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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/266141405 BIOTECNICAS REPRODUTIVAS NA FEMEA BOVINA Conference Paper · January 2013 DOI: 10.13140/2.1.4911.2325 CITATIONS 0 READS 15,654 4 authors, including: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: Statistical methods for reproductive evaluation in bulls and stallions View project Animal reproduction View project Carolina Rodriguez Jimenez University of São Paulo 46 PUBLICATIONS 102 CITATIONS SEE PROFILE Erly Luisana Carrascal-Triana Agrosavia 31 PUBLICATIONS 115 CITATIONS SEE PROFILE Jurandy Mauro Penitente-Filho 112 PUBLICATIONS 237 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Carolina Rodriguez Jimenez on 27 September 2014. 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Isto sem contar que os animais chegam a passar metade de suas vidas prenhes. Fica claro, que menos de 0.1 % dos folículos chegam a ovular, Portanto, com o incentivo de aproveitar essa porcentagem oócitario que naturalmente sofre atresia (morte celular programada) tem se procurado potencializar o aproveitamento do material genético dos seus melhores animais domésticos, no intuito de obter descendentes com características semelhantes ou melhores do que as dos seus genitores. Dentre as biotecnologias utilizadas com maior frequência na produção animal, destacam-se a inseminação artificial, a transferência de embriões e a fecundação in vitro. Além dessas, existem técnicas que apresentam boas perspectivas para aplicação em larga escala no futuro, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA), a transgênese e a clonagem. Sendo assim, a presente revisão fara um levantamento das diferentes biotecnicas reprodutivas, implementadas na fêmea bovina. INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL HISTORIA Segundo a lenda, a inseminação artificial (IA) foi utilizada pela primeira vez no ano de 1332, em eqüinos, pelos árabes. Mas a história registra como marco inicial da inseminação artificial o ano de 1784, quando o monge italiano de nome Lázaro Spallanzani demonstrou pela primeira vez ser possível a fecundação de uma fêmea sem o contato com o macho. Para tanto, ele coletou sêmen de um cachorro através da excitação mecânica e aplicou em uma cadela no cio, a qual veio a parir três filhotes 62 dias mais tarde. Era o nascimento de uma técnica que iria revolucionar o campo da reprodução animal. No ano de 1949, Polge, Smith e Parker, pesquisadores ingleses, demonstraram que o espermatozóide podia ser conservado por um longo tempo a baixas temperaturas. Até então o sêmen era conservado refrigerado à temperatura de 5ºC, possibilitando aos espermatozoides sobrevida de 96 horas. Esta descoberta permitiu a sua conservação indefinidamente, dando maior difusão à inseminação artificial. Atualmente muitos países inseminam quase a totalidade de seus rebanhos bovinos. Calcula‐se que mais de 106 milhões de fêmeas sejam anualmente inseminadas em todo o mundo. No Brasil, segundo estimativas aproximadas apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas. A primeira inseminação que se tem notícia no Brasil data‐se de 1940, porém comercialmente a técnica somentealcançou impulso a partir de 1970, quando nasceram as primeiras empresas especializadas no ramo. A ASBIA – Associação Brasileira de Inseminação Artificial ‐ é uma entidade sem fins lucrativos, fundada em 26 de novembro de 1974, que congrega as empresas que se dedicam ao fomento da Inseminação Artificial, distribuição de sêmen, materiais, equipamentos e outros produtos ligados à reprodução animal. APLICAÇÕES A IA apresenta uma seria de vantagens consideráveis, tanto de ordem sanitária quanto de ordem zootécnica e econômica. Com consequente reflexo sobre o melhoramento genético e a produção animal. As principais aplicações e vantagens da IA encontram-se descritas a seguir: 2 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Melhoramento do rebanho em menor tempo e a um baixo custo através da utilização de sêmen de reprodutores comprovadamente provados superiores para a produção de carne. Controle da transmissão de doenças infectocontagiosas, frequentemente o touro pode transmitir às vacas algumas doenças e vice-versa, o que pelo processo da inseminação artificial não ocorre quando o sêmen é adquirido de empresas idôneas. Cruzamento entre raças: a inseminação artificial permite ao criador cruzar suas fêmeas zebuinas com touros taurinos e vice-versa, o que muitas vezes é dificultado na monta natural pela baixa resistência dos touros europeus a um ambiente desfavorável. Prevenção de acidentes com a vaca: muitos acidentes podem ocorrer durante a cobertura de uma vaca por um touro muito pesado. Prevenção de acidentes com o funcionário: a inseminação artificial evita acidentes com o pessoal, que são comuns quando se trabalha com animais de temperamento agressivo. Uso de touros incapacitados para monta: touros com problemas adquiridos e impossibilitados de efetuarem a monta, em razão de idade avançada, afecções nos cascos, fraturas, aderência de pênis, artroses, e outros impedimentos, poderão ser utilizados na inseminação artificial. Aumento do número de descendentes de um reprodutor: Sabe-se que um touro cobre anualmente, a campo, cerca de 30 vacas. Em regime de monta controlada pode servir a um máximo de 100 fêmeas, anualmente. Isso significa que, considerando 4 anos a vida reprodutiva de um touro, teremos um total de 120 a 400 filhos por animal, durante sua vida útil. Com a inseminação esse número é extraordinariamente aumentado, podendo um reprodutor ter mais de 100.000 filhos. Assim, fica fácil entender como a inseminação favorece o melhoramento do rebanho, pois esses touros superiores estão sendo usados em vários rebanhos, no país e mesmo no exterior com grande número de filhos nascidos. Controle zootécnico do rebanho: Através da IA e utilização de fichas de controle é possível a obtenção de dados precisos de fecundação e parto, facilitando a seleção dos melhores animais do rebanho. Padronização do rebanho: Utilizando-se poucos reprodutores em um grande número de vacas obtém-se homogeneidade dos lotes. Uso de touros após a morte: Com a possibilidade de congelamento e estocagem do sêmen é possível utilizar-se o sêmen de reprodutores após seu falecimento. TÉCNICA A IA consiste no conjunto de eventos que acontecem desde a colheita do sêmen, sua análise e processamento em laboratório, a manutenção por períodos variáveis em condições extracorpóreas, incluindo sua diluição, refrigeração e congelação até a sua introdução no trato genital de uma fêmea por meio de recursos artificiais. Touros para I.A. Antes de se pensar em processamento e congelamento de sêmen é necessário selecionar os touros que irão fornecer esse material genético. Na seleção de machos doadores de sêmen deve- se levar em conta os seguintes aspectos: Zootécnicos Animais doadores devem ser testados antes de entrarem para um programa de inseminação artificial. O teste de performance faz parte do exame fenotípico para a escolha dos reprodutores, levando-se em consideração o desempenho obtido no exercício de suas funções econômicas. Outro aspecto zootécnico para a escolha dos reprodutores pode ser avaliado pelo teste de progênie: o conhecimento da descendência de um reprodutor tem mais valor do que o exame de 3 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina sua genealogia. Seus produtos devem ser apreciados e avaliados sob todos os pontos de vista, comparativamente com a progênie de outros reprodutores. Sanitários Os touros selecionados devem ser livres de doenças infecto-contagiosas, devendo ser submetidos a provas/ testes de diagnósticos que constam: tuberculose; leptospirose, brucelose, IBR, BVD; tricomoníase e campilobacteriose. Nutricional A alimentação tem um efeito notável sobre o padrão de desenvolvimento sexual em todos os animais domésticos, em especial os bovinos. Quando a ingestão de energia é restrita, o desenvolvimento testicular diminui e a produção espermática pode ser reduzida. Deficiências prolongadas de nutrientes essenciais podem provocar infertildade. Por outro lado, uma alimentação excessiva e supérflua pode tornar os reprodutores obesos e indolentes, e também nesse caso, com reflexo negativo nas taxas reprodutivas do animal. Idade Preconiza-se o uso de touros europeus para coleta de sêmen com idade igual ou superior a 18 meses, e reprodutores zebuínos com idade em torno de 24 meses. Examen Andrologico Deve-se realizar minucioso exame andrológico, que pode ser dividido em: Externo: inspeção e palpação de prepúcio, pênis, escroto e testículos. Nessa fase do exame andrológico deve-se avaliar a motilidade, mobilidade, consistência, tamanho e simetria dos órgãos reprodutivos, bem como estabelecer correlação entre tamanho dos órgãos e idade dos animais. Interno: direto (palpação retal) ou indireto (ultrassonografia). Avalia-se nessa etapa as ampolas dos canais deferentes, as glândulas vesiculares e próstata. Espermiograma: avaliar características físicas e morfológicas do ejaculado e viabilidade dos espermatozóides. Além do exame andrológico, os aspectos reprodutivos de um touro candidato ao programa de coleta de sêmen devem ser avaliados por meio de testes de comportamento sexual, determinando-se com esses a libido e a capacidade reprodutiva dos animais. Sêmem Fresco Ou Congelado Pode-se utilizar sêmen fresco ou resfriado (sêmen acrescido de diluidores a temperatura de 5ºC). No entanto, esse material espermático apresenta baixa viabilidade ambiental, tendo uma motilidade espermática decrescente com o passar das horas, acarretando dessa forma, resultados reprodutivos inferiores em comparação ao sêmen congelado. O uso de sêmen fresco ou resfriado está restrito a pequenas propriedades onde o sêmen é colhido de um touro presente em suas dependências para inseminação, já que a baixa viabilidade ambiental não permite o transporte desse material genético por longas distâncias. O congelamento de sêmen bovino é hoje uma técnica bem conhecida e de fácil execução, o que tornou viável esse tipo de processamento e impulsionou as taxas de ganho genético do rebanho bovino mundial. 4 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Fêmeas Para IA Fêmeas destinadas à estação reprodutiva devem apresentar boa condição corporal, estarem ciclando normalmente, e em boas condições sanitárias e livres de doenças infecto-contagiosas. A seguir seguem alguns itens importantes para ter presentes. Nutrição Os efeitos nutricionais são os principais fatores controladores do anestro após o parto, que representa o principal problema reprodutivo do rebanho bovino nacional. Na implementação da IA o peso e a condição corporal, são indicadores funcionais do desempenho reprodutivo. Assim, a monitoração da condição corporal é a melhor maneira de avaliar o estado nutricional dos bovinos e é consideradao melhor indicador do funcionamento fisiológico normal de todos os sistemas orgânicos. Precocidade Outra variável fundamental para a implementação da IA é a seleção criteriosa das características de precocidade sexual e habilidade materna. Essas observações passam despercebidas pela maioria dos criadores, no entanto estão altamente correlacionadas com maior eficiência reprodutiva dos rebanhos. Estação de monta As fêmeas devem ser selecionadas antes do início da estação reprodutiva, para a formação dos lotes. A adoção de um período restrito para o acasalamento dos animais é a maneira mais racional de conduzir o sistema de cria, pois permite a avaliação sistemática do desempenho reprodutivo, oferecendo oportunidades para a tomada de decisões, inclusive a realização dos descartes e boa implementação da IA. Observação de cio Antes da IA deve-se verificar se a vaca está no cio, sendo que essa verificação é de extrema importância para o sucesso do procedimento. São recomendadas duas observações ao dia, uma no início da manhã e outra no final da tarde, por um período de 60 minutos, no mínimo. Identifica-se o cio através da aceitação da monta de outros animais. É comum utilizar rufiões para esta identificação, com ou sem bucal marcador (marcando com tinta a fêmea que deixou ser montada). As vacas que estiverem no cio devem ser identificadas e, no final deste, deve ser realizada a inseminação, utilizando um método prático que é: vacas que apresentam cio pela manhã, devem ser inseminadas na tarde do mesmo dia; vacas que apresentam cio a tarde, devem ser inseminada na manhã seguinte (recomenda-se intervalo de 12 horas). Figura 1. Kit de inseminação artificial. (1) Caixa metálica para guardar todo o material (2) Aplicador de Sêmen Universal Nacional (3) Pacote de Bainha Francesa com 50 unidades (4) Cortador de Palhetas (5) Caixa de Luvas de cano longo com 100 unidades (6) Pinça de 18 centímetros para retirar sêmen do botijão (7) Termômetro digital tipo cartão (8) Adicionais. 5 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Inseminacao artificial a tempo fixo (IATF) A otimização e a racionalização dos recursos disponíveis em propriedades que usam a inseminação artificial (instalações, mão-de-obra, alimentação) pode ser alcançada com a adoção da técnica da sincronização de cios, pois esta reduz o tempo e a mão-de-obra envolvida no processo. A sincronização de cios é, portanto, uma técnica alternativa de manejo reprodutivo, que oferece a possibilidade de manipulação do ciclo estral das fêmeas para indução da ovulação e estro, em parte delas, dentro de um período pré-determinado. Necessita de planejamento prévio, requer insumos, e a chave do sucesso depende dos animais estarem ciclando. Necessita também de um plano nutricional adequado, rebanho saudável, mínimo de condições estressantes, inseminadores devidamente treinados, sêmen de boa qualidade, adequado sistema de apontamentos e controle e acompanhamento de todo o procedimento. Vários protocolos estão disponíveis no comércio sob a forma de progestágenos, estrógenos e prostaglandinas F2ɑαα e seus análogos, bem como suas combinações. A escolha do método e a opção para adoção devem considerar a eficiência fisiológica e a relação benefício:custo. Figura 2. Esquema para a inseminação artificial em fêmeas bovinas. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES Importância A Transferência de embriões (TE) é uma biotécnica mundialmente difundida e sua importância básica para a produção animal consiste na possibilidade de uma fêmea produzir um número de descendentes muito superiores ao que seria possível obter fisiologicamente durante sua vida reprodutiva. Além de contribuir para ampliar os conhecimentos de fisiologia, patologia e endocrinologia decorrentes da relação entre embrião, órgãos genitais internos e sistema nervoso central, equaciona os problemas relativos a ordem genética e sanitária. 6 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Figura 3. Método da transferência de embriões em bovinos. Controle zootécnico O controle zootécnico é um fator de grande importância e que necessita de uma criteriosa avaliação durante a seleção das fêmeas doadoras, devido à influência que exercerão sobre as próximas gerações. Sendo assim, independentes da raça, os animais doadores devem ser portadores de pedigree e com registro nas respectivas associações de criadores. Controle sanitário O estado sanitário dos animais deve ser determinado antes que os mesmos sejam levados para o recinto ou a central, sendo importante que permaneçam em quarentena para avaliações clínicas e realização de exames complementares que caracterizem ausência de doenças infecciosa. Como regra geral, se recomenda que os animais adquiridos necessitem passar por testes preventivos no local da compra e 40 dias depois, em particular para brucelose, leptospirose, rinotraqueíte infecciosa bovina, diarreia viral bovina, campilobacteriose e tricomonose. Além disso, deve-se estabelecer previamente um programa de vacinação e de controle de parasitas, tanto de doadoras como de receptoras, para se evitar interferência negativa na produção de embriões bem como no desenvolvimento das diferentes etapas da técnica de TE, garantindo melhor eficiência reprodutiva. Controle nutricional O estado nutricional e a dieta do animal também contribuem de maneira significativa para o sucesso da TE pois, tanto a falta quanto o excesso de energia na dieta afetam negativamente a produção de embriões. O excesso de gordura impede o deslocamento do oócito pela tuba uterina para ser fecundado e prejudica o desenvolvimento de folículos. Já a deficiência em reservas não permite a ciclicidade, e ocasiona índices consideráveis de morte embrionária até 45 dias após a fecundação. A principal fase na qual a nutrição pode afetar o desenvolvimento é no início da gestação. Esse efeito é particularmente delicado até o reconhecimento materno da gestação, que no bovino ocorre entre 17 e 25 dias após a concepção. Seleção das doadoras A seleção das doadoras é um dos pontos críticos da TE, haja vista a obrigatoriedade de se utilizar animais sem distúrbios reprodutivos, com ciclo estral regular e em adequado estado 7 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina nutricional. Antes de iniciar o tratamento hormonal para induzir a superovulação é recomendável verificar a identificação correta da doadora e obter uma amostra de sangue para tipificação, necessária para uma posterior comprovação da descendência. Nesse sentido é necessário inseminar as doadoras somente com sêmen de touros tipificados. A inclusão das doadoras num programa de TE nunca deve ser inferior aos 60 dias pós-parto e, mesmo assim, deve ser precedida de rigorosa observação da regularidade de, pelo menos, dois ciclos estrais consecutivos. Outro aspecto a ser considerado é o bem-estar das doadoras, porque em situações de estresse não respondem ao tratamento superovulatório ou fazem de forma muito deficiente. As novilhas púberes devem ser incluídas num programa de TE desde que tenham adquirido massa muscular representativa de seu peso adulto e apresentem desenvolvimento anátomo-fisiológico que permita a realização dos procedimentos necessários para coleta de embriões. Apesar das novilhas mostrarem reação satisfatória ao estímulo superovulatório, algumas vezes existe dificuldade de introduzir o cateter por via transcervical, o que pode comprometer a eficiência da TE em algumas ocasiões, mesmo assim, a utilização de novilhas em programas de TE é estimulado porque reduz o intervalo entre gerações e acelera o melhoramento genético. Seleção das receptoras As receptoras constituem uma parte fundamental de um programa de TE porque necessitam levar agestação a termo. As fêmeas que apresentam atividade cíclica regular e as primíparas e pluríparas que tenham parido há mais de 60 dias, que o puerpério tenha decorrido normalmente e que estejam livres de doenças ou anomalias do trato reprodutivo, podem ser selecionadas como receptoras. O ideal é que sejam aproveitadas fêmeas oriundas da mesma propriedade em razão de se conhecer o histórico reprodutivo de cada indivíduo. Todavia, na necessidade de se comprar fêmeas destinadas a receptoras, deve-se ter a precaução de adquirir fêmeas com cria ao pé ou novilhas em bom estado de desenvolvimento corporal e com ciclo estral regular. Apesar de não ser requerida uma avaliação de qualidade zootécnica da receptora é fundamental que alguns critérios de seleção sejam adotados, tais como: possuir porte compatível com a raça do embrião a ser transferido garantindo uma gestação e parto normal, livre de auxílio obstétrico, bem como apresentar boa habilidade materna e rusticidade. Entretanto, a seleção final de uma fêmea como receptora somente deve ocorrer no dia da transferência do embrião, baseado nos sinais de estro evidenciados após a sincronização e da avaliação do corpo lúteo funcional. Tratamento hormonal das doadoras e receptoras Os hormônios sintéticos têm sido amplamente empregados na reprodução animal, principalmente na sincronização do estro e no controle da ovulação. A administração exógena de hormônios naturais tem pouco valor na maior parte das situações em decorrência da sua meia-vida relativamente curta. Por outro lado, os hormônios sintéticos apresentam características químicas e atividade semelhante a de hormônios naturais e interferem no metabolismo animal, propiciando um melhor desempenho reprodutivo. Sincronização Receptoras Em um programa de TE, a sincronização do ciclo estral de um grupo de fêmeas é indicada quando se pretende concentrar as colheitas num único dia. Esta prática permite uma racionalização dos procedimentos e um melhor aproveitamento das receptoras disponíveis. Para a TE com embriões frescos, além da sincronização prévia das doadoras é necessário sincronizar o estro das receptoras com o das doadoras. A sincronização de receptoras é fundamental para o sucesso da TE, sem ela seria necessário um número elevadíssimo de receptoras para o uso do 8 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina cio natural. Existem várias técnicas de controle do ciclo estral para sincronização de receptoras, dos mais antigos, à base de prostaglandina, aos mais modernos protocolos, que utilizam o conceito de sincronização do crescimento folicular e da ovulação. Os dois grandes grupos de produtos, para sincronização do estro são os progestágenos e as prostaglandinas. Além disso, são utilizadas também associações hormonais, sendo mais comuns progestágeno-estrógeno, estrógeno-prostaglandina, progestágeno-estrógeno-prostaglandina e GnRH ou gonadotrofina coriônica humana (hCG)- prostaglandina-GnRH ou hCG. Superovulação das doadoras O sucesso dos programas da transferência de embriões depende em grande parte da eficiência da superovulação, que representa um fator limitante devido à ampla variedade na resposta ao tratamento. A resposta superovulatória está diretamente relacionada com a população de folículos presentes no ovário e com a resposta destes ao estímulo das gonadotrofinas exógenas. Tanto os fatores intrínsecos como os extrínsecos influenciam na variabilidade da resposta superovulatória em bovinos. Dentre os fatores fisiológicos, o folículo dominante funcional pode exercer um efeito negativo na resposta e diminuir o número de embriões coletados. Dos fatores extrínsecos, subnutrição e lactação podem exercer um efeito prejudicial na secreção pulsátil de LH e no desenvolvimento folicular. Programas atuais de superovulação (SOV) utilizam a técnica de sincronização da onda folicular, para iniciar a SOV no melhor momento possível, isto é, no início do desenvolvimento dos folículos. Aplicações de FSH exógeno ou gonadotrofina coriônica equina (eCG) são amplamente utilizados em programas de ovulação múltipla/transferência de embriões. Geralmente, injeções subcutâneas ou intra-musculares de eCG ou FSH estimulam o crescimento de folículos adicionais, os quais ovulam espontaneamente sem a necessidade de LH ou hCG. Como o FSH tem uma meia-vida mais curta que o eCG, geralmente é necessário dividir a dose total e injetar com intervalos de 12 horas ao longo de três a quatro dias, tempo necessário para que os níveis séricos dessa gonadotrofina sejam mantidos para permitir a ação superovulatória desejada. (Figura 4). Figura 4. Sincronização do estro das Doadoras em programas de Superovulação. (1) Superovulação após o estro natural; (2) Superovulação após estro induzido (3) Superovulação em animais sincronizados com progesterona. DIV: Dispositivo intravaginal. Inseminação das doadoras As doadoras são inseminadas duas a três vezes conforme os sinais aparentes de estro, sendo a primeira inseminação realizada imediatamente após os primeiros indícios e as demais em intervalos de, aproximadamente, 12 horas. Aquelas fêmeas que não expressarem os sinais de 9 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina estro devem ser também inseminadas, preferencialmente, após 48 e 60 horas da aplicação de PGF2 ou 36 e 48 horas depois da retirada do dispositivo intravaginal ou implante auricular. Colheita de embriões Historicamente, os embriões eram coletados de ovidutos ou úteros de doadoras após o abate ou cirurgia. Desde 1976, a recuperação transcervical de embriões de vaca, búfala e égua é rotineiramente praticada. Para muitas aplicações, as técnicas não-cirúrgicas de colheita de embriões são desejáveis, uma vez que as técnicas cirúrgicas invariavelmente levam à formação de aderências, além disso, há menor risco de vida e de saúde para a doadora com métodos não- cirúrgicos. A colheita de embriões é feita, preferencialmente, entre o sexto e oitavo dia após a primeira inseminação das doadoras. Nesse período, os embriões encontram-se flutuando, no lúmen da ponta dos cornos uterinos. Isso permite sua captação através da técnica de lavagem dos cornos uterinos. Figura 5. Catéteres de Foley duas e três vias e mandril. O método transcervical de colheita de embriões, o catéter de Foley com o mandril (figura 3) no seu interior é guiado através do cérvix por manipulação retal. O cateter pode ser posicionado no corpo uterino ou em um dos cornos. Os autores ressaltaram que em sua maioria os profissionais preferem lavar cada corno separadamente, após o posicionamento da sonda em um dos cornos, o balão é inflado injetando-se dez a 20 ml de ar, quantidade suficiente para fechar a abertura cervical e fixar a sonda. Por conseguinte, o mandril é retirado e inicia-se a coleta dos embriões através da lavagem uterina. A lavagem uterina transcervical pode ser feita através de duas maneiras: a primeira é pelo sistema aberto de coleta, em que a lavagem é efetuada em frações de 40 a 50 ml de solução salina tampão-fosfato (PBS), com o auxílio de uma seringa descartável acoplada diretamente ao cateter posicionado no corno uterino. Quando obtidas essas frações são depositadas em um recipiente, geralmente de vidro graduado, com capacidade para 500 a 1000 ml; a outra maneira é pelo sistema fechado de coleta, que difere do anterior por impedir que o PBS entre em contato com o ambiente exterior. Neste método, o meio de lavagem introduzido no corno uterino é recolhido através de um sistema composto por dois tubos de plástico flexíveis, sendo que um é o recipiente contendo o meio de coleta e o outro, um filtro para a obtenção dos embriões. Esse meio de coleta deve fluir por gravidade através do tubo acoplado ao recipiente, bem como através do cateter em direção ao corno uterino, sendo necessário que o recipienteseja posicionado cerca de um metro acima da garupa do animal. Após a lavagem do corno uterino, o meio de coleta retorna através do outro tubo plástico para o filtro acoplado nesse tubo retendo os embriões juntamente com dez a 30 ml do meio de lavagem. Várias lavagens dos cornos uterinos são feitas, geralmente perfazendo um volume total de dois litros do meio de lavagem. Após a lavagem, o balão é desinflado e a sonda é retirada. Ao término de cada coleta recomenda-se a aplicação de PGF2 para se evitar gestação indesejada. 10 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Manipulação e avaliação dos embriões Os embriões não devem ser deixados no meio original de coleta por tempo mais longo que o necessário, 20 a 30 minutos, uma vez que podem existir substâncias presentes no líquido de lavagem uterina que podem inibir o seu desenvolvimento. O filtro coletor deve ser lavado por jatos de PBS provenientes de uma agulha acoplada a uma seringa de 20 ml até ficar limpo e livre de muco na tela filtrante. O conteúdo do filtro é então transferido para uma placa de Petri. Deve ser usado um conjunto separado de placas e pipetas para manipular os embriões de cada doadora, para prevenir a contaminação e uma mistura inadvertida dos embriões. A identificação cuidadosa das placas e pipetas ajudará a assegurar que esta individualização seja mantida. A busca dos embriões é efetuada sob estereomicroscópio com aumento de 50 a 80 vezes e com auxílio de uma micropipeta de vidro, os embriões encontrados vão sendo transferidos para placa de Petri com diâmetro de 3,5 cm contendo o PBS acrescido de 10 a 20% de soro fetal bovino (SFB) ou BSA (Bovine Serum Albumin, 200 mg/50 ml de PBS), para posteriormente serem separados em viáveis e não viáveis. As estruturas viáveis são: mórula (Mo), mórula compacta (Mc), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (BL), blastocisto expandido (Bx) e blastocisto eclodido (Be) (Figura 6). Essa classificação depende do grau de desenvolvimento que o embrião apresenta no dia da coleta. Figura 6 – Estágios de desenvolvimento embrionário em bovinos, considerando-se os códigos recomendados pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS). Código 1: célula (dia 1) - Pró núcleos feminino e masculino (zigoto); Código 2: 2 células (dia 2); Código 2: 4 células (dia 3); Código 3: Mórula inicial (dia 4-5) -13 a mais de 32 blastômeros - até 16 células consegue-se boa separação mecânica; Código 4: Mórula (dia 6); Código 5: Blastocisto inicial (dia 7): Código 6: Blastocisto (dia -7-8): Código 7: Blastocisto expandido (dia 8-9); Código 8: Blastocisto eclodido (dia 9); Código 9: Blastocisto eclodido/expandido (dia 9-10). 11 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Na avaliação individual dos embriões, são várias as características a serem observadas, tais como: tamanho, forma, cor, homogeneidade do citoplasma, forma e integridade da membrana pelúcida, tamanho e presença de células no espaço perivitelíneo (E.P.V.) e presença de vesículas. Assim os critérios de avaliação de embriões segundo os parâmetros de qualidade propostos pela IETS serão em: (1) excelente ou bom; (2) regular; (3) pobre e (4) morto ou degenerado. Embriões considerados viáveis, classificados entre um e três devem ser lavados dez vezes no meio de cultivo visando impedir uma transmissão de agentes infecciosos. Transferência do embrião Antes da transferência, o embrião precisa ser acomodado no centro de uma palheta de 0,25 ml, contendo meio de cultivo. O envasamento na palheta é feito de tal forma que uma coluna central contendo o embrião encontra-se separada das colunas nas extremidades por duas colunas de ar. As palhetas precisam ser devidamente identificadas para se evitar equívocos no momento da transferência. Os embriões podem ser destinados à transferência a fresco ou criopreservação. Conceitualmente, o congelamento de embriões é possível a partir da desidratação das células embrionárias promovida pela passagem dos embriões por soluções hiperosmóticas, denominadas crioprotetoras (glicerol, etileno-glicol, dimetilsulfoxido, entre outros) e depois de protocolos de criopreservação são armazenados em botijões de nitrogênio líquido a uma temperatura de -196ºC, por um período indeterminado. A transferência de embriões pode ser feita cirurgicamente, laparoscopicamente e não cirúrgica. Embora alguns profissionais atinjam índices de prenhez mais elevados com transferências cirúrgicas em bovinos são necessárias melhores instalações, melhor treinamento e exige mais tempo que a transferência não cirúrgica. Sobretudo, a transferência não cirúrgica é mais adaptada para uso em fazendas e tem se tornado quase tão simples de executar como a inseminação artificial. As receptoras selecionadas com base na estrutura do corpo lúteo cíclico e nas anotações da qualidade e intensidade do estro devem ser submetidas à anestesia peridural. A dose da anestesia local é ajustada para assegurar que a fêmea permaneça de pé ao longo da TE. A TE propriamente dita, também conhecida como inovulação, é semelhante ao adotado para a IA. Sob condições assépticas, a palheta contendo o embrião é encaixada em um aplicador (inovulador) revestida por uma bainha estéril; em seguida é introduzida via transcervical e por manipulação retal é guiada até o corno uterino ipsilateral do corpo lúteo cíclico, onde finalmente o líquido contendo o embrião é depositado. Diagnóstico de gestação em receptoras O diagnóstico de gestação por palpação retal é um método seguro, que não oferece risco para a integridade da vaca e para a viabilidade do feto quando realizada por profissional habilitado, sendo considerado o método mais prático e preciso para o diagnóstico de gestação em fêmeas bovinas, desde que realizado após 45 – 50 dias de pós-serviço, dependendo da capacidade do examinador. O método de ultra-sonografia ou ecografia é um método de diagnóstico para exploração de estruturas, através da emissão de ultra-som e captação de ecos, e ainda permite a avaliação do tamanho, da forma, da localização e da consistência de órgãos em funcionamento. O método mais simples de avaliar o sucesso da TE é através do diagnóstico de gestação por exame ginecológico, incluindo a palpação retal e a ultra-sonografia, geralmente, quatro a cinco semanas após a TE, ou seja 35 a 42 dias de gestação. 12 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES Tecnica A produção in vitro de embriões (PIV) é um método de punção folicular (OPU), do inglês "Ovulum Pick-up” ou processo de aspiração folicular e retirada dos oócitos (óvulos imaturos) direto do ovário da fêmea. Realizada através de uma bomba de vácuo, guiada por ultrassonografia ou diretamente de ovários de fêmeas abatidas em abatedouro. Ao final da busca, seleção e classificação, os oócitos são acondicionados em criotubos separados contendo meio de cultura especifico onde são transportados até o laboratório na temperatura de 38°C. Esse ambiente possibilita o amadurecimento das estruturas durante o transporte, podendo ultrapassar, inclusive, às 8 horas. No laboratório os oócitos são colocados em placas contendo meio específicos para finalizar às 24 horas de maturação. A partir desse momento, os oócitos estão prontos para serem, fecundados. Os oócitos são transferidos para uma nova placa contendo o meio de fertilização especifico onde serão co-cultivados com o espermatozoide por no máximo 24 horas. Após as 24 horas da fecundação, os zigotos são lavados e transferidos para uma placa contendo meio especifico para o desenvolvimento embrionário onde também permanecem em condições rigorosamente controladas para que as divisões celulares ocorram até o estágio de blastocisto (sétimo dia de desenvolvimento embrionário ou oitavo dia de OPU) na qualos embriões estão aptos para serem transferidos. Os embriões são envazados individualmente em palhetas, identificados e transportados em temperatura média de 35°C. O tempo ideal entre o transporte e o final da transferência na receptora é de 8 horas. Figura 7. Processo de produção de embriões in vitro. Destaques A PIV desenvolve estudos sobre maturação, fecundação e cultivo in vitro (MIV-FIV-CIV), acelera o progresso genético dos bovinos submetidos a programas de melhoramento zootécnico, elas são um importante instrumento porque acelera e confere maior precisão no processo de seleção animal, podendo ser também empregada para obter descendentes de fêmeas geneticamente superiores incapacitadas e levar uma gestação a termo devido a distúrbios reprodutivos adquiridos sem caracterização genética. Em vantagem a PIV não requer tratamento hormonal para o seu sucesso, pode-se aproveitar de forma muito mais eficiente animais que não respondem à superovulação, seja por anomalias adquiridas (resistência ao hormônio). Muitos 13 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina são os casos de animais inférteis ou subférteis por problemas adquiridos. São frequentes os casos de aderências de ovário e útero, metrites crônicas, infecções tubáricas e outras patologias. A PIV permite a produção de progênie de animais com tais enfermidades, uma vez que ela não necessita do restante do aparelho reprodutivo, bastando o ovário possuir folículos de tamanho suficiente para a aspiração, sendo assim, animais com tais patologias não diferem dos resultados obtidos de animais saudáveis. Referente às punções, na técnica OPU não ocorrem efeitos deletérios aos animais, mesmo após cinco meses de punções, duas vezes por semana, no que concerne aos exames de saúde e fertilidade, clínicos ou post mortem. No exame histológico, animais que foram aspirados por vários meses apresentaram maior quantidade de colágeno na túnica albugínea. A frequência das aspirações é em média a cada 15 dias nas mesmas vacas de uma mesma fazenda, e o mínimo a cada 07 dias. A taxa de recuperação de oócitos imaturos aumenta, se a coleta for repetida no mesmo animal por vários meses. A aspiração repetida 2 vezes por semana produz aumento considerável no número de folículos visíveis recuperados, observados nas aspirações seguintes. A PIV possibilita a realização de inúmeras coletas na doadora sem a necessidade de esperar períodos de recuperação da mesma. No entanto, os embriões da PIV são mais sensíveis ao processo de criopreservação, fato que limita a dispersão destes produtos por longas distâncias. A eficácia da PIV em vacas esta em uma média de 8.0 oócitos colhidos por sessão, sendo que 16% desenvolveram em embriões transferíveis após MIV /FIV /CIV com uma taxa de prenhes de 40% a 50%. Baseado no número médio de oócitos colhidos por sessão seguras, é possível transferir dois embriões/semana/vaca, resultando em 1bezerro, e consequentemente ao redor de 48 bezerros ao ano. Em contraste, com a TE, 1/3 dos animais não respondem ao tratamento superovulatorio, 1/3 responde com menos de 6 embriões viáveis e apenas 1/3 das doadoras respondem ao estimulo hormonal apresentado no mínimo 6 embriões viáveis. É possível obter em media, 11 embriões viáveis de doadoras que foram criteriosamente selecionadas. Na TE quando embriões frescos classificados de 1 a 3 são transferidos para receptoras de boa qualidade, obtêm-se taxas médias de gestação da ordem de 60% . resultados superiores são geralmente alcançados com embriões de classe 1 (65 a 70%) e inferiores com embriões de classe 3 (45 a 50%). Com embriões congelados as taxas de gestação variam de acordo com o método de criopreservação. Assim, é possível obter uma media de 36 embriões ano/vaca pela TE. No entanto, as respostas superovulatorias são muito variáveis nas doadoras, sendo um fator limitante e que faz mais eficiente a biotecnica de PIV de embriões. Exportação de embriões in vitro No que se refere à exportação de embriões produzidos in vitro, a intensificação da exportação comercial de embriões várias dúvidas começaram a surgir sobre a possibilidade da transmissão de doenças, devido a isto países vem impondo enormes exigências sanitárias para o comercio internacional de embriões, com inúmeros testes nas doadoras, nas receptoras e nos embriões, que tornam a importação de embriões proibitiva, pois as exigências sanitárias cobradas são as mesmas do transporte dos animais vivos. Quando se analisa o processo de transferência de embriões em sua totalidade, observam-se três níveis de risco que estão envolvidos: O embrião que será transferido, o sêmen que é utilizado para fecundação do oócitos “in vivo” ou “em vitro” e a receptora. 14 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina MANIPULAÇÃO DE OÓCITOS INCLUSOS EM FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS (MOIFOPA) Tendo em vista que as biotécnicas ligadas à reprodução têm como finalidade geral o aumento da eficiência reprodutiva dos rebanhos, será considerada agora a eficácia do ovário como uma “máquina” produtora e liberadora de óvulos. O ovário mamífero contém milhares de oócitos, inclusos em sua maioria (cerca de 90%) nos folículos ovarianos pré-antrais (FOPA) (primordiais primários e secundários). Apesar deste enorme capital oócitario, uma ínfima proporção destes oócitos (cerca de 0,1%) será ovulada. Quando um determinado folículo deixa a reserva, irá crescer até a ovulação ou entrar em atresia ou morte folicular, sendo este processo responsável pela eliminação de aproximadamente 99,9% dos folículos presentes no ovário. De fato, estudos em diferentes espécies têm demonstrado a recuperação de um número significativo de oócitos a partir de folículos pré-antrais, sendo que a população folicular no ovário no nascimento foi estimada em 235.000 folículos em vacas, 420.000 em suínos, 160.000 em ovelhas e 35.000 em cabras. Figura 8. Estrutura de um ovário (em corte transversal) e estádios de desenvolvimento dos folículos. Considerando a quantidade mínima desses folículos que se desenvolve ate o estagio de folículo pré-ovulatorio, a biotécnica da manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) objetiva-se em: 1) No isolamento ou resgate de folículos pré-antrais a partir de ovários; 2) Na conservação visando à estocagem por um curto (resfriamento) ou longo (congelação) período; 3) No cultivo folicular que tem como finalidade promover o crescimento, maturação e fecundação in vitro dos oócitos previamente inclusos em FOPA. Aplicações O ovário artificial tem importantes aplicações nas seguintes áreas, a saber: 1. Pesquisa fundamental ou básica - Possibilita o estudo in vitro do efeito de diferentes substâncias sobre os folículos pré-antrais visando elucidar os mecanismos envolvidos na regulação da foliculogênese inicial, atualmente pouco compreendida. 15 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina 2. Biologia molecular- Assegura as condições necessárias para identificar e quantificar, nos diferentes compartimentos foliculares, a expressão dos genes que são responsáveis pelo controle do crescimento de folículos pré-antrais e antrais; 3. Indústria farmacêutica - Permite a realização de testes in vitro da ação de fármacos (benéfica ou tóxica) sobre os folículos preliminarmente ao seu emprego em experimentos envolvendo animais e seres humanos; 4. Biossegurança - Ferramenta importante para se avaliar o efeito da radiotividade sobre a sobrevivência e a capacidade de desenvolvimento folicular; 5. Formação de bancos genéticos (germoplasma) - Permite uma avaliação precisa da eficiência de protocolos de criopreservação de oócitos analisando a taxa de sobrevivência e desenvolvimento in vitro de oócitos inclusos folículos pré-antrais previamente criopreservados. Esta estratégiaé de fundamental importância para a constituição de bancos de germoplasma tanto na espécie humana como em animais de interesse zootécnico ou em vias de extinção visando posterior produção in vitro de embriões ou xenotransplante; 6. Reprodução humana assistida (tratamento de infertilidade) - Representa uma alternativa futura para o aprimoramento de meios de cultura visando a maturação oocitária e consequentemente a produção de embriões humanos in vitro. Atualmente estes embriões são produzidos utilizando-se procedimentos de superovulação e colheita dos oócitos por punção gerando desconforto físico e emocional nas pacientes. Outra aplicação seria a preservação da fertilidade feminina nos casos de mulheres que se submeterão a tratamentos de radio ou quimioterapias (casos de câncer) e que necessitam ter seu ovários previamente removidos e criopreservados para posterior autotransplante ou cultivo in vitro; 7. Bem-estar animal - Por se tratar de um modelo exclusivamente in vitro para a produção de embriões, a MOIFOPA contribuirá para o bem-estar animal (redução do estresse) pois representará uma alternativa aos procedimentos de superovulação, colheita de embriões, punção de oócitos por ultrassonografia bem como ao uso de animais em experimentos; 8. Multiplicação de animais - No futuro possibilitará a produção in vitro de embriões em larga escala a partir de oócitos inclusos em folículos pré-antrais, recuperados de ovários inteiros ou de fragmentos ovarianos, que seriam submetidos aos procedimentos de crescimento, maturação e fecundação in vitro; Tabela 1 Quadro ilustrativo dos principais avanços obtidos com o cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies nos últimos 15 anos. Espécie Cultivo Crec. Antro Matur. Embrião Nac. Autor GATA 4 Poços (isolado) Jewgenow et al., 1998 CADELA Gota (isolado) Serafim et al., 2010 VACA 96 Poços (isolado) Mclaughlin et al., 2010 MULHER 24-96 Poços (isolado) Telfer et al., 2008 OVELHA Gota (isolado) Arunakumari et al., 2010 CABRA Gota (isolado) Saraiva et al., 2010 PORCA 24 Poços (Grupo) Wu et al., 2001 BÚFALA Gota (Co-cultivo Cel cumulus) Grupta et al., 2008 CAMUNDONGA 24 Poços (inserto) o'Brien et al., 2003 16 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina CLONAGEM A clonagem é um processo de reprodução assexuada onde se tem a produção de indivíduos geneticamente iguais a partir de uma célula-mãe. é um método científico artificial de reprodução que utiliza células somáticas (aquelas que formam órgãos, pele e ossos ) no lugar do óvulo e do espermatozóide. Vale lembrar que na natureza, os seres vivos se reproduzem através de células sexuais e não por células somáticas. As exceções deste tipo de reprodução são os vírus, as bactérias e diversos seres unicelulares. A primeira experiência com clonagem de animais ocorreu no ano de 1996, na Escócia, no Instituto de Embriologia Roslin. O embriologista responsável foi o doutor Ian Wilmut. Ele conseguiu clonar uma ovelha, batizada de Dolly. Após esta experiência, vários animais foram clonados, como por exemplo, bovinos, equinos, caprinos, ratos e suinos. É difícil precisar o número de animais clonados já produzidos, no entanto, uma estimativa realizada em 2004 apontava 1500 bovinos clonados nascidos. Sem dúvida, este número vem crescendo desde então, com a participação de centros de pesquisa e empresas brasileiras. No Brasil, até o final de 2006, cerca de 24 clones bovinos já haviam sido produzidos comercialmente e entregues com sucesso aos seus proprietários. Técnica A clonagem inicia-se com a coleta de um fragmento de tecido, usualmente uma biópsia da pele, do animal a ser clonado. A biópsia é encaminhada a um laboratório de clonagem, onde é processada para dar início ao cultivo celular. As células cultivadas são transferidas para oócitos receptores previamente maturados e enucleados. O processo de enucleação do oócito receptor consiste na remoção de todo o material genético (DNA) nuclear, garantindo que apenas o DNA nuclear do animal a ser clonado esteja presente nos indivíduos gerados. O oócito receptor sem núcleo e a célula do animal a ser clonado são fundidas através de pulsos elétricos. Em seguida, tratamentos químicos, conhecidos como ativação, propiciam as condições necessárias para que o oócito, agora contendo o DNA do animal a ser clonado, inicie o desenvolvimento, transformando-se num zigoto e ao término de uma semana, em um embrião apto a ser transferido para uma vaca receptora sincronizada dando início a uma gestação. Figura 9. Protocolo experimental para realização de clones Bovinos. Destaques Na espécie bovina a clonagem é uma poderosa ferramenta para acelerar os resultados em programas de melhoramento genético. Por conta da menor prolificidade dos bovinos em relação a outras espécies domésticas, os programas de melhoramento genético nesta espécie requerem maior intervalo de tempo para atingir os resultados desejados. A clonagem, por permitir intensa 17 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina multiplicação dos animais geneticamente superiores, possibilita acelerar o progresso genético e aumentar a eficiência dos programas de melhoramento, aumentando a influência dos animais excepcionais no rebanho. Evidentemente, a clonagem de animais elite deve ser associada a outras biotécnicas reprodutivas, como fertilização in vitro e inseminação artificial, para que a variabilidade genética dentro do rebanho e maior ganho genético entre gerações seja garantida. Também, há grande demanda pelos serviços de estocagem de material genético (células). O estabelecimento e armazenamento de linhagens celulares é o primeiro passo da clonagem, que por sua vez é a única ferramenta disponível capaz de recuperar um animal em caso de morte ou no caso de doenças e acidente que abreviem sua vida reprodutiva, como por exemplo, touros que deixaram de produzir sêmen após ferimento nos testículos ou vacas que deixaram de produzir embriões por afecções na tuba uterina. Uma vez armazenadas, as linhagens celulares podem ser descongeladas a qualquer tempo, novamente cultivadas e multiplicadas em laboratório para dar início ao processo de produção de um novo indivíduo clonado. Assim, a clonagem permite não somente reparar os prejuízos financeiros do pecuarista, como também recuperar a genética perdida. A disseminação da clonagem como ferramenta reprodutiva ainda encontra desafios na eficiência e no custo da técnica. A menor capacidade dos embriões clonados no estabelecimento de prenhezes e geração de animais nascidos, em comparação aos embriões gerados naturalmente ou produzidos por fertilização in vitro, o alto investimento inicial para instalação de um laboratório de clonagem, bem como os gastos inerentes ao seu funcionamento, que incluem equipe técnica especializada e o uso de insumos importados, elevam o custo da clonagem e limitam sua aplicação a um número pequeno de animais. Por estas razões a clonagem comercial ainda permanece restrita a exemplares de alto valor comercial ou zootécnico, usualmente comprometidos com a produção e venda de sêmen e embriões. No Brasil, questões de ordem legal ainda limitam o emprego da clonagem. Embora não seja proibida, não existe ainda regulamentação da técnica no país. Todavia, há um projeto de lei em trâmite no Senado Nacional para a regulamentação da clonagem animal no país (Projeto de Lei do Senado nº 73 de 2007). Além disso, as principais associações de criadores ainda não elaboraram um conjunto de normas ou critérios para o registro dos animais clonados, o que gera um ambiente de incertezas para os criadores dispostos a investir na técnica. Experiência consagrada A experiência da Embrapa com a clonagem de bovinos tem mais de uma década. A Empresa é responsável pelo primeiro bovino clonado na América Latina,representando um marco para a ciência. A bezerra “Vitória da Embrapa”, da raça Simental, nasceu em março de 2001. Ela foi clonada pela técnica de transferência nuclear a partir de células embrionárias e sempre mostrou bom desempenho em relação a crescimento e desenvolvimento de acordo com os padrões de sua raça. Em 2004, o nascimento do primeiro filhote comprovou que Vitória era um clone perfeito do ponto de vista científico e de produção, considerando o potencial reprodutivo e a habilidade materna. Em 2006, deu à luz mais uma cria. Faleceu em 2011, já em idade avançada. Além dos dois filhos, Vitória deixou dois netos, todos nascidos de forma natural. O domínio da tecnologia alcançado com o nascimento de Vitória levou a outros clones bovinos bem sucedidos. Em 2003, nasceu “Lenda da Embrapa”, da raça holandesa. Em 2005, foi a vez de “Porã”, da raça Junqueira, em estado crítico de extinção no Brasil, com menos de 100 animais em todo o País. Assim como Vitória, esses clones deram crias, o que comprova bom potencial reprodutivo e habilidade materna. 18 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina TRANSGÊNESE Os animais transgênicos são aqueles que tiveram seu patrimônio genético alterado com a introdução de genes de outras espécies que não a sua. Isto ocorre através da introdução de um gene de interesse no núcleo de um óvulo já fecundado. O objetivo é fazer com que o gene exógeno se expresse neste animal "hospedeiro". O primeiro experimento realizado com sucesso foi feito em 1982, quando um DNA de rato foi introduzido em um camundongo. O resultado positivo foi verificado através do aumento do tamanho corporal verificado no camundongo. Já existem linhagens de animais transgênicos produzidas para serem utilizados em pesquisas laboratoriais. Estes animais desenvolvem doenças humanas, tais como: diferentes formas de tumores, diabetes, obesidade, distúrbios neurológicos, entre outros. Outra possibilidade de utilização destes animais é na área de xenotransplantes. Uma linhagem de porcos transgênicos, porcos P33, foi desenvolvida com sucesso, tendo uma alta taxa de compatibilidade com seres humanos. Estes porcos estão sofrendo um processo de "humanização" genética. Os animais transgênicos também podem ser utilizados para a produção de proteínas e outras substâncias, tais como hormônios. Varios centros de pesquisa estão realizando experimentos utilizando camundongos, coelhos, ovelhas e vacas entre outros. O objetivo é produzir, no leite destes animais, proteínas de interesse para tratamentos de saúde. Como exemplo a ovelha Polly teve introduzido um gene para produzir uma proteína visando o tratamento da fibrose cística, doença também conhecida como mucoviscidose. Esta doença ocorre pela falta de uma enzima produzida pelo pâncreas. Muitos benefícios poderão surgir, sendo um dos principais a possibilidade de redução de tempo e custo na produção em série de produtos biológicos. Porém, várias questões éticas podem ser levantadas sobre o impacto da introdução de variantes genéticas artificialmente produzidas. Considerações Finais Os avanços obtidos com relação às biotécnicas ligadas à reprodução animal têm acompanhado o crescimento da bovinocultura no Brasil. As fêmeas bovinas bem sendo introduzidas em todos estes estudos e investimentos com resultados satisfatórios. Estas técnicas apresentam grande importância uma vez que assumem o papel de ferramenta essencial para o melhoramento genético dos rebanhos. Apesar de algumas destas ainda estarem restritas aos centros de pesquisa, como é o caso da MOIFOPA, transgênese e clonagem, despontam como promissoras, contribuindo para a elucidação de vários mecanismos envolvidos na reprodução. Sendo ainda necessárias mais pesquisas para que seja possível a sua aplicabilidade. 19 Jimenez, R.C (2013) Biotecnicas Reprodutivas Na Fêmea Bovina Referencias Associação Brasileira de Inseminação Artificial – ASBIA. Importação, exportação e comercialização de sêmen. Index ASBIA 2012. Associação Brasileira de Inseminação Artificial – ASBIA. Manual de inseminação artificial. Edição 2010. Conselho Federal de Medicina Veterinária, Transgenia em animais, Brasília, Revista CFMV. – v.17, n.52. 2011. Lima, G.L; Araújo, E.P.S. aplicação das biotécnicas de moifopa, transgênese e clonagem na reprodução de caprinos. acta veterinaria brasilica, v.4, supl., p.s36-s42, 2010. Noleto, M.E.CA. Transferência de embriões Em bovinos, Monografia para o curso de pós- graduação “latu sensu” em produção e reprodução em bovinos. Universidade Castelo Branco. Goiânia, nov. 2006. Rumpf, R. Produção De Animais Transgênicos: Metodologias E Aplicações/ Rumpf, R; Melo, E.O. Brasilia, Embrapa recursos genéticos, Biotecnologia, 2005. Ricarte, A.R.F; Danta, T.V.M; Araújo, S.A.C. et al. Possibilidades de aplicação de biotecnologias reprodutivas em animais de produção acometidos por agentes víricos. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.32, n.1, p.3-8, jan./mar. 2008. View publication stats https://www.researchgate.net/publication/266141405