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Sexagem de sêmen
A utilização do sêmen sexado permite a liberdade para escolher o sexo do produto e
definir or rumos do negócio; incrementar a intensidade de seleção, acelerando o
melhoramento genético do rebanho; acelerar a taxa de crescimento do rebanho; aumentar a
quantidade de animais disponíveis para comercialização; realizar a reposição interna do
rebanho com qualidade genética e segurança sanitária; e otimizar as características genéticas
desejadas do sexo escolhido.
Macroscopicamente, não há nenhuma diferença morfológica entre os
espermatozóides X e Y, mas há diferença no conteúdo de DNA (o X tem 4% mais DNA na
espécie bovina) e na densidade (o X tem maior densidade, sendo uma diferença de 0,06%*¹).
Essa diferença de densidade permite a separação dos espermatozóide X e Y por centrifugação
em gradiente de albumina, de percoll (acuidade de até 75%, mas apenas 25% de taxa de
recuperação) ou de iodixanol; porém, a água e os lipídeos contidos na cabeça dos
espermatozóides podem mascarar a diferença de densidade, fazendo com que a eficiência da
separação não seja tão boa. Também é possível fazer a sexagem por coloração, sendo que o X
cora mais que o Y.
*¹ Essa diferença é maior em taurinos do que em zebuínos.
SEXAGEM POR DIFERENÇA DE DENSIDADE
O sêmen é colocado em um tubo com gradientes de fase em gel e, após a
centrifugação, os espermatozóides defeituosos ficam agarrados no gel mais superficial e, na
fase baixa, células íntegras, sendo o Y mais superficial que o X. No entanto, essa técnica é
pouco utilizada no comércio de sêmen para inseminação artificial, sendo mais utilizada em
laboratórios de fertilização in vitro (FIV) com objetivo de limpar o sêmen (retirar as células
defeituosas).
SEXAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO
É a técnica mais utilizada no mercado de sêmen para inseminação artificial, que se
baseia nas diferenças no conteúdo de DNA. As etapas da técnica são as seguintes:
- Coloração com Hoechst 33342 e incubação por 45 minutos (antes de entrar no
citômetro).
- Entra no citômetro, onde o cristal ondula e quebra a corrente em microgotas
(cada célula em uma microgota, sendo que passam, aproximadamente, 90.000
microgotas por segundo no aparelho).
- O raio laser incide luz ultravioleta sobre os espermatozóides.
- Os espermatozóides X fluorescem com 4% mais intensidade que os Y, que é
justamente a diferença de DNA de uma célula feminina para uma masculina.
- O computador analisa a fluorescência e faz a separação como X, Y e
duvidosos.
- Aplica-se carga negativa ou positiva ou nenhuma nas microgotas.
- As microgotas carregadas são desviadas pelas placas continuamente
polarizadas.
- As amostras são separadas em tubos já contendo gema de ovo, os quais serão
refrigerados a 4ºC e, posteriormente, congelados.
OBS: O sêmen coletado em uma central é enviado para as empresas de sexagem em caixas de
isopor com 1 (17°C) ou 2 gelos (4°C) e bastante antibiótico para controlar o crescimento
bacteriano. A própria central manda o meio, que deve ser adicionado à temperatura ambiente
ao sêmen.
Adiciona-se um corante vermelho antes das células entrarem na máquina para
atrapalhar a fluorescência daquelas que estão com a membrana danificada (absorvem o
corante). Logo, além da sexagem, o citômetro também permite a seleção de células íntegras,
já que aquelas que não recebem carga (fluorescência mais baixa devido ao rompimento de
membrana, por exemplo) são descartadas.
Quanto maior a rachadura no meio das colunas verdes que aparecem no computador,
melhor, pois significa que as células X e Y são bastante diferentes. Isso é uma característica
que varia conforme a espécie, a raça e o indivíduo.
Os tubos são colocados dentro de um recipiente, que vai para o refrigerador. Como
as amostra presentes nos tubos estão muito diluídas, necessitam de, no mínimo, 4h de
refrigeração, com posterior centrifugação para concentrar. Após a centrifugação, há formação
de pellets, que devem ser rediluídos, envasados em palhetas de cores diferentes*² e
congelados. A concentração final é menor que a palheta de sêmen não sexado.
*² SexedUltra 4.0M: 4 milhões de células nas palhetas (light pink para fêmeas e light blue
para machos); ou SexedUltra 2.1M: 2,1 milhões de células nas palhetas (pastel red e pastel
blue). As palhetas amarelas são utilizadas para animais superovuladas.
Por exigências do MAPA, deve-se fazer o controle da qualidade do sêmen sexado
avaliando o volume da dose, o número de espermatozóide, a motilidade progressiva, o vigor,
os defeitos totais e os defeitos maiores. Também é importante fazer exames complementares,
como virologia, bacteriologia, acrossomos intactos, TTR (37ºC, 3h) e pureza. Para analisar a
pureza da amostra, deve-se colocar um dos tubos para passar no citômetro novamente e
avaliar quantas células do sexo oposto estavam presentes naquela amostra, dando o resultado
em porcentagem. O armazenamento é igual ao do sêmen convencional, assim como o
controle de qualidade e os exames pós-descongelação.
UTILIZAÇÃO DO PRODUTO
1. INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA)
Deve ser utilizado somente em novilhas ou em vacas com histórico reprodutivo
excelente, evitando o uso em repasses naqueles animais com 2, 3 ou mais serviços. Deve-se
utilizar, preferencialmente, em rebanhos com adequado manejo nutricional, alimentar e
sanitário, e também em animais que não estejam sofrendo qualquer tipo e estresse
(ambiental, social e/ou diverso). O descongelamento do sêmen sexado é o mesmo adotado
para o sêmen convencional, sendo o ideal utilizar o descongelador automático.
Alguns cuidados que devem ser tomados:
- Não levantar a caneca acima da linha de congelamento do botijão.
- Manusear as palhetas com pinça.
- Descongelar a 35ºC por, no mínimo, 20 segundos.
- Corte reto da palheta.
- Cuidado ao montar o aplicador (palheta fina).
- Observar o cio 2 vezes ao dia por 30 minutos cada período (manhã e tarde).
- Inseminar 12h após a manifestação de cio (bovinos).
- Utilizar somente inseminadores capacitados.
- Utilizar em propriedades com excelente prática de manejo de inseminação
artificial.
OBS: Não se deve comparar os resultados do sêmen convencional com o sêmen sexado.
Pode-se comparar o sêmen sexado e o convencional de um mesmo ejaculado.
2. INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF)
A literatura não recomenda o uso em inseminação artificial em tempo fixo (IATF),
nem mesmo em fêmeas que utilizaram hormônio para tratamento de fertilidade, pois a taxa
de concepção é menor do que a IATF com sêmen convencional. Porém, o nascimento de
uma porcentagem maior de animais do sexo requerido compensam (a tecnologia da sexagem
permite uma expectativa média de nascimento de 85-90% do sexo escolhido).
3. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO (TE)
4. FERTILIZAÇÃO IN VITRO (FIV)
Deve-se consultar antecipadamente o laboratório sobre os resultados com o uso de
sêmen sexado e adotar um protocolo específico, sendo uma dose a cada 100 oócitos em
média. Foi observado que o processo de sexagem por citometria de fluxo afeta algumas
características das células espermáticas, mas não afeta sua capacidade de produzir embriões
in vitro.
SEXAGEM REVERSA
É a sexagem do sêmen previamente congelado oriundo de um animal indisponível
(já morreu). O sêmen deve ser utilizado imediatamente após a sexagem: refrigera e
encaminha para as centrais de FIV.
IMUNO SEXAGEM
São produzidos anticorpos monoclonais contra antígenos de superfície das
células X e Y. O processo é mais rápido porque não separa as células mortas ou danificadas,
o que também é uma desvantagem, pois essas células vão junto com as células íntegras para o
congelamento.