MICROSCOPIA

Prévia do material em texto

FUNDAÇÃO EDSON QUEIROZ 
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA – UNIFOR 
CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS – CCT 
CURSO DE ENGENHARIA ELÉTRICA 
DISCIPLINA: QUÍMICA E MATERIAIS ELÉTRICOS 
PROFESSOR: JORGE ANDRÉ C. DOS SANTOS 
MICROSCOPIA ÓTICA; MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA; 
MICROSCOPIA DE VARREDURA ELETRÔNICA; MICROSCOPIA DE 
FORÇA ATÔMICA; MICROSCOPIA DE TUNELAMENTO 
Jomcy dos Santos Rocha 
Maio/2016 
1. INTRODUÇÃO 
Este trabalho trata sobres os tipos de microscopias sendo eles: Microscopia ótica; Microscopia 
de fluorescência; Microscopia de varredura eletrônica; Microscopia de força atômica; Microscopia de 
tunelamento. E tem por objetivo caracterizar os tipos de microscopias relacionados acima, bem como 
comparar as vantagens e as desvantagens de suas aplicações. 
 
2. TIPOS DE MICROSCOPIA 
 
2.1. MICROSCOPIA ÓTICA 
 
2.2.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS 
A microscopia óptica possibilita o aumento de imagens através da luz que, após incidir sobre a 
amostra, passa por um conjunto de lentes objetivas (que formam e aumentam a imagem) e oculares 
(que aumentam a imagem). 
Além de ampliar a imagem de um objeto, o microscópio serve para aumentar o poder de 
resolução do olho humano (0,1 - 0,2 mm). Poder de resolução é a capacidade de distinguir dois 
pontos muito próximos um do outro. Os microscópios ópticos têm um limite de resolução da ordem 
de 0,2 µm, ou seja, as lentes destes microscópios conseguem mostrar dois pontos distintos se estes 
estiverem separados por distâncias de pelo menos 0,2 µm. É importante lembrar que, para uma 
estrutura ser observada através de um microscópio óptico, é necessário que ela seja suficientemente 
fina para deixar que os raios luminosos a atravessem, além de ter índices de refração ou coloração 
diferentes do meio que a circundam. 
A observação das estruturas encontradas na natureza utilizando microscopia ótica, como uma 
extensão natural da observação a olho nu, representou papel importante no surgimento das ciências 
da natureza, tanto das ciências biológicas, como a histologia, anatomia, etc. assim como em 
mineralogia, petrografia, gênese de rochas, etc. e continua uma técnica importante hoje em inúmeras 
áreas da ciência, complementada 
pelas técnicas de microscopia 
eletrônica. A partir de 1863, quando 
Sorby apresentou à Royal Society 
suas observações sobre as estruturas 
dos aços, a observação dos materiais 
por microscopia ótica esteve sempre 
presente no centro do conjunto das 
tecnologias e de campos da ciência 
que viriam a se aglutinar no que é 
hoje conhecido como “Ciência e 
Engenharia dos Materiais” 
 
2.1.1. VANTAGENS E DESVANTAGENS 
As vantagens e desvantagens do microscópio de luz referem-se à luz, ampliação e resolução. 
Microscópios de luz ampliam a luz visível - uma vantagem óbvia, uma vez que é isto o que os nossos 
olhos podem ver. Porém, a ampliação (quão grande um objeto aparece) e resolução (a clareza de 
detalhes) estão limitados ao usar microscópios de luz. 
Fonte de Luz: Microscópios de luz ou usam um espelho refletor ou uma luz elétrica para 
iluminação direta através da amostra e para o sistema de lentes. Sistemas de espelhos são menos 
caros, mas exigem uma adequada iluminação do ambiente e mais paciência para ajustar. Sistemas de 
luz elétrica são mais caros e exigem uma tomada por perto, mas são mais simples de usar. 
Intensidade da Luz: Intensidade de luz (brilho) é importante, pois a luz passa através da 
amostra que você está vendo. Amostra fina, translúcida (claro) é mais bem visualizada com luz de 
baixa intensidade, enquanto que amostras mais grossas e opacas exigem uma luz de maior 
intensidade. Uma desvantagem da microscopia de luz é que algumas amostras são muito espessas ou 
opacas para serem vistas por esse tipo de microscópio. Amostras muito finas ou translúcidas podem 
ser coradas de modo a aumentar o contraste para melhor visualização. No entanto, este processo irá 
matar espécimes vivos. 
Ajustando Intensidade da Luz: O diafragma, localizada acima da fonte de luz e por baixo da 
platina (plataforma de amostra), ajusta a quantidade de luz que passa através do espécime. Dois tipos 
de diafragmas estão disponíveis: um seletor fixo de abertura e uma abertura ajustável estilo câmera. 
A de abertura fixa consiste em vários tamanhos diferentes de aberturas numa placa rotativa. A 
abertura desejada é selecionada girando o seletor. Diafragmas de abertura fixa são menos caros, mas 
oferecem menos controle preciso sobre a intensidade da luz. 
Diafragma de abertura ajustável fornece tamanho de abertura continuamente variável, assim 
como o f-stop em uma lente de câmera, e, assim, proporciona um controle mais preciso sobre a 
intensidade da luz. Estes sistemas são mais caros. 
Ampliação: Maior nem sempre é melhor. Microscópios de luz podem ampliar objetos até 
1000x (mil vezes maior que a vida) muito bem. Além de que a imagem se torna cada vez mais 
distorcida e embaçada. Aumento do tamanho não faz uma imagem melhor, e de fato faz a imagem 
inutilizável. 
Usando ampliação até 1000x, todos os tipos de organismos vivos podem ser vistos, até as 
menores células bacterianas. Isto faz com que a microscopia de luz, uma ferramenta poderosa para o 
estudo de tipos de células, da água da lagoa, amostras de solo e outros estudos, onde uma visão geral 
dos microorganismos é desejada. Microscopia de luz, no entanto, são pouco úteis para o estudo das 
estruturas subcelulares, por causa dos limites de resolução inerente no uso de luz. 
Resolução: A resolução é uma medida da clareza de um bom detalhe produzido em uma 
imagem. Imagens de baixa resolução aparecem borradas, ou "indistintas". Imagens de alta resolução 
são nítidas, claras e detalhadas. A maior desvantagem dos microscópios de luz é o limite de 
resolução. Além do aumento de 1000x, microscópios de luz rapidamente perdem a capacidade de boa 
resolução de pequenos detalhes. Isto resulta das propriedades físicas da luz, não da qualidade do 
instrumento. Para melhor resolução de detalhes de estruturas subcelulares, outras tecnologias, como 
microscópios eletrônicos devem ser usados. 
 
2.3. MICROSCOPIA DE FLOURESCÊNCIA 
 
2.3.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS 
Entende-se por fluorescência a propriedade que algumas substâncias possuem, após serem 
excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, resultando na emissão de radiação de maior 
comprimento de onda. Assim, determinadas substâncias absorvem a energia da luz ultravioleta e 
emitem depois radiação dentro do espectro de luz visível. 
A microscopia de fluorescência usa uma lâmpada de mercúrio ou xenônio para produzir luz 
ultravioleta. A luz vem do microscópio e incide sobre um espelho dicróico - espelho que reflete 
comprimentos de onda de um determinado intervalo e permite que comprimentos de onda de outro 
intervalo passem através dele. O espelho dicróico reflete a luz ultravioleta até o espécime. Essa luz 
excita a fluorescência dentro das moléculas no espécime. A ultravioleta excita a fluorescência dentro 
das moléculas no espécime. A objetiva coleta a luz de comprimento de onda fluorescente que foi 
produzida. Esta luz fluorescente passa através do espelho dicróico e de um filtro de barreira (capaz de 
eliminar outros comprimentos de onda além do fluorescente), levando-a para formar a imagem na 
ocular. 
As moléculas fluorescentes dentro do espécime podem ocorrer naturalmente ou ser 
introduzidas. Por exemplo, é possível colorir células com um corante chamado calceína-AM. Essa 
tinta, por si mesma, não é fluorescente. A porção AM (acetoximetil) da molécula oculta uma porção 
da molécula de calceína que liga o cálcio, este sim, fluorescente. Quando se faz a mistura da 
calceína/AM com a solução quebanha as células, o corante se hibridiza na célula. As células vivas 
têm umaenzima que remove a porção AM e prende a calceína dentro da célula fazendo com que ela 
ligue o cálcio tornando-o verde fluorescente sob a luz ultravioleta (células mortas deixam de ter essa 
enzima). Em seguida, as células vivas ficam verde-fluorescentes, ao passo que as células mortas não 
ficam fluorescentes. Podem-se ver as células mortas no mesmo espécime misturando-se outro 
corante chamado iodeto de propídio, que penetra apenas nas células mortas. O iodeto de propídio se 
liga ao DNA no núcleo e fica com a cor 
fluorescente vermelha sob a luz ultravioleta. 
Essa técnica de duplo corante é usada em 
estudos toxicológicos para determinar a 
porcentagem da população de células que 
perece quando tratada por um produto 
químico de proteção ambiental (como um 
pesticida, por exemplo). 
 
 
 
 
2.1.2. VANTAGENS E DESVANTAGENS 
As técnicas de microscopia de fluorescência são úteis para exibir estruturas e mensurar eventos 
fisiológicos e bioquímicos nas células vivas. Existem vários indicadores fluorescentes para o estudo 
de muitos produtos químicos fisiologicamente importantes como DNA, cálcio, magnésio, sódio, pH e 
enzimas. Além disso, os anticorpos específicos de várias moléculas biológicas podem estar 
quimicamente ligados às moléculas fluorescentes e ser usados para manchar estruturas específicas 
dentro das células. 
Permite o estudo e a observação de células vivas 
Como apenas a luz reflectida é observada, enquanto a transmitida é eliminada do campo de 
visão, cria maior intensidade e a definição da imagem é superior. 
Preparações não permanentes, a técnica de fluorescência vai decaindo, ou seja, ao fim de algum 
tempo de permanência do fluorocromo nas células, o seu efeito desaparece. 
Observação das preparações tem de ser efectuada em sala escura, devido à fraca adaptação do 
olho humano ao escuro, poderá ser difícil a observação de amostras durante algum tempo após o 
escurecimento da sala. 
 
2.4. MICROSCOPIA DE VARREDURA ELETRÔNICA 
 
2.4.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS 
A microscopia eletrônica de varredura é a técnica de caracterização microestrutural mais 
versátil hoje disponível, encontrando aplicações em diversos campos do conhecimento, mais 
particularmente engenharia e ciências de materiais, engenharias metalúrgica e de minas, geociências 
e ciências biológicas, dentre outros. A interação de um fino feixe de elétrons focalizado sobre a área 
ou o microvolume a ser analisado gera uma série de sinais que podem ser utilizados para caracterizar 
propriedades da amostra, tais como composição, superfície topográfica, cristalografia, etc. 
 
Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior interesse referem-se usualmente às 
imagens de elétrons secundários e de elétrons retroespalhados, ao passo que na microssonda 
eletrônica o sinal de maior interesse corresponde aos raios X característico, resultante do 
bombardeamento do feixe de elétrons sobre a amostra, permitindo a definição qualitativa ou 
quantitativa dos elementos químicos presentes em um microvolume. 
 
Historicamente, estas duas técnicas referiam-se a instrumentos algo similares, porém com 
aplicações e características construtivas bem distintas. Com o passar dos anos estes instrumentais 
foram convergindo de forma a incorporar as principais vantagens de cada um deles, inclusive com o 
surgimento de equipamentos híbridos, aliando recursos de imagem com os de microanálise química. 
 
Atualmente, toda a configuração de um microscópio eletrônico de varredura destinada a 
aplicações em materiais, metalurgia, mineração e geociências conta com pelo menos um detetor para 
microanálises químicas. Comparativamente à microssonda eletrônica, a microscopia eletrônica de 
varredura é hoje uma técnica mais versátil e operacionalmente mais simples, hoje integralmente 
operada via computador em ambientes Windows ou Unix, apresentando relação custo/benefício 
significativamente inferior. 
 
Ressalta-se que a microssonda eletrônica, no entanto, continua sendo o instrumental mais 
indicado para rotinas de microanálises químicas quantitativas, particularmente no caso da 
determinação de elementos menores ou em situações que requeiram maior resolução espectral. 
 
2.4.2. VANTAGENS E DESVANTAGENS 
A utilização das imagens eletrônicas de MEV, associadas a dados químicos semi-quantitativos 
de EDS, possibilitam o aprimoramento de estudos gemológicos, principalmente na caracterização de 
inclusões nos minerais-gema. A magnificação obtida com as imagens eletrônicas de varredura, 
proporciona uma observação detalhada da morfologia das inclusões, enquanto as análises de EDS 
fornecem uma estimativa composicional, conferindo uma precisão que não era possível através de 
outras técnicas tradicionais. Nos exemplos citados neste trabalho, apesar da utilização de microscopia 
óptica (microscópio petrográfico, metalográfico e gemológico), a correta identificação de algumas 
inclusões sólidas só foi possível com o emprego do MEV/EDS. Como toda técnica analítica, o 
MEV/EDS apresenta suas limitações, como na identificação de polimorfos, uma vez que a análise 
química é semi-quantitativa. Além disso, elementos com baixo Z (< 4) não são identificados pelo 
detector EDS, o que pode dificultar a identificação de determinadas fases minerais. Como uma 
vantagem adicional, pode-se citar a facilidade na seleção e preparação das amostras, uma vez que é 
possível utilizar-se desde fragmentos de amostras brutas não polidas, até lâminas delgadas e inclusive 
amostras lapidadas se for necessário. Como é um método não destrutivo, as amostras podem ser 
arquivadas para estudos posteriores ou direcionadas para outras análises complementares. A 
facilidade de preparação das amostras para análise e a rapidez na aquisição de dados, confere ainda 
um baixo custo a este método de análise. 
Estas técnicas também fornecem informações sobre os efeitos ópticos e agentes cromóforos em 
gemas. 
 
2.5. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA 
 
2.5.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS 
A microscopia de varredura por força, “scanning force microscopy” SFM é uma das técnicas 
mais recentes no estudo de polímeros. A alta resolução da imagem obtida, a facilidade na preparação 
de amostras para análise e a disponibilidade de instrumentos comerciais de alta qualidade fazem 
desta técnica uma poderosa ferramenta para o estudo de materiais. O campo de aplicação do SFM, 
hoje em dia, envolve técnicas de medidas de diversos tipos de força, tais como: mecânica 
(topografia), elétrica e magnética as quais abriram campos para a pesquisa e desenvolvimento que até 
15 anos atrás eram inimagináveis. 
O microscópio de força atômica “atomic force microscope” - AFM, o primeiro da linha do 
SFM, abrange aplicações simples, desde o estudo da morfologia de superfície dos polímeros até o 
exame das características morfológicas, estruturais e moleculares de propriedades em escala 
nanométrica. Embora os polímeros tenham uma grande importância tecnológica, muito ainda deve 
ser feito para o melhor conhecimento da sua morfologia e nanoestrutura. É por isso que o 
aparecimento da técnica de AFM tem causado um impacto tão grande na pesquisa e desenvolvimento 
de compostos macromoleculares. 
O precursor do AFM foi o microscópio de varredura por tunelamento, “scanning tunneling 
microscope” - STM. A técnica chegou ao conhecimento da comunidade científica em 1982, com a 
publicação de um artigo, no Physical Review Letters. Em 1986 os pesquisadores da IBM, Gerd 
Binnig e Henrich Roher, inventores desta técnica, foram laureados com o prêmio Nobel de física. No 
entanto, o STM ainda apresenta a limitação da necessidadede que a amostra e a agulha sejam 
semicondutores ou condutores, restringindo o número de materiais na qual a técnica pode ser 
empregada. Este tipo de problema levou a introdução, em 1986, do microscópio de força atômica. 
 O primeiro AFM para escala comercial, com produção em série, foi apresentado em 1989. 
Desde então, o número de publicações enfatizando os trabalhos com a técnica tem crescido 
significativamente, sendo no período de 2,5 anos (1993 a 1996) de cerca de 6000 artigos publicados. 
Segundo dados de uma das três maiores empresas que produzem e comercializam os microscópio de 
varredura por sonda, “scanning probe microscopy” - SPM, o mercado mundial, potencial para ano o 
de 1997, é da ordem de US$ 100 milhões. É importante esclarecer que o microscópio de varredura 
por sonda é uma família maior que engloba os outros dois tipos de microscópios, o de varredura por 
tunelamento e o de varredura por força. Em termos de preço unitário o custo de um SPM, está na 
faixa de US$30.000-US$200.000. Esta varia- ção de preço dependerá basicamente da configura- ção 
do sistema escolhido em termos de hardware e software e dos acessórios. 
Devido a recente comercialização do SPM, vale a pena ressaltar que 75% das técnicas 
utilizadas, para obtenção e análise de imagem, foram desenvolvidas nos últimos cinco anos. 
 
2.5.2. VANTAGENS E DESVANTAGENS 
A microscopia de força atômica (AFM) e outras técnicas que pertencem a família dos 
microscópios de varredura por sonda (SPM), têm recebido uma grande quantidade de estudos e 
investimentos nos últimos anos, devido a sua maior resolução e menor custo comparada às 
microscopias eletrônicas de varredura (SEM) e de transmissão (TEM). Enquanto os melhores 
microscópios eletrônicos comerciais possibilitam aumentos de no máximo algumas centenas de 
milhares de vezes, o AFM pode obter imagens com aumento de várias dezenas de milhões de vezes, 
com a vantagem de ter esta mesma resolu- ção nas 3 dimensões, o que não ocorre com os primeiros. 
Além disso, a alta energia do feixe de elétrons dos microscópios SEM danificam as amostras 
poliméricas limitando a operação do equipamento, na prática, para aumentos abaixo de 50.000 vezes 
para a maioria dos polímeros. 
As principais vantagens do AFM, quando comparado ao SEM, para a análise morfológica e 
estrutural de materiais, em geral, são: maior resolução, imagem em 3 dimensões, não existe 
necessidade de recobrimento condutivo, não requer métodos especí- ficos de preparação da amostra, 
permite a quantificação direta da rugosidade da amostra, permite a medida da espessura de filmes 
ultra-finos sobre substratos, análise por fractal, pode diferenciar fases com diferentes viscoelasticidades, 
permite a medida de propriedades mecânicas do material analisado em escala nanométrica, análise de 
amostras imersas em meio líquido e menor custo do que os microscópios eletrônicos. 
No caso de polímeros, existem ainda algumas limitações desta técnica, devido justamente ao alto 
grau de complexidade da estrutura, baixo grau de ordenamento e cristalinidade e menor módulo de 
elasticidade destes materiais. No entanto, estudos ainda estão sendo feitos para melhor expandir a 
aplicação do AFM em polímeros nos seguintes aspectos: aumentar a resolução até nível atômico, 
diminuir a interferência em amostras de baixa dureza, melhorar a análise quantitativa morfológica da 
amostra e, utilizar novas técnicas de obtenção de imagens, tais como gradiente de força elétrica e 
potencial de superfície, entre outras. 
 
2.6. MICROSCOPIA DE TUNELAMENTO 
 
2.6.1. CARACTERÍSTICAS GERAIS 
A microscopia de tunelamento é baseada no efeito túnel, que permite examinar a superfície dos 
materiais com resolução muito maior que a proporcionada por microscópios ópticos ou mesmo 
eletrônicos. 
EFEITO TÚNEL: No reino da Física quântica, há determinadas circunstâncias em que os elétrons 
encontram uma barreira tão fina que há probabilidade de que eles simplesmente a ignorem e sigam 
em frente. 
Em 1982, Gerd Binning e Heinrich Rohrer estrearam sua invenção financiada pela IBM, um 
novo e poderoso microscópio, o STM (Scanning Tunneling Microscope), ou Microscópio de 
Tunelamento. 
Eles não viram os átomos com seus próprios olhos, claro, mas foi como se fosse isso. O STM é 
capaz de sentir a posição dos átomos e fazer um mapa dessa sondagem, a imagem da superfície de 
um material com resolução atômica. O invento foi tão importante que rendeu aos pesquisadores o 
prêmio Nobel de Física de 1986. 
O princípio de funcionamento é baseado no efeito de tunelamento que ocorre entre a sonda, ou 
ponta, e a superfície, ambas condutoras. Uma diferença de potencial elétrico da ordem de centenas de 
milivolts (mV) é aplicada entre elas, enquanto são aproximadas. Quando sua distância é cerca de 10 
Å, uma corrente elétrica é estabelecida. Isso mesmo, apesar de ponta e superfície não estarem 
encostadas, há passagem de corrente elétrica de tunelamento da ordem de nanoampères (nA). 
 
A falta de contato físico pode ser entendida como uma barreira de energia alta demais para o 
elétron vencer, mas pelas explicações do efeito quântico de tunelamento, parte dos elétrons consegue, 
não pular, mas penetrar esta barreira. A aplicação de potencial viabiliza este efeito, pois ela cria 
níveis desocupados de energia na superfície compatíveis com a energia dos elétrons da ponta. 
A corrente de tunelamento depende exponencialmente da distância entre ponta e amostra. 
Portanto, pequenas variações nessa distância são suficientemente perceptíveis na corrente de 
tunelamento. Se a ponta varrer uma região da superfície a uma altura constante, o sistema é capaz de 
registrar a corrente de tunelamento para cada coordenada x,y, a qual depende exponencialmente das 
posições em z que os átomos ocupam na superfície. 
Assim foi formada a imagem vista na figura 2 referente à rede de átomos do grafite pirolítico 
altamente orientado, onde o contraste representa diferenças de correntes de tunelamento, em 
nanoampères (nA). Nestas imagens, na verdade, estamos vendo apenas metade dos átomos presentes 
na superfície. As depressões foram formadas quando a ponta passou por átomos de carbono que 
possuem outro átomo de carbono embaixo, enquanto que as protuberâncias correspondem aos 
átomos de carbono sem outro átomo logo abaixo. Isto porque a distribuição eletrônica dos átomos é 
sentida. Sendo assim, as posições dos átomos entre si também influenciam na formação das imagens. 
 
2.6.2. VANTAGENS E DESVANTAGENS 
Nesta microscopia uma ponta de tungstênio muito fina é posicionada quase tocando a 
superfície da amostra condutora. Quando a distância d de separação entre ponta-amostra se aproxima 
de 10Å, os elétrons da superfície da mostra começam a tunelar para a ponta e vice versa, dependendo 
da polaridade de voltagem aplica entre as mesmas, com isso gerando uma corrente (corrente de 
tunelamento). 
 Geralmente a imagem não representa necessariamente a topografia pura. Por exemplo, a 
imagem STM de uma superfície de ouro, representa uma imagem muito próxima de sua topografia, 
enquanto que uma imagem de uma superfície de um cristal de arseneto de gálio, em geral não, 
devido às variações na probabilidade de tunelamento de átomo para átomo em sua superfície. 
Há muitos casos em que a interpretação dos dados do STM (ou STS) não são triviais, as 
imagens STM, algumas vezes mudam de um modo drástico dependendo da estrutura da ponta. Têm-
se desenvolvido explicações teóricas usando modelos simples. No método de análise quantitativa, 
não se tem discutido muito a maneira de obter informações mais profundas dos dados STM/STS; isto 
é crucial para acelerar correlações entre o estado da ponta e os dados STM/STS. Estastopologias são, 
evidentemente, fortemente dependentes da natureza do tunelamento na ponta. 
Graças aos desenvolvimentos dos primeiros princípios da teoria de estados eletrônicos, usando 
aproximações da densidade local, tornou possível calcular quantitativamente os estados eletrônicos 
da superfície varrida e da ponta. Estas teorias permitem explicar os fenômenos das bordas e as 
anomalias na periodicidade em grande escala relatados.