Bio cel cortes histológicos e microscopia

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Roteiro de Estudo - Disciplina: Biologia Celular
Profa. Dra. Marisa Ionta
Assunto: Métodos de estudo
1. Em relação ao microscópio de luz convencional:
1. Fale sobre o princípio de funcionamento, o conjunto de lentes e como as imagens são formadas aos olhos do observador;
R: 1 O princípio básico do microscópio óptico é ampliar e regular as estruturas invisíveis ou difíceis de serem visualizadas à olho nu.2 Esse tipo de equipamento é formado por duas lentes, ou dois sistemas de lentes. As lentes do microscópio composto são chamadas de lente objetiva e lente ocular. A lente objetiva é uma lente que fica instalada bem próxima ao objeto que se observa. Já a lente ocular fica bem próxima do olho do observador. 3 A luz, que incide sobre um condensador, atravessa o objeto e é encaminhada para o canhão de lentes convergentes, formado pela objetiva e a ocular. Quando o feixe luminoso atinge a lente objetiva, forma-se uma imagem intermediária e aumentada do objeto.
1. Qual é o limite de resolução? Quais são os fatores que limitam a resolução?
R: 1 O poder de resolução máxima (também chamado de resolução ou limite de resolução) do microscópio de luz é aproximadamente 0,2um; está resolução permite a obtenção de boas imagens aumentadas de 1000 a 1500 vezes. O que determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema optico é seu limite resolutivo e não seu poder de aumentar de tamanho dos objetos. O poder de resolução depente somente da lente objetiva, a lente ocular apenas aumenta a imagem projetada pela objetiva. 2 O limite de resolução é obtido com o menor comprimento de onda da luz visível e com a objetiva de maior abertura numérica.A análise da fórmula mostra que o limite de resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional à abertura numérica da objetiva.
1. Quais características devem ter a amostra?
R: Para ser observado ao microscópio óptico é necessário que o material seja translúcido, uma vez que a imagem ampliada forma-se depois de o feixe de luz atravessar o objeto e as lentes.
1. Em relação ao preparo de amostras biológicas para análise em microscopia de luz convencional:
1. Quais os tipos de fixação? 
R: Fixação química: os tecidos são geralmente imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas formando pontes com as moléculas vizinhas ( como demora um tempo para fixador difundir nos tecidos para facilitar tem que fazer cortes (fragmentos pequenos ) antes de serem imersos no fixador. –solução isotônica tamponada de formaldeído 4 %. – Glutaraldeido que preserva e fornece contraste aos lipídios e proteinas
Fatores que influencia a fixação Física: temperatura, ondas eletromagnéticas e agitação molecular.
Vaporização: A amostra de tecido é colocada por cima do vapor do fixador, ou seja, o fixador é aquecido ao ponto de começar a libertar vapor e é nesse mesmo vapor que a amostra é fixada. É necessário ter cuidado com este tipo de fixação porque, por vezes, os vapores libertados são demasiado perigosos para a saúde (exemplo: vapor do Formaldeído).
Perfusão: Fixação via fluxo sanguíneo. O fixador é injetado no coração com volume de injeção que combina com o fluxo de saída cardíaca. O fixador espalha-se através do corpo inteiro, e o tecido não morre até que esteja fixo. Isto tem a vantagem de preservar perfeitamente a morfologia, mas as desvantagens estão em que o ser vivos em questão morre e o custo é elevado (por causa do volume de fixador necessário para organismos maiores).
Imersão: A amostra de tecido é imersa em fixador de volume no mínimo de 2/3 maiores que volume do tecido a ser fixado. O fixador deve se difundir através do tecido de maneira a fixar, tanto o tamanho e a densidade do tecido, como também o tipo de fixador deve ser tomado em consideração. O uso de uma amostra maior tornará o processo mais demorado para o fixador alcançar o tecido mais profundo.
1. Qual o objetivo da fixação?
Fixação: (tratamento das amostras para evitar a digestão de tecidos por enzimas presentes no interior das células ou por bactérias e também para preservar estrutura e composição molecular e também endurecer os fragmentos )
1. Considerando a fixação mediada por agentes químicos, quais reagentes são frequentemente utilizados e quais suas características em relação a preservação dos componentes celulares?
R: - Solução isotônica tamponada de formaldeído 4 % e Glutaraldeido que preserva e fornece contraste aos lipídios e proteínas. O formaldeído e glutaraldeido, são conhecidos por regirem com o grupo amina NH2 das proteínas dos tecidos, no caso do glutaraldeido, a sua ação fixadora é reforçada pelo fato de ser dialdeido a promove a formação de ligações cruzada com proteínas. 
1. O que você entende por artefato de técnica?
R: Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura original ao máximo possível. Entretanto, isso não é possível e todos os preparados apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas.
1. Quais os meios de infiltração são comumente utilizados?
R: Infiltração: Para obter secções delgadas, os fragmentos de tecidos e órgãos devem, após a fixação, ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem uma rigidez, em um processo chamado de infiltração. As substâncias mais utilizadas para esse fim são a parafina e resinas de plástico. Criostato: aparelho que congela as amostras para prepara-las para corte.
1. Qual seria o meio de infiltração mais adequado para se obter corte mais finos?
R: Para a obtenção de cortes histológicos mais finos, é utilizado o criostato, um aparelho próprio para esses tipos de cortes. Esse tecido é passado por um congelamento rápido (método físico), ficando rígidos e, assim, prontos para serem seccionados pelo criostato.
1. Quais são as vantagens de se obter cortes mais finos?
R: Para permitir passagem do feixe de luz a amostra deve ser seccionada para se obter cortes mais finos 
1. Quais as etapas principais no processamento de uma amostra, cujo material de infiltração é a parafarina?
R: Impregnar os tecidos com parafina chama-se inclusão ou endebição. 1- Desitratação: água é extraída passando por diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de etanol em água ( entanol 70% e etanol 100%) após essa desidratação o etanol presente nos fragmentos deve ser substituído por uma substancia intermediaria ( solvente orgânico: xilol) que é missivel tanto em etanol como a parafina. Quando os fragmentos de tecidos são embebidos (molhar) e saturados com xilol ficam transparentes ou translúcidos.( Clareamento ) A seguir são colocados em parafina previamente derretida em uma estufa normalmente entre 58 a 60 graus. O calor causa a evaporação do solvente e os espaços existentes dentro dos tecidos são preenchidos com parafina. O tecido embebido em parafina se torna rígido depois de ter sido tirado da estufa. No caso de tecidos serem embebidos com resina plástica, eles também são desidratados em etanol e dependendo do tipo de resina usada, depois são infiltrados com solvente do plástico. Os blocos rígidos que contem os tecidos são então levados a um micrótomo onde são seccionados por uma lamina de aço de modo a fornecer cortes de 1 a-10um de espessura .Apos serem seccionados os cortes são colocados para flutuar sobre uma superfície de agua aquecida, de onde são colocados sobre as laminas de vidro, onde aderem e onde serão corados. 
1. Fale sobre as propriedades da hematoxilina e eosina, substâncias rotineiramente utilizadas no processo de coloração de amostras biológicas.
R: Hematoxilina(básica): componentes dos tecidos que reagem com corantes básicos (hematoxilina) o possuem ácidos na sua composição. Com característica basófila. Com colocaração azul purpura. Eosina( acida) : reage com tecidos básicos. Com característica acidófila. Com coloração vermelha.
1. O que se entende por estruturas basófilas e acidófilas em preparações histológicas?
R: Os tecidos e órgãos que reagem comum corante básico são chamados basófilos e as estruturas que reagem com um corante ácido são chamadas acidófilas.
1. Fale sobre o princípio de funcionamento e aplicabilidade:
1. Microscópio de contraste de fase
R: É baseado no fato de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes. Essas mudanças são usadas pelo sistema de contraste de fase para fazer com que as estruturas apareçam mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta poderosa para observar celular vivas.
1. Microscópio de fluorescência
R: Na microscopia de fluorescência as secções de tecidos são geralmente irradiadas como luz ultravioleta e emitem luz na porção visível dos espectros, fazendo com que as substancias fluorescentes apareçam brilhantes sobre um fundo escuro. O M.F possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atinge o espécime e também dos raios que são emitidos pelo espécime. Substancias fluorescente com afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz podem ser usadas como corantes fluorescentes como o alaranjado de acridina que pode combinar-se com o RNA e DNA. Quando observado em um MF, o complexo de DNA alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde amarelada e o complexo de DNA alaranjados de acridina emite fluorescência vermelha alaranjada. Assim é possível identificar e localizar os dois tipos de ácidos nucleicos nas células através da MF.
1. Microscopia confocal
R: Uma das características mais importantes do MC é o fato de que ele torna possível focalizar o plano de foco muito delgado do espécime. Baseado
 1- o espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito 
2- a imagem coletada do espécime deve passar por um pequeno orifício. A consequência desse arranjo é que só a imagem originada do plano localizado alcança o detector, enquanto as imagens de plano planos anteriores e posteriores são bloqueados. A luz proveniente de fora do plano de foco é em grande parte eliminada, a definição do objeto focalizado fica melhor e a localização de componentes do espécime pode ser feita com muito mais precisão que o microscópio de luz.
A iluminação é provida por uma fonte de laser, como esta fornece um ponto de iluminação muito pequeno, ele deve ser varrido sobre os espécime para permitir a observação de uma área maior do espécime. O componente do espécime que é de interesse deve ser marcado como uma molécula fluorescente, a luz usada para formar uma imagem é aquela que é refletida pelo espécime, a luz refletida é capturada por um detector onde o sinal é ampliado eletronicamente para ser visto em um monitor. Para realizar todas estas funções os microscópios confocais depende de grande capacidade de computação. 
1. Microscópio eletrônico de transmissão
R: O microscópio eletrônico de transmissão é um sistema de produção de imagens que teoricamente permite uma altissima resolução (0,1 nm). Na prática, porém, a resolução obtida pela maioria dos bons instrumentos se situa ao redor de 3 nm, resolução que permite que espé cimes ampliados até 400.000 vezes sejam vistos com de talhes. Infelizmente, este nível de ampliação só pode ser usado para analisar partículas ou moléculas isoladas, pois cortes delgados de células e tecidos podem ser observa dos com detalhes em aumentos de até cerca de 120.000 vezes. O funcionamento do microscópio eletrônico de trans missão se baseia no seguinte principio: elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de uma maneira semelhante à refração produzida na luz por lentes de vi dro. Elétrons são liberados pelo aquecimento de um deli cado filamento metálico (geralmente tungstênio) em vácuo. Os elétrons libertados por este filamento (chamado de catodo) são então submetidos a uma diferença de voltagem de 60-120 kV existente entre o catodo e o anodo, que é um prato metálico com um orificio em seu centro (Fig. 19). Desta maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e ace lerados, atingindo altas velocidades. Após atravessarem o orificio do anodo eles formam um feixe de elétrons que percorre o tubo do microscópio. No tubo, a feixe de elé trons passa pelo interior de bobinas elétricas e é desviado de maneira análoga ao que acontece com um feixe lumi noso em lentes de vidro, porque elétrons desviam seu tra jeto quando são submetidos a campos magnéticos. Por esta razão, as bobinas dos microscopios eletrônicos são chama das de lentes 
eletromagnéticas.
1. Microscópio eletrônico de varredura
R: Um feixe muito pequeno de elétrons é movido sequencialmente de modo a esquadrinhar (varrer) o espécime. Diferentemente do microscópio eletrônico de transmissão no MV os elétrons não atravessam o espécime. Os elétrons interagem com a camada muito delgada de metal previamente aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal. Esses elétrons são capturados por um detector que os transmite a amplificadores e outros dispositivos de forma que sinal é finalmente projetado em tubos de raios catódicos resultando em uma imagem preta e branca. MV mostra somente uma visão de superfícies, o interior de órgãos podem ser analisados congelando células e em seguida fraturando-as para expor a suas superfícies. 
1. Criofatura: 
R: O que é Criofatura e quando surgiu?
Criofratura é, basicamente, uma maneira eletrônica de se fazer microscopia. Nesse procedimento, é utilizado o composto nitrogênio (identificado pela letra N na tabela periódica) em sua forma liquida afim de congelar amostragem, para que assim, seja possível realizar um estudo mais detalhado do caso, uma vez que, após esse congelamento em nitrogênio liquido é possível fazer a trincamento dos lipídios, favorecendo assim, a amostra de suas camadas bilaterais e deixando avista os rostos das membranas presentes nas células.
O processo de criofratura surgiu em meados do século XX (por volta da mesma época em que surgiram o microscópio óptico e o microscópio eletrônico).
 
Membrana dividida através de criofratura
Realização do processo de criofratura
É possível notar que o procedimento de criofratura é deveras sofisticado quando comparando com outros processos, como por exemplo, o recurso em que uma célula recebe um banhamento em parafina para, posteriormente, realizar os cortes na mesma afim de realizar a visualização/estudo em microscópio.
Como citado anteriormente, o processo começa pelo congelamento da célula em nitrogênio liquido. Posteriormente, ocorre o fraturamento. Com isso, ocorre a pulverização com platina e posteriormente carbono e, além disso, acontece a digestão dos restos celulares, ou seja, é digerido toda parte biológica restando assim apenas essa réplica formada por platina e carbono. Criando, dessa maneira, o que é denominado molde. Dessa forma, é feito o estudo no molde com a microscopia eletrônica para verificar quais são os padrões visualizados na amostra.
 
Ilustração de uma membrana a ser utilizada na criofratura
Propósito de realização do pocesso
Devido ao preparamento dado as células, isto é, das amostras, é possível que seja formado o que é denominado de "artefato" que se refere a estruturas que podem enganar os estudiosos da área em uma primeira visualização, pois parecem ser estruturas das células, mas na verdade, não são. Então, uma das maneiras de estudar em laboratório assuntos como membranas celulares, proteínas presentes em membranas é utilizar o método da criofratura, pois nesse recurso, utilizando o ultimo exemplo, é possível visualizar a posição ocupada pelas proteínas. Além disso, o procedimento permite, em outro caso, ter conhecimento das estruturas internas da célula, pois como a mesma está congelada no momento da fratura e, posteriormente, da abertura, não haverá extravasamento do material interno importante para o estudo.
Criofratura: conclusões
Então, basicamente, o estudo de células através da criofratura é feito de acordo com o seu próprio nome, isto é, criando-se uma fratura na amostra para que posteriormenteseja feito o estudo da mesma. Assim, verificamos, até aqui, que o método da criofratura é um recurso altamente avançado e que permite a evolução da ciência através do seu aproveitamento.
Estudo das células
A criofratura é apenas uma das muitas maneiras que se tem para estudar as células. E quando falamos de estudos celulares é importante ressaltar que este é um estudo vasto e antigo, sendo iniciado em 1665. Portanto não existe um método melhor para realizar o estudo celular, e sim, o que existe é o estudo mais adequado para a ocasião, dependendo de vários fatores, como por exemplo, material a ser estudado, o propósito do estudo a ser feito, o nível de precisão que o estudo precisa ter, o resultado final esperado entre outros fatores. 
Dessa forma, outros estudos que contemplam o estudo celular ao lado da criofatura são a cultura celular que se baseia no cultivo em vitro de células (podendo ser de origem vegetal ou animal). Temos, também, a microscopia de luz, que é um instrumento utilizado para alcançar uma ampliamento visual da célula afim de trazer maiores detalhes para o estudo. Com isso, estes estudos contribuem diretamente para o avanço científico, ultrapassando barreiras tecnológicas que nos permite continuar imaginando o que ainda temos a descobrir para a complementação do conhecimento humano
1. O que se entende por estruturas elétron-densas e elétron-lucidas nas imagens geradas por microscopia eletrônica de transmissão?
R: A imagem resultante da microscopi eletrônica é sempre preta e branca. As áreas escuras de uma micrografia eletrônica costumam ser dominadas de elétrons densas, enquanto as áreas claras são chamadas de eltrons lucentes ou transparentes. 
1. O que são fluorófloros? Como são empregados na análise de amostras biológicas?
 R: Os fluoróforos são moléculas que absorvem fótons com energia de determinado espectro de excitação e reemitem fótons com energia em determinado espectro de emissão (ou de fluorescência). Mais de um fluoróforo pode ser utilizado ao mesmo tempo em uma amostra, registrando diferentes estruturas ou processos da amostra.
Um fluoróforo ou fluorocromo, por analogia com os cromóforos, é um componente de uma molécula que faz com que esta seja fluorescente. É um grupo funcional da molécula que absorverá energia de um comprimento de onda específica e posteriormente a emitirá em outro determinado comprimento de onda maior.
Utilizado como corante fluorescente.
1. Fale sobre o processo de imunofluorescência direta e indireta? Quais as vantagens e desvantagens no emprego desses procedimentos?
R: Imunofluorescência Direta é uma técnica mais simples. As etapas do procedimento são:
1. Confecção do material na lâmina;
2. Fixação com anticorpos escolhidos;
3. Incubação;
4. Lava-se a lâmina removendo excesso de anticorpos marcados não ligados;
5. Visualização no microscópio (lembrando: sempre microscópio Uv nunca microscópio convencional).
Na imunofluorescência indireta a placa de fluorescência já vem com os antígenos específicos sem fluorocromos, testa-se o soro do paciente e depois adiciona-se um anti-anticorpo marcado com fluorocromo, dizemos que essa técnica é de camada dupla pois há uma dupla camada de ligação de antígenos e anticorpos para ligar-se e emitir a fluorescência para ser medida pelo comprimento de onda.
Vantagens
• Possibilita uma ótima fluorescência;
• Permite-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos para vários sítios de antígenos, sendo eficaz na identificação ao qual o anticorpo pertence, abrangendo o campo de diagnóstico mais preciso.
• Ambas possuem uma grande sensibilidade ao teste, e não demandam muito tempo de realização; Especificidade, reprodutibilidade, simples padronização, são capazes de localizar antígenos intra e extracelulares.
 
Desvantagens
Está na intensidade dos fluorocromos que às vezes dificultam o diagnóstico, a metodologia é cara e o custo da manutenção dos aparelhos e do microscópio é alta, a técnica é realizada manualmente podendo ocasionar erros e subjetividade na leitura.
Diferenças
A imunofluorescência direta é mais simples que a indireta e mais barata, mas dependendo do diagnóstico a ser feito e o material, escolhe-se a indireta pela possiblidade de diagnóstico mais preciso. A Imunofluorescência direta é mais utilizada em histologia e a Imunofluorescência indireta mais em sorologia em humanos e animais.
HISTOPATOLÓGICA
1. Coleta
É a primeira etapa e consiste na retirada de uma amostra de tecido para a investigação, chamadas de biópsias:
1. Biópsia cirúrgica: através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido.
2. Biópsia endoscópica: para órgãos ocos, como estômago e intestino.
3. Biópsia por agulha: é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural.
4. Cirurgia ampla: corresponde a peças grandes (tumores) ou órgãos (mama e útero).
5. Necrópsia: pós morte para verificar a causa do óbito.
Essa amostra removida durante uma biópsia é chamada de espécime. Os cassetes histológicos são usados para acomodar esses espécimes e também durante todas as etapas de preparação do tecido.
2. Fixação: Ao se remover qualquer material (órgão ou tecido) de um organismo se inicia um processo de autólise (autodigestão). A fixação evita a autólise celular e impede a proliferação de microrganismos, preservando a morfologia do tecido e fornecendo maior resistência para as etapas seguintes.
Dessa forma, a fixação utiliza processos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos. Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin.
3. Desidratação: Consiste na remoção da água dos tecidos. Vários métodos são utilizados, porém o mais comum compreende uma série de soluções alcoólicas em concentrações diferentes, chegando até o álcool 100%.
4. Clarificação ou diafanização: Essa etapa remove totalmente o álcool, preparando o espécime para a etapa seguinte. Para remover o álcool e preparar o tecido para a penetração da parafina, utiliza-se o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substituição ao álcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razão, é denominada de clarificação.
5. Inclusão: Mesmo após a fixação e a desidratação, as amostras de tecido são ainda muito frágeis. Acontece então a impregnação do tecido com uma substância de consistência firme. Assim o tecido é endurecido, o que facilita o corte em camadas finas.
A parafina é a mais utilizada neste procedimento. Além do fácil manuseio e bons resultados, endurece em poucos minutos e preenche os lugares anteriormente ocupados pela água. Forma-se um bloco de parafina, que contém o espécime em seu interior.
Os cassetes histológicos são utilizados durante todos os processos, até mesmo na inclusão. Eles permitem escrever o número de registro do material, identificando o espécime. Também são importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrótomo.
6. Microtomia: Depois de endurecido, o bloco de parafina deve ser cortado em seções extremamente finas, que permitam a visualização do tecido ao microscópio. Para isso, é utilizado o equipamento de precisão micrótomo, que alcança a espessura dos cortes de 5 a 15 μm (micrômetros)1 micrômetro (μm) é igual a 1/1.000 de 1 milímetro (mm). Assim, os cortes dos tecidos, extremamente finos e transparentes, são montados em lâminas de vidro.
7. Coloração: Como as seções de parafina são incolores, os espécimes não estão ainda adequados para exame com microscópio de luz. São então corados para possibilitar a análise. A parafina deve ser dissolvida e removida. Em seguida os tecidos na lâmina são reidratados por meio de uma série de soluções de álcool em concentrações decrescentes. Os cortes de tecido podem então ser corados com hematoxilina. Por sua natureza básica, a hematoxilina vai corar os ácidos nucleicos dos núcleos.
Em seguida, os cortes são lavados em e corados pela eosina, um corante de natureza ácida e que irá corar os componentes básicospredominantes no citoplasma das células. Finalmente após a coloração, os cortes são protegidos por uma lamínula e podem ser analisados por microscopia.
Técnicas de microscopia
As lentes, os filtros e a iluminação do microscópio podem ser manipulados para ampliar, resolver e intensificar uma variedade de imagens. O tipo de amostra usada e a documentação que necessita fazer determinam qual o método a ser escolhido, são eles:
Campo Claro;
Campo Escuro;
Contraste de Fases;
Contraste interferencial;
Polarização;
Fluorescência.
 
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
Essa é a técnica mais comumente usada, quando a luz passa através da amostra, fazendo com que a área observada seja bem iluminada. O feixe de luz passa através da amostra sendo captado pela objetiva. O microscópio usado pela maioria dos estudantes e pesquisadores é o microscópio de campo claro.
Aplicação: muito usado para o exame de rotina das lâminas histológicas, visualização de tecido células, microrganismos nos laboratórios de análise clínica e pesquisa.
MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO
Alguns raios luminosos incidem na amostra e são captados pela lente objetiva, o que gera “figuras” luminosas em um fundo escuro, por isso o nome dessa técnica. Apenas a luz que foi dispersa ou refratada pelas estruturas na amostra alcançam a lente. É o mesmo princípio que nos permite ver as estrelas a noite ou as partículas de pó no feixe de luz em um projetor numa sala escura.
Aplicação: indicada para amostras com pouco contraste. Na prática clínica, o microscópio de campo escuro serve para examinar a existência de cristais na urina, como os de ácido úrico e oxalato, e identificar bactérias como espiroquetas, em particular Treponema pallidum, microrganismo responsável pela sífilis.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES
O microscópio de contraste de fase é também uma adaptação do óptico e utiliza um sistema de lentes que transforma diferenças de fase (índice de refração que não pode ser visto) em diferenças de intensidade.(visível.) ( transforma diferentes fases do raio de luz em diferenças luminosas ). A luz atravessa diferentes quantidades de matéria, o que gera diferentes índices de refração, ou em outros termos, quanto maior a quantidade de matéria, menor o índice de refração. Porções escuras da imagem correspondem a porções densas do espécime, porções claras da imagem correspondem a porções menos densas do espécime.
Aplicação: possibilita o exame de células e tecidos não corados e é muito usado para análise de células vivas (geralmente em cultura), microrganismos, seções de tecidos finos, fibras, dispersões de látex, partículas subcelulares (incluindo o núcleo e outras organelas), diagnóstico de células tumorais, hematologia, virologia, bacteriologia, parasitologia e biologia marinha.
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
O microscópio de polarização é uma modificação simples do microscópio óptico, no qual um filtro polarizante (o polarizador) está localizado entre a fonte de luz e o espécime, e um segundo polarizador (o analisador) está localizado entre a lente objetiva e a ocular. Esses filtros modificam a luz e são eficientes na análise de materiais biorrefringentes (que produzem dupla refração). Inicialmente foi usado para estudo de minerais, porém hoje também é usado na biologia, medicina, etc. A técnica explora as propriedades ópticas para revelar informações detalhadas sobre a estrutura e composição dos materiais.
Aplicação: Muito utilizada para estudos de petrografia e mineralogia. Em materiais biológicos usa-se para o estudo de paredes celulares, moléculas de DNA, células musculares estriadas, espermatozoides, colágenos, detecção de substâncias minerais em tecidos diferentes, entre outros.
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Uma molécula com propriedade fluorescente emite luz com comprimento de onda na faixa visível quando exposta a uma fonte ultravioleta (UV). O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas moléculas em fluorescer sob luz ultravioleta, visualizando moléculas autofluorescentes, como a vitamina A, ou ainda marcando as amostras, com a fluorescência introduzida. A excitação e a emissão de luz das moléculas fluorescentes são reguladas por filtros para promover cor e contraste.
As obs dos espécimes é feita através da fixação de substancias fluorescentes (fluoro e cromos), que, ao receberem luz, podem ser observados através do brilho gerado. 
Aplicação: detecção de antígenos ou anticorpos nos procedimentos de coloração imunocitoquímicos, moléculas fluorescentes específicas também podem ser injetadas em um animal ou diretamente em células, e usadas como rastreadores. Tais métodos são úteis para estudar as junções intercelulares (gap), rastrear a via de fibras nervosas na neurobiologia e detectar marcadores de crescimento em tecidos mineralizados.