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Criopreservação de embriões e oócitos
A criopreservação é a redução ou mesmo a parada de todos os fenômenos
biológicos (movimentos moleculares, reações químicas e atividades enzimáticas) pelo
frio, com objetivo de conservar o material genético. A criopreservação à temperatura de
-196ºC (em botijão de nitrogênio líquido) é um desafio muito grande, pois o maior
constituinte das células é a água, que congela, podendo lesionar as outras estruturas celulares.
A criopreservação de oócitos é muito mais recente que a de embriões, e ainda mais
desafiadora. Esse procedimento é feito com mais eficiência nas mulheres quando comparado
às fêmeas domésticas porque estas possuem mais lipídios nos oócitos (é considerado ruim
para a criopreservação).
As vantagens da criopreservação são as seguintes:
- Otimização das biotecnologias reprodutivas: possibilidade de preservar o
material genético quando não há receptora disponível.
- Conservação de material genético (aplicação para animais em extinção e
também de produção).
- Troca internacional de material genético.
- Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte.
- Adequação à época de parições.
- Sanidade.
PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO
Lei da termodinâmica: o protocolo empregado na criopreservação de uma célula
deve ser suficientemente lento para prevenir a cristalização da água intracelular e
suficientemente rápido para prevenir a explosão das células a elevadas concentrações de
eletrólitos antes da congelação.
DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO
Em um embrião de 100 células, cerca de 50 células morrem no processo de
criopreservação. Por isso, quanto mais avançado o embrião (maior a quantidade de
células), maior a chance de gerar uma prenhez porque terá maior quantidade de células
viáveis. Esse é um dos motivos por que a criopreservação de oócitos é mais complicada, já
que possui uma única célula, além de ser uma célula muito maior, logo, tem muito mais água.
Ademais, as células do cumulus também formam uma barreira contra a entrada do
crioprotetor; porém, se desnudar, a viabilidade após o descongelamento também é maior
(maior chance de ocorrer poliespermia na FIV).
Os danos causados pela criopreservação são os seguintes: lesões nas membranas
(citoplasmática do oócito e da zona pelúcida do embrião), desnaturação proteica durante a
criopreservação e desnaturação do citoesqueleto.
PROTEÇÃO CONTRA DANOS
A proteção contra danos é fornecida por crioprotetores, os quais garantem a
proteção celular por meio da redução da formação de cristais de gelo e do ponto
crioscópico da água (diminui a temperatura de congelamento*1) e aumento da estabilidade
da membrana celular.
*1 A melhor temperatura para congelamento é -6°C; se congelar antes, forma cristais de
gelos maiores, que danificam mais as membranas.
Existem os seguintes tipos de crioprotetores:
- Intracelulares (penetrantes): substituem parte da água intracelular,
permitindo a desidratação parcial da célula e, dessa forma, reduzindo a
formação de cristais de gelo. Também reduzem o tamanho desses cristais, a
temperatura de solidificação da água intracelular e alteram a forma dos
cristais. Altas concentrações desses compostos são tóxicas para as células.
São eles: etilenoglicol (menos tóxico), DMSO, glicerol, propanodiol,
butanodiol e metanol. Extracelulares (não penetrantes): promovem a
desidratação celular controlada durante a congelação e impedem a
formação de grandes cristais de gelo no interior da célula. Possuem papel
importante na manutenção de uma maior pressão osmótica no meio
extracelular, o que previne um grande afluxo de água nas células durante o
aquecimento (importante para a reidratação do embrião). São eles: lactose,
glicose, sacarose, PVP, manitol, trealose e BSA.
OBS: A maioria dos protocolos utiliza um crioprotetor intra e um extracelular.
- Moléculas protetoras do citoesqueleto: promovem o relaxamento do
citoesqueleto através da despolimerização da actina e da tubulina. A principal
é a citocalasina B.
- Proteínas anticongelantes: são oriundas de peixes da região da Antártida, que
vivem em águas de temperaturas negativas, mas não congelam. Podem ser
aplicadas em protocolos de criopreservação.
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO
1. CONGELAMENTO LENTO
Foi o primeiro sistema desenvolvido para criopreservar embriões. Pode-se fazer a
criopreservação pelo método convencional ou pelo método "one step”. Permite o equilíbrio
progressivo entre o crioprotetor e o compartimento aquoso do embrião: as taxas de
resfriamento permitem a troca de água intracelular por crioprotetor sem grandes efeitos
osmóticos ou mudanças na forma celular que sejam prejudiciais a sua funcionalidade.
Em relação à vitrificação, a vantagem do congelamento lento é a não indução de
estresse osmótico devido às baixas concentrações de crioprotetores (1 a 2 M, sendo a
maioria 1,5 M). Porém, como há formação de cristais de gelo, pode haver danos físicos às
células. Além disso, também é uma técnica muito mais demorada (2-3 h), o que afeta a
produtividade; induz maior sofrimento ao embrião (fica retraído); e é necessário utilizar
uma máquina para fazer a curva de congelamento.
Uma grande vantagem do congelamento lento é que, como a dose de crioprotetor
utilizada é bem baixa, o veterinário a campo consegue descongelar a palheta, montar o
aplicador e transferir o embrião como se fosse uma inseminação convencional, o que é
conhecido como "embrião DT” (direct transfer).
As etapas do congelamento lento são as seguintes:
- Lavar os embriões em PBS com 0,4% de BSA.
- Equilíbrio com 1,5 M de etilenoglicol em PBS com 0,4 de BSA por, pelo
menos, 10 minutos: os embriões devem ficar um mínimo de 10 minutos no
crioprotetor para que este exerça sua função, mas não podem ficar mais que 20
minutos, senão desidratam demais. Logo, tem-se 10 minutos para realizar
todas as etapas seguintes após o tempo mínimo de ação do crioprotetor.
- Envase em palheta durante equilíbrio: puxar o meio de manutenção (pode ser
o Holding), uma bolha de ar, o embrião com o crioprotetor, uma bolha de ar, o
meio de manutenção e, por fim, uma bolha de ar. O primeiro meio limpa o
caminho no trato reprodutor feminino para o embrião passar e o segundo
empurra o embrião para ter certeza de que saiu da palheta.
- Levar palhetas ao congelador de embriões já estabilizado entre -5 e -7ºC.
- Deixar por 5 minutos nessa faixa de temperatura.
- Realizar o seeding (indução da cristalização, formação de gelo).
- Confirmar a formação do gelo nas palhetas.
- Deixar mais 10 minutos na faixa de temperatura entre -5 e -7ºC.
- Iniciar a curva de congelação (-0,3ºC a -0,6ºC/min).
- Após atingir -35ºC, mergulhar as palhetas em nitrogênio líquido.
A reidratação do embrião para realização da TE direta deve ser feita através da
descongelação por 5 segundos no ar e 30 segundos em banho-maria a 20-25°C. A palheta
deve ser montada diretamente no inovulador e inserida no trato reprodutivo da fêmea, não
sendo recomendado levar mais do que 20 minutos entre a descongelação e a inovação. Não
existe avaliação prévia do embrião.
2. VITRIFICAÇÃO
Utiliza-se uma grande concentração de crioprotetor (6-7,5 M) associada a uma
curva de refrigeração muito rápida (imersão direta em nitrogênio liquido); esse binômio
faz com que as células criopreservem sem passar pelo congelamento (não há formação
de gelo), logo, as células passam da fase líquida citoplasmática direto para a fase sólida
amorfa (estado vítreo). Quanto mais rápida for a velocidade e menor o volume da
palheta, melhor.
A principal vantagem da vitrificação é a não cristalização, que protege as células
contra danos mecânicos. Por outro lado, as altas concentrações de crioprotetores promovem
estresse osmótico muito intenso, o que altera a viabilidade do embrião e do oócito. Também
é uma técnica muito operador dependente e é necessário remover os crioprotetores antes de
transferir o embrião para o trato reprodutivo da fêmea (questionável).
OBS: O embriãoFIV têm taxas melhores de viabilidade na vitrificação que na congelação
lenta. Já o embrião de TE tem melhores taxas na congelação lenta que na vitrificação.
Existem vários materiais de vitrificação, como OPS, grade e microscopia eletrônica
de transmissão, cryollop, criotop (melhor eficiência), micropietas de vidro (GMP), superfície
sólida de vitrificação (SSV), microgotas e hemi-palhetas (hemi straw). No caso da
vitrificação por OPS, utiliza-se uma palheta de 0,25 mL esticada (reduz o diâmetro interno,
facilitando a vitrificação).
VITRIFICAÇÃO X CONGELAMENTO LENTO
Os inconvenientes da vitrificação são os seguintes: estresse osmótico e toxicidade
química do crioprotetor. Já as vantagens são a velocidade da técnica, não obrigação da
utilização de um congelador programável e inibição da formação de cristais de gelo.
VITRIFICAÇÃO CONGELAMENTO LENTO
Simples e rápida (menos de 10 minutos) Mais de 3h
Barata e não exige a utilização de máquina
de congelamento
Caro e exige a utilização de máquina de
congelamento
Volume menor (1-2 microlitros) Volume maior (100-250 microlitros)
Não há formação de cristais Há formação de cristais
Menos danos mecânicos Mais danos mecânicos
Maior dano químico Menor dano químico
Sistema aberto ou fechado Apenas sistema fechado
Altas concentrações de crioprotetores Baixas concentrações de crioprotetores
FATORES QUE INFLUENCIAM AS TAXAS DE SOBREVIVÊNCIA DE
EMBRIÕES
- Qualidade do embrião: embrião de melhor qualidade apresenta maior crio
tolerância.
- Estágio de desenvolvimento embrionário: quanto maior o número de
células, melhor. Porém, o ideal é que o embrião chegue somente até a fase de
blastocisto expandido, pois o eclodido já não tem mais zona pelúcida (exigida
para a comercialização).
- Espécie e raça: embriões de taurino, embora tenham maior teor de lipídios,
congelam melhor que os embriões de zebuíno. Já os embriões de suíno, que
têm muito lipídio, apresentam baixa criotolerância.
- Origem do embrião: TE (congela melhor) ou PIVE.
- Presença da zona pelúcida: é uma barreira contra a entrada de crioprotetores
(por isso, embriões eclodidos apresentam maior tolerância, mas não podem ser
comercializados).
- Momento da primeira clivagem após a inseminação/FIV.
CRIOPRESERVAÇÃO DE OÓCITOS
De maneira geral, os oócitos submetidos ao congelamento lento não sobrevivem,
sendo a vitrificação a melhor alternativa. Os efeitos da criopreservação são os seguintes:
número reduzido de células do cumulus, rompimento da zona pelúcida e sinais de
degeneração. Aparentemente, os oócitos de gatas têm maior criotolerância, apesar de terem
bastante lipídio. É possível vitrificar oócitos imaturos ou maturados, com células do cumulus
ou desnudados.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
- Progressos a partir dos anos 70.
- As técnicas de congelação lento e vitrificação saem ambas utilizadas para
criopreservação de embrião, mas somente a vitrificação é utilizada para
oócitos.
- A eficiência das duas técnicas pode variar de acordo com a origem do embrião
(TE ou PIVE) e a espécie em questão.