Questões para estudo - Microscopia e Cultura Celular

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O que são culturas celulares? Quais os tipos de células podem ser cultivadas?
A cultura de células se refere à propagação de células em ambientes controlados, artificiais ou não. O método é utilizado principalmente para cultura de células eucarióticas de organismos multicelulares, especialmente animais. 
Cultura celular = células mantidas em laboratório sob condições de pressão, temperatura e nutricionais idéias para sobrevivência.
 Explique a rotina histológica, descrevendo as etapas da preparação do material biológico para análise em microscopia de luz.
O tecido a ser analisado deve ser preparado para permitir a passagem da luz através dele e a visualização de estruturas específicas através da aplicação de corantes específicos. O processo de preparação das lâminas é dividido em cinco etapas: fixação, desidratação e diafanização, inclusão, microtomia e coloração. 
1. Fixação: Após a coleta da amostra biológica (biópsia, necrópsia ou peças cirúrgicas), deve-se primeiramente fixá-la com o objetivo de manter a estrutura e a composição mais próxima a do tecido in vivo e impedir a ação de bactérias e enzimas proteolíticas (autólise) que provocariam a degradação tecidual. A fixação pode ser realizada por métodos físicos (aquecimento, resfriamento) ou por métodos químicos (formol, líquido de Bouin). Os fixadores atuam estabelecendo ligações transversais entre as proteínas intra e intercelulares. Quando a amostra é espessa, realiza-se, a sua clivagem para permitir a melhor penetração do fixador. Outra peculiaridade está em amostras de tecido mineralizados, que precisam ser descalcificados para permitir a sua fixação.
2. Desidratação e diafanização: Fixada a amostra, procede-se a sua desidratação através de banhos de álcool em concentrações crescentes, de etanol 70% a etanol 100%. Após a desidratação, realiza-se a sua diafanização ou clareamento com a finalidade de substituir o etanol presente na amostra por um substância intermediária que seja miscível tanto em etanol como na substância utilizada na etapa seguinte (inclusão) para enrijecer a amostra. Essa substância intermediária é o xilol . Ao final desta etapa, os tecidos se tornam transparentes. 
 
3. Inclusão: Após a diafanização, a amostra é colocada em parafina (microscopia de luz) ou em resina (microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o calor promove a evaporação do xilol e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. O tecido embebido por parafina se torna rígido após ser retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em relação à parafina é que aquela produz menos artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa. 
4. Microtomia: Na penúltima etapa, os blocos de tecido são levados ao micrótomo para serem cortados em cortes finos de 1 a 10µm. A microtomia também pode ser efetuada em espécimes congelados, seja em nitrogênio líquido seja por congelamento rápido, no braço de um criostato a -20°C com uma lâmina de aço pré-resfriada. 
5. Coloração: As lâminas são, em seguida, coradas com corantes específicos para que possam ser visualizadas e diferenciadas as estruturas específicas que se quer observar. Os corantes são hidrossolúveis e podem ser acidófilos ou basófilos. Os corantes acidófilos, são básicos e coram estruturas teciduais ácidas como os ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA), o núcleo e os ribossomos. Como exemplo de corantes acidófilos, destacam-se a Hematoxilina, o Azul de Metileno e o Azul de Toluidina. Os corantes basófilos, são ácidos e coram estruturas teciduais básicas como as mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. Como exemplo de corantes basófilos, destacam-se a Eosina, Orande G, Fucsina ácida. 
3- Quais as principais diferenças na utilização de cultivos celulares e processamento histológico em estudos que envolvam análise biológica.
In vitro ("em vidro") é uma expressão latina que designa todos os processos biológicos que têm lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro. São amostras cultivadas em laboratórios, colônias de células usadas para experimentos.
Cultura de células primárias ou imortalizadas(comerciais ou não).
Vantagem = Patricidade
Desvantagem = Diferença em testes in vitro e in vivo.
In vivo (Latim: dentro do vivo). In vivo se refere a experimentação feita dentro ou no tecido vivo de um organismo vivo, por oposição a um parcialmente ou totalmente morto. Experimentos com animais e os ensaios clínicos são formas de investigação in vivo. Análise diretamente no organismo vivo.
Vários tipo de análises: 
Concentração de substâncias no sangue, urina, etc.
Comportamento.
Alterações morfológicas e histológicas.
Vantagem = Resultados reais
Desvantagem = Dificuldade
4-O que é microscopio de luz? Quais são os principais: a) componentes mecânicos;  b) componentes ópticos; e c) sistema de iluminação que o microscópio de luz possui? Descreva a função de cada um deles.
O microscópio de luz utiliza como fonte de iluminação a luz branca comum para permitir a observação de materiais. Esse instrumento fornece uma imagem consideravelmente aumentada, geralmente invertida verticalmente (de cima para baixo) e invertida horizontalmente (da esquerda para a direita), (invertida e rebatida).
Componentes mecânicos: 
Pé ou base: trata-se do apoio e do ponto de fixação do microscópio.
Braço ou coluna: está fixado à base e serve de estruturação para o restante do aparelho de microscopia.
Tubo ou canhão: serve de suporte para as lentes oculares.
Revólver: utensílio giratório que tem como função portar as lentes objetivas. 
Platina: serve como apoio para o material a ser observado, possui uma passagem de vidro por onde os raios de luz atravessam e também é dotada de parafusos dentados permitindo o deslocamento do material pela mesma.
Parafuso macrométrico: é um objeto passível de rotação e permite a movimentação vertical da mesa.
Parafuso micrométrico: por sua vez é responsável pelos movimentos verticais e sutis da mesa, permitindo aperfeiçoar a focagem.
Charriot: é responsável pela movimentação lateral da lâmina em observação, sendo possível analisá-la de forma totalitária.
Componentes ópticos: 
Lente ocular: é constituída por duas lentes que ampliam a imagem formada pelas objetivas e ajusta possíveis deficiências ópticas.
Objetivas: são um sistema de lentes com diferentes aumentos e seu número varia de acordo com o microscópio. 
Sistema de iluminação que o microscópio de luz possui:
Fonte de Luz: O espelho destina-se a refletir a luz que recebe da fonte luminosa para a platina (usa-se a face plana para refletir luz natural e a face côncava para refletir luz artificial).
Diafragma: Regula a quantidade de luz que vai atingir o campo do microscópio.
Condensador: É um sistema de duas lentes que distribui regularmente no campo visual do microscópio, a luz refletida pelo espelho ou diretamente da fonte luminosa.
5- Como se calcula o aumento final de cada lente objetiva do microscópio de luz?
Cálculo do aumento final = lente objetiva x lente ocular
Objetiva 4x X Ocular 10x = Aumento Final 40x
Objetiva 10x X Ocular 10x = Aumento Final 100x
Objetiva 40x X Ocular 10x = Aumento Final 400x
Objetiva 100x X Ocular 10x = Aumento Final 1000x
6- Quais os principais tipos de microscópio de luz e suas aplicações? (Descrever 3 tipos, pelo menos)
Microscópio de Luz Campo Claro: a luz passa através do espécime, fazendo com que a área observada apresente-se bem iluminada. Por ser simples, este tipo de microscópio é amplamente utilizado nos mais variados laboratórios de microbiologia. A dificuldade principal nesta microscopia luminosa está na possibilidade de obter uma maior ampliação, sem prejuízo na nitidez da imagem.
Microscópio de Luz Contraste de Fase: Tem como princípio a transformação dasdiferentes fases dos raios de luz. A imagem formada possui pequenas alterações no comprimento do trajeto óptico, ocasionando diferenças sutis em seu contraste. A lâmpada deste microscópio é direcionada propositalmente em um ângulo especializado, fazendo-a iluminar diretamente o espécime, ou ser difratada e retardada pelos gradientes de fase desse espécime. Este tipo de microscopia é um dos únicos capazes de formar imagens que podem ser vistas detalhadamente, sem a necessidade de as colorir. Um ponto de desvantagem na atuação deste instrumento óptico, é que na imagem formada, é comum em um contraste de fase o aparecimento de halos em torno do espécime.
Microscópio de Luz Fluorescência: usa uma lâmpada de mercúrio ou xenônio para produzir luz ultravioleta. A luz vem do microscópio e incide sobre um espelho dicróico - espelho que reflete comprimentos de onda de um determinado intervalo e permite que comprimentos de onda de outro intervalo passem através dele. O espelho dicróico reflete a luz ultravioleta até o espécime. Essa luz excita a fluorescência dentro das moléculas no espécime. A ultravioleta excita a fluorescência dentro das moléculas no espécime. A objetiva coleta a luz de comprimento de onda fluorescente que foi produzida. Esta luz fluorescente passa através do espelho dicróico e de um filtro de barreira (capaz de eliminar outros comprimentos de onda além do fluorescente), levando-a para formar a imagem na ocular.
Microscópio de Luz Confocal a Laser: A microscopia confocal permite a obtenção de imagens de alta resolução através de cortes ópticos, posteriormente agrupados para se fazer a reconstrução tridimensional da topografia de objetos complexos. Ela possibilita a eliminação de informações fora de foco da imagem, o que favorece a aquisição de amostras mais espessas, como biofilmes bacterianos, estruturas fúngicas, tecidos dentários e dentre outros tipos celulares.
7- Em que se baseia o funcionamento do microscópio eletrônico?
A microscopia ótica se baseia na possibilidade de formação de imagens ampliadas reais ou virtuais de objetos que são colocados diante de lentes esféricas. 
A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) emprega os feixes transmitidos e difratados, ao passo que a microscopia eletrônica de varredura (SEM) detecta os elétrons secundários e os elétrons refletidos em função da posição do feixe primário.
8- Faça uma comparação entre o microscópio de luz e o microscópio eletrônico, destacando 3 pontos que os diferenciam.
	Microscópio de Luz
	Microscópio Eletrônico
	Aumento de até 1.500x
	Aumento de até 150.000x
	Tamanho e forma da Célula
	Detalhes das estruturas internas da célula
	Cariótipo (Contagem de cromossomos)
	Não necessita de corantes (imagem sem cor)
	Necessita de corantes (imagem colorida)
	Estrutura bem maior
	Estrutura menor
	Superfície da célula (3D)
	Mais barato
	Mais caro
9- Defina: a) Poder de resolução, b) Limite de Resolução, c) Magnitude Total do Microscópio.
a) Poder de Resolução: imagem nítida do objeto observado (fineza de detalhes). 
 b) Limite de Resolução: distância entre 2 pontos para que apareçam individualizados. 
 c) Magnitude Total do Microscópio: é a ampliação conseguida pelo sistema de lentes do microscópio. 
10-Imagine uma situação onde técnicas de análise em citologia possam ser aplicadas no dia-a-dia da sua futura profissão, para responder questões relacionadas à problemas que devam ser resolvidos na sua área profissional. Descreva essa situação e simule um tipo de pesquisa, utilizando um dos exemplos abaixo como inspiração. Observe que no Exemplo 1, o tipo de estudo realizado é chamado estudo in vitro, porque envolve análises de células em culturas. Já no Exemplo 2, o tipo de estudo proposto é chamado in vivo, porque envolve utilização de cobaias vivas.
Exemplo 1:
"Como bióloga que estuda reprodução masculina, tenho interesse em saber se uma determinada droga que é usada como tratamento para infertilidade masculina possui algum efeito tóxico sobre o fígado, que é o local onde essa droga é metabolizada após ser ingerida. Então, vou administrar doses dessa droga sobre células hepáticas (células de fígado) que estão sendo cultivadas em vidrarias de laboratório, e verificar como essas células respondem ao tratamento, ou seja, verificar se as células continuam viáveis ou não após o tratamento."
Exemplo 2:
"Como bióloga que estuda reprodução masculina, tenho interesse em saber se uma determinada droga que é usada como tratamento para infertilidade masculina possui algum efeito cancerígeno sobre os testículos, que é o local onde essa droga irá atuar. Então, vou administrar doses dessa droga à algumas cobaias machos e, depois, verificar se houve desenvolvimento de algum tumor nos testículos das cobaias."
Resposta:
“Como enfermeira no hospital oncológico de Barretos, participo de uma pesquisa, em que temos o interesse de saber quais os danos que o Alcatrão, substância cancerígena presente no cigarro, provoca aos pulmões, já que é inalado diretamente, ao se fumar um cigarro. Então, administraremos doses dessa substância sobre as células de pulmão que estão sendo cultivadas em laboratório, e verificaremos como essas células respondem à substância. Verificaremos os danos causados às células e o tempo que levaram para causar esses danos.”