Pipetagem aula

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UFRGS – ICBS – DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
CBS01 031 – BIOQUÍMICA I – FARMÁCIA 
 
 
 NOÇÕES BÁSICAS DE PIPETAGEM 
 
 
1 – INTRODUÇÃO 
 
A execução exata e cuidadosa da pipetagem é essencial para uma correta medida de 
volume e dela depende o sucesso de qualquer avaliação quantitativa. Mas para que isto 
ocorra é necessário conhecer o instrumento a ser usado. 
 As pipetas permitem a transferência de volumes líquidos com precisão de um 
recipiente a outro. São tubos de vidro adequadamente calibrados para este fim. Ao se 
executar a pipetagem (transferência de líquido), normalmente uma determinada quantidade 
de líquido permanece na ponta da pipeta. Se a pipeta for de for da categoria TD (total 
delivery) nunca deve ser soprada; se for da categoria TC (total content) deve ser 
sobrada, para expulsar todo o líquido nela contido. 
Existem dois tipos clássicos de pipetas: pipetas volumétricas, que fornecem volume 
constante e fixo (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20mL; etc); e as pipetas graduadas, que 
possuem uma escala para medir volumes variáveis. Estas escalas podem ser decimais, 
centesimais ou milesimais. Por exemplo: um pipeta de 1 mL pode ser graduada 1/10 ou 
1/100. Isto significa, que é possível transferir volumes de 0,1 mL ou 0,6 mL, p.ex., nas 
pipetas com graduação 1/10 ou volumes de 0,14 mL ou 0,67 mL p. ex. nas pipetas com 
graduação 1/100 (figura 1). 
 
 Figura 1: pipetas de vidro graduação 1/10 e 1/100 
 
Um outro tipo de pipeta, usado especialmente em laboratórios de Bioquímica ou 
quando há a necessidade de se transferir volumes muito reduzidos, na ordem de 
microlitros, é a micropipeta. Antigamente o modelo era do tipo volumétrico, denominada 
de Lambda (microlitro). Existiam de vários volumes: 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200 
e 500 λ e cuja aspiração era realizada com uma fina mangeira de látex. Atualmente, existe 
a micropippeta automática. Este tipo de pipeta utiliza pontas ponteiras descartáveis, feitas 
de polipropileno (figura2). Estas podem ser de volume fixo ou volume ajustável (ex: 
P1000� volume vai até 100 µl, P1000� volume pode ser ajustado até 1000µl (1ml)). O 
líquido aspirado por elas não deve entrar no corpo principal da micropipeta, sob risco 
de adulterá-la e descalibrá-la. Para a biologia molecular, são utilizadas ponteiras com um 
filtro de polipropileno para não haver uma contaminação da micropipeta. 
 
 
 Conjunto de pipetas monocanais volume ajustável (cor � intervalo de volume) Ponteiras 
 
Figura 2: Pipetas automáticas volume ajustável 
 
 
 
 
A micropipeta pode ser manual ou electronica (figura 3). A maioria das micropipetas 
são monocanais mas também existem micropipetas multicanais de 8 e 12 canais (figura 3). 
 
 
 
 Pipeta eletrônica 8 canais 12 canais 
 Pipetas multicanais 
 
Figura 3: Pipetas eletrônica e multicanal 
 
2 – TÉCNICA BÁSICA DE PIPETAGEM 
 
 2.1 Pipetas de vidro 
A superfície de um líquido transparente confinado num tubo estreito exibe uma 
curvatura marcante, chamado de menisco (figura 4). Utiliza-se a parte inferior do 
menisco como ponto de referência na calibração e no uso de equipamento volumétrico 
(pipetas, buretas, provetas). Este ponto mínimo é melhor visualizado segurando-se um 
cartão de papel opaco atrás da coluna graduada. No caso de líquidos opacos, nos quais a 
curvatura do menisco não é visível, é usado como referência o bordo superior do menisco. 
 
 
 
 
Figura 4: Ajuste do volume � Pipetas de vidro líquidos transparentes (A e B) líquido 
opaco (C) 
 
 
Erro de paralaxe 
Ao ler o volume, seu olho deve estar no nível da superfície do líquido para assim 
evitar um erro devido à paralaxe. O erro de Paralaxe é um fenômeno que pode provocar 
uma leitura: 
(a) do volume menor que seu valor real se o menisco for olhado por cima da superfície e 
(b) do volume maior se o menisco for olhado abaixo da superfície do líquido (figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A- Posição dos olhos B- Erro de Paralaxe 
 
Figura 5: Erro de Paralaxe 
 
 
 menisco� (24,3 ml) líquido opaco 
 menisco���� 2 ml 
 
 A B C 
 Para o uso de pipeta recomenda-se usar uma pera de aspiração (figura 6), mais comum a 
de borracha e proceder da seguinte maneira: 
 
 
 
Figura 6: Peras de Aspiração 
 
 
(1) Segurar a pipeta entre o polegar e os três últimos dedos da mão (figura7). 
Colocar a pêra na extremidade superior da pipeta, (cuidado para não 
tocar a ponta da pipeta com as mãos), retirar o ar através da válvula de 
expulsão de ar A pressionando a válvula e simultaneamente o balão de 
borracha B (figura 8). 
 
Figura 7: Posição correta para segurar pipeta 
 
 
 
Figura 8: Uso da pera de borracha 
 
 
 
A: expulsão de ar 
 
 
 B: balão de borracha 
 
 
 
 
 E: dispensação de líquido 
 S: aspiração de líquido 
Colocar a ponta da pipeta (parte inferior) no líquido (bem abaixo da 
superfície) (figura 9), aspirar pressionando a válvula de aspiração S 
(figura 8), cuidadosamente até que a coluna do líquido esteja um pouco 
acima da marca superior (do zero); 
(2) Retirar a pipeta do frasco, remover o líquido que ficou na parede externa da 
pipeta, através de movimentos circulares na parte superior do frasco de 
onde foi retirado o líquido; 
(3) Acertar o zero: escorrer a coluna de líquido até o menisco atingir a marca 
superior, pressionando a válvula de dispersão de líquido E (figura 8). 
IMPORTANTE: manter a pipeta em posição vertical e a marca (zero) ao 
nível dos olhos; completar a remoção do líquido aderido à parede externa 
da pipeta, passando um lenço de papel na parede com o cuidado de não 
tocar na ponta da pipeta evitando a absorção do líquido; 
(4) Eluição do volume desejado: colocar a ponta da pipeta junto à parede 
interna do tubo ou frasco receptor inclinados, deixar escoar lentamente o 
conteúdo da pipeta até o volume desejado, pressionando a válvula de 
dispensação E. No caso de pipetagem por diferença o escoamento 
prossegue até o nível dolíquido atingir (parte inferior do menisco) a 
marca do volume desejado. IMPORTANTE: manter a pipeta em posição 
vertical e a marca do volume desejado ao nível dos olhos para evitar o 
erro de paralaxe (ver acima) (figuras 5 e 9) 
 
 
 
ASPIRAR
LIMPAR
ELUIR 
PIPETAGEM – PIPETA
DE VIDRO
 
 
Figura 9: Técnica de pipetagem � pipeta de vidro 
 
 
 
 
 
2.2 Micropipetas automáticas manuais 
 Micropipetas manuais liberam volumes ajustáveis de líquidos da ordem de microlitros 
(µL). Com estas pipetas, um volume conhecido e ajustável de ar é deslocado da ponteira 
descartável de plástico pressionando-se o botão no topo da pipeta. 
 
(1) Escolher a pipeta e a ponteira de acordo com o volume a ser pipetado (figura 
10A, 10B, figura 10C) e colocar a ponteira na pipeta (figura 11) 
 
 
Figura 10: Escolhida a micropipeta, ajustar seu volume (A), colocar ponteiraadequada (B, C). 
 
 
, 
 
 Figura 11: Colocação da ponteira 
 
 
Encaixar ponteira 
Firmar 
Retirar do
suporte 
 
Pipetar 
(2) Ajustar o volume a ser pipetado através do giro da parte superior da pipeta até 
a marca desejada de volume (figura 10). IMPORTANTE: identificar os dois 
estágios (figura 12). 
 
 
Figura 12: Estágios do pistão 
 
(3) Aspirar o volume desejado: Pressionar o botão superior, este opera um pistão 
que força o ar para fora da pipeta, até o primeiro estágio Com o botão 
pressionado, inserir a ponteira de plástico no líquido a ser pipetado, liberar a 
pressão do botão, fazendo com que o líquido preencha a ponteira. 
IMPORTANTE: aspirar lentamente para não formar bolhas no líquido, em 
especial, na ponta da ponteira. Retirar a ponteira do líquido, encostá-la na 
parede do frasco e com movimentos circulares, retirar o excesso de líquido da 
parte externa da ponteira (figura 13). 
(4) Eluição do líquido: colocar a pipeta no tubo para onde será transferido o 
líquido, cuidando que a ponteira não toque no fundo ou no líquido que já 
estava no tubo (volumes pequenos < 500µL) ou encostar a ponteira na parede 
do tubo (volumes > 500µL); pressionar o botão até o fim (primeiro estágio) e, 
após um tempo de 2 segundos, o botão é pressionado até uma segunda posição 
(segundo estágio), o qual esvazia completamente a ponteira (figura 13) 
 
 
 Figura 13: Técnica de pipetagem � pipetas automáticas 
 
(5) Retirar a pipeta do tubo e descartar a ponteira (figura14). 
 
 
 A B C 
 Figura 14: Vários procedimentos 
A-Resumo do procedimento B-Descarte de ponteiras C-Frasco descarte de ponteiras