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Diferenciação de ES cells em neurônios
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21/10/13 1 Diferenciação de ES em neurônios Recordando O que é célula-‐tronco? CT idênticas Stem cell Auto-‐renovação (cópias) Stem cell Cels especializadas Diferenciação (especialização) Jargões: Células-‐tronco Potência medida de quantos tipos celulares podem ser produzidos Pluripotente Podem gerar TODOS os Hpos de células especializadas do organismo EX? MulHpotente Podem gerar MúLTIPLOS Hpos mas não todos Ex? 21/10/13 2 Onde elas são encontradas? Células-‐tronco embrionárias (ESCs) blastocisto– estágio inicial do desenolvimento CT-‐tecido específicas Feto-‐adulto Células-tronco embrionárias Onde são encontradas e como são cultivadas blastocisto Outer = trofoectoderma ‘inner cell mass’ ESC Meio + nutrientes Células-tronco embrionárias: O que podem fazer? ES cells PLURIPOTENTES Todos ?pos possíveis de células especializadas diferenciação Células-‐tronco pluripotentes induzidas (iPS cells) Célula somá?ca ‘reprogramação gené?ca’ = adição de genes específicos cel induced pluripotent stem (iPS) cell Se comporta como ES cell Vantagem: não necessita embriões! Todos os ?pos possíveis de células especializadas cultura iPS cells no lab diferencição 21/10/13 3 iPS cells Célula da pele -‐ fibroblasto Reprogramação gené?ca pluripotent stem cell (iPS) diferenciação neurons Cultivo sob condições B Células-tronco embrionárias: Desafios CT embrionárias skin Culti vo so b con diçõe s A blood Cul?vo sob condições C liver Cultivo sob condições D ? Células-tronco teciduais: Onde podem ser encontradas? músculos pele re?na cérebro mama Intes?nos Medula óssea tesQculos CT tecidual: O Que elas fazem? MULTIPOTENTES CT sangue CT medula óssea diferenciação Somente ?pos especializados cérebro 21/10/13 4 Células-tronco teciduais: Princípios de renovação de tecidos Célua-‐tronco Progenitores compromeHdos -‐ “transient amplifying cells” -‐ mul?potentes -‐ dividem-‐se rapidamente -‐ não se aurorrenova -‐ autorrenova -‐ raramente se divide -‐ alta-‐potência -‐ raras Células epecializadas -‐ trabalham-‐função -‐ não dividem CT teciduais: Células-tronco neurais (NSCs) NSC cérebro Progenitores compromeHdos Células especializadas Neurônios Interneuronios Oligodendrócitos Tipo 2 Astrócitos Tipo 1 Astrócitos Célula-‐tronco e seu microambiente Stem cells at home Contato direto Fatores solúveis Célula intermediária célula-‐tronco nicho Nicho Micromabiente ao redor da célula-‐tronco que fornece suporte e sinais que regulam sua auto-‐ renovação e diferenciação Terapia baseada em CTE • Células diferenciadas in vitro – utilizando sinais que mimetizam o ambiente apropriado in vivo 21/10/13 5 moES cells - Neurônios Evans and Kaufman, 1981 huES cells – Neurônios, 1998 ES cells Hu x Mo Tipos de ES e condicoes de cultivo Primeiros protocolos em moESC huESCs – estágio tardio (epiplasto) x moESCs (ICM) mo ESCs mo iPS cells hu ESCs Hu iPSCs mo EpiSCs Múltiplos protocolos: critérios a serem considerados • Eficiência • Quantidade de NSCs • Pureza • Capacidade de gerar todos tipos neurais (indução) • Reprodutibilidade • Tempo 21/10/13 6 Indução neural: embriogênese e neurogênese adulto • Protocolos baseados em mecanismos que governam ambos • NSCs CNS (feto) : glia radial • NSC ESCs (propriedades glia radial) • NSC CNS (adulto): semelhantes a astrócitos Quais diferenças das NSCs derivadas de CNS de embrião e adulto? NSCs derivada de ESC embrionária x tecido adulto ESCs- derived NSCS - Maior proliferação - Condições aderentes - Eficiente diferenciação neuronal - Perfil transcricional parecido Colombo 2006 ESC neurogênese mimetiza neurogênese embrionária Como gerar derivados neurais a partir de ESCs? • 1- Corpo embrióide: mimetizar ambiente neuroectoderme (cell- cell interactions and signals) • 2- Cultura baixa densidade celular: evocam default mecanism • Protocolos combinam ambos • Qualidade da cultura ESCs é crítica • Formação de cultura NSCs heterogênea: Purificação 21/10/13 7 Corpo embrióide • Mimetiza ambiente embrião; • 1959 – gerado teratocarcinoma 4d Outer: hipoblasto Inner: epiblasto 6d Core forma cavidade Epitélio colunar- tubo neural Neuroectoderma (sox 1 e sox 3) Protocolos para produzir NSCs de ESCs Mo e hu Mo Mo e hu Neurons e glia Default pathway Default pathway: each individual ectodermal cell has an intrinsic default program to become a neural cell 21/10/13 8 Default pathway Protocolos para produzir NSCs de ESCs Mo e hu Mo Mo e hu Neurons e glia Evidência: default mechanism Primitive NSCs emerge from the ES cell default neural pathway. 80% sox1+ Most die 21/10/13 9 Protocolos para produzir NSCs de ESCs Mo e hu Mo Mo e hu Neurons e glia Co-cultura: Células estromais Protocolos para produzir NSCs de ESCs Mo e hu Mo Mo e hu Neurons e glia Mo e hu adaptado Diferenciação direta: feeder independente e densidade moderada GFP sob controle promotor neuroectoderma e NSCs sox1 21/10/13 10 Diferenciação direta: feeder independente e densidade moderada - Rápido - População pura por citometria - 10.000 ESCs- 5mi cels 10% NCSs Tipos celulares intermediários para produção NSCs de ESCs Embriogênese- Especificação neural: Ectoderma primitivo, definitivo e neuroectoderme Ebs in/dependente moESCs (estágio ICM) Ectoderme primitiva: ecto, endo e mesoderma huESCs Ectoderme definitivo Neuroectoderme Estágio epibalsto ESCs - NSCs • Existência de tipos celulares intermediários • Dificulta a elucidação das funções das moléculas de sinalização • Mesma molécula diferentes papéis em em diferentes estágios de diferenciação Fatores de crescimento e moléculas de sinalização: transição ESCs - NSCs 21/10/13 11 Terapia baseada em CTE • Células diferenciadas in vitro – utilizando sinais que mimetizam o ambiente apropriado in vivo MSC iPS iNs Patient CELLULAR THERAPY Neurodegenerative disease NPCsTISSUE GRAFT STEM CELLS SOMATIC CELLS Fetal tissue Terapia baseada em CTE
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