas células bacterianas. Entretanto, existem outras formas como por 
exemplo, a eletroporação onde essa introdução de DNA exógeno ocorre por 
meio de um choque elétrico. No caso da transformação por choque térmico, 
essas bactérias serão tratadas com soluções salinas normalmente de cátions 
divalentes (ex: Ca2+) e uma vez que as células sejam tratadas com essa 
solução de cálcio (CaCl2), por exemplo, teremos a neutralização da carga 
parcial que normalmente é negativa na superfície das células bacterianas, 
permitindo que a molécula de DNA exógeno que também tem carga parcial 
negativa, consiga se aproximar e interagir com a membrana dessa célula. Uma 
vez tendo esse cenário de interação, vamos colocar essa célula a 42o C por 
uns 2 minutos e, nesse momento, serão gerados microporos na membrana 
dessa célula que permitirão que moléculas de DNA que estejam vizinhas a 
esses poros consigam adentrar a célula. Uma vez que essas células são 
transformadas, elas devem ser planejadas em meio de cultura semissólido de 
forma que cresçam colônias de bactérias. Cada colônia é referente a uma 
célula bacteriana que foi transformada com aquele DNA exógeno que foi 
utilizado. Essas placas contém o antibiótico que será utilizado na seleção das 
células que receberam aquele determinado vetor, de modo que, células que 
receberam o plasmídeo (contém o gene de resistência para o antibiótico) na 
transformação, serão as únicas que conseguirão sobreviver. Todas as outras 
células que não foram transformadas, ou seja, não receberam DNA exógeno, 
vão morrer pela ação do antibiótico. 
 
Q15) Qual a vantagem do cultivo em leveduras? 
R: A vantagem do cultivo em leveduras é que possuem uma genética mais 
simples e bem entendida em relação a eucariotos superiores, se autorreplicam 
em um tempo muito curto, tem produtividade alta, não apresentam LPS 
(toxicidade), são apresentam risco de contaminação viral pois vírus de levedura 
não infectam humanos, apresentam capacidade de expressão extracelular 
(proteína produzida é endereçada para a via exocitica), o meio de cultura 
utilizado é semelhante ao de procariotos e são capazes de realizar glicosilação. 
Q16) Qual a diferença de vetor de clonagem x vetor de expressão e quais 
seriam as técnicas de melhoria de rendimento? 
R: Vetor de clonagem é utilizado para amplificar uma sequência de DNA de 
interesse. Possui como elementos um gene de resistência, um sítio múltiplo de 
clonagem e uma origem de replicação. O vetor de expressão é utilizado para 
expressar a proteína de interesse. Além dos elementos do vetor de clonagem, 
possui um produtor forte, sequências de início e término da transcrição, 
sequências de início e término da tradução e códons de parada. Para a 
melhoria de rendimento, usa-se técnicas como adição de proteínas de fusão 
(melhoram a solubilidade da ptn) e de caudas N ou C-terminais (facilitam o 
processo de purificação), uso de peptídeo sinalizador da via exocítica, que 
facilta tb o o processo de purificação e a otimização de códons, que consiste na 
troca de códons raros não codificados por bactérias por códons que não sejam 
raros.Q17) Sobre um processo de clonagem a partir de uma proteína recombinante 
ultrapurificada, com a proteína pronta, como seria feita a formação do anticorpo 
a partir dessa proteína? 
R: Será incluído um cDNA do RNAm codificante da proteína de interesse, em 
um vetor de expressão, este vetor de expressão é inserido numa célula animal, 
por exemplo uma célula CHO. Depois da expressão da proteína realizada pela 
célula CHO, deve-se realizar as etapas de purificação que podem ser 
inicialmente através de uma cromatografia de afinidade a Ptn A, depois por 
etapas consecutivas cromatográficas convencionais como por exemplo de 
troca iônica. 
Q18) Questão querendo transformar RNAm de eucarioto em bicistronico 
(aquela parada de elemento IRES) 
 R: O RNAm de eucarioto é monocistrônico, isto quer dizer que o RNAm só 
possui uma informação. Isto ocorre porque a primeira etapa do processo é CAP 
dependente porque o CAP e a cauda poliA indicam um RNAm maduro para o 
ribossomo. Porém, para se adicionar qualquer informação a mais no RNAm 
necessita-se utilizar o elemento AIRES, que é um elemento interno de 
reconhecimento, que faz com que haja tradução de informações que não 
possuem capeamento e cauda poliA. Ou seja, neste caso conseguimos 
sintetizar uma proteína que contém as duas informações que precisamos, 
sendo 1 pelo cap dependente e 1 pelo elemento AIRES. (Exemplo: anticorpos 
monoclonais). 
Q19) Tinha que analisar um experimento e falar qual benefício de adicionar 
cauda de histidina N terminal (alguma coisa sobre purificação e tals) 
R: O benefício de adicionar cauda de histidina N terminal é facilitar o processo 
de purificação, visto que a cauda N-terminal possui coluna de purificação 
conhecida. Como exemplo, tem-se a adição de moléculas de histidina, que é 
purificada em coluna de níquel, ou inserção de biotina, que é purificada em 
coluna de estreptavidina. 
*Q20) Descrever as etapas laboratoriais e industriais de meio de cultivo, tipos 
de reatores e modos de operação. 
R: Em ambientes laboratoriais, o cultivo de células animais envolve condições 
controladas, como pH e nutrientes, uso de antibióticos e soro animal, e pode 
empregar células normais ou transformadas, como células HeLa (derivadas de 
tumores pois são células “imortais”). A adesão celular pode ser um requisito, 
exigindo técnicas como o uso de enzimas para células aderentes. 
Já em escala industrial, o cultivo ocorre em biorreatores, evitando antibióticos e 
soro animal devido a impurezas e variações. São utilizadas células 
estabelecidas, como SP2 e CHO, pela estabilidade genética, e há uma 
preferência por células em suspensão para facilitar o processo em larga escala. 
Aspectos éticos e padrões de qualidade são rigorosamente considerados para 
garantir a produção consistente de produtos biotecnológicos. 
Em resumo, enquanto os cultivos em escala laboratorial permitem a 
flexibilidade e experimentação, a escala industrial exige precisão, eficiência e 
conformidade rigorosa com regulamentações para garantir a produção segura 
e consistente de produtos biotecnológicos. 
Os reatores podem ser homogêneos ou heterogêneos. Nos reatores 
homogêneos, o meio e a célula de cultura ficam no mesmo ambiente. Eles 
podem ser airlift, de ondas e tanque agitado. Nos biorreatores heterogêneos, a 
célula e o meio de cultura ficam separados. Podem ser de leito empacotado, 
fluidizado ou de fibras ocas. 
Tanque Agitado (Stirred-Tank Reactor – STR) 
 O mais utilizado na indústria. 
 Mistura por agitação mecânica com impelidores. 
 Adequado para células em suspensão (ex: CHO). 
 Controle eficiente de pH, O₂ e temperatura. 
 Pode ser operado em modo batch, fed-batch ou contínuo. 
Air-Lift 
 Mistura por circulação de gases (sem partes móveis internas). 
 Menor cisalhamento (mais suave para células sensíveis). 
 Ideal para células suspensas. 
 Biorreator de Ondas (Wave Bioreactor) 
 Saco plástico descartável balançado por uma plataforma oscilante. 
 Usado com microcarreadores ou células em suspensão. 
 Baixo volume, alta flexibilidade, ideal para processos iniciais. 
 Leito Empacotado (Packed-Bed) 
 Substrato sólido preenchido com células aderentes. 
 O meio circula lentamente pelo leito. 
 Usado para células que necessitam de fixação (ex: Vero). 
Leito Fluidizado 
 Similar ao leito empacotado, mas com circulação que movimenta o leito. 
 Melhor troca de nutrientes e gases. 
 Aumenta a densidade celular. 
 Fibras Ocas (Hollow Fiber) 
 Feixes de fibras porosas onde as células crescem externamente ou 
internamente. 
 Alta densidade celular e separação eficiente de produto. 
 Baixo cisalhamento. 
 
Modos de operação: 
Batelada (batch): meio, células e nutrientes adicionados no início, sem 
adições posteriores. 
Batelada alimentada (fed-batch): nutrientes adicionados ao longo do tempo; 
maior controle de crescimento e produtividade. 
 Contínuo (perfusion): meio fresco entra continuamente, enquanto células 
e/ou produto são colhidos; maior produtividade, ideal para produtos sensíveis.