Análise proteômica da variação individual em Venenos de filhotes de Bothrops jararaca

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Gabriela da Silva Dias 
 
Análise proteômica da variação individual em 
venenos de filhotes de Bothrops jararaca 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Toxinologia do 
Instituto Butantan, para obtenção do 
título de Mestre em Toxinologia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2013
	
  
	
  
	
  
	
   	
  
	
  
Gabriela da Silva Dias 
 
Análise proteômica da variação individual em venenos de 
filhotes de Bothrops jararaca 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Toxinologia do 
Instituto Butantan, para obtenção do 
título de Mestre em Toxinologia. 
Orientadora: Solange Maria de Toledo 
Serrano 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2013 
	
  
	
  
	
  
	
   	
  
	
  
 
 
 
 
 
 
 
	
  
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA 
Elaborada com instruções fornecidas pela Biblioteca do Instituto Butantan
 
 Dias, Gabriela 
 Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de 
Bothrops jararaca/Gabriela da Silva Dias/ orientadora: Solange Maria de Toledo 
Serrano. – São Paulo, 2013 
143 fls. : il. color. ; 30 cm. 
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação 
 em Toxinologia. Instituto Butantan, 2013 
1. Bothrops. 2. Veneno de Serpente. 3. Proteômica 4. Filhotes. 5. Variabilidade 
Individual. I. Orientadora: de Toledo Serrano, Solange Maria. II. Programa de Pós-
Graduação em Toxinologia. Instituto Butantan. III. Título. 
CDC 615.9 
 
	
  
	
  
	
  
	
   	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Av.	
  Vital	
  Brasil,	
  1500	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  São	
  Paulo,05503-­‐900	
  	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Tel/Fax:	
  (11)	
  3726-­‐7222	
  r	
  2064	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  cpgibu@butantan.gov.br	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  http://posgrad.butantan.gov.br	
  
	
  
	
  
POS-GRADUAÇÃO EM TOXINOLOGIA 
INSTITUTO BUTANTAN 
 
 
RESULTADO DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO 
 
MESTRADO 
 
 
NOME DO ALUNO(A): Gabriela da Silva Dias 
 
DATA DO EXAME:.............../................ /................. 
 
 
BANCA EXAMINADORA: Profs. Drs. 
 
 
NOME Assinatura Aprovado(a) Reprovado(a) 
 
________________________ ______________________ ( ) ( ) 
(Presidente) 
 
________________________ ______________________ ( ) ( ) 
 
 
________________________ ______________________ ( ) ( ) 
 
 
DECISÃO FINAL: APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A) ( ) 
 
Comentários da Banca (opcional): 
 
 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
AUTORIZAÇÃO PARA REPRODUÇÃO DO TRABALHO 
 
 Eu, Gabriela da Silva Dias, mestranda pelo Programa de Pós-
Graduação em Toxinologia, autorizo a reprodução deste trabalho no site da 
Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo. 
 
 
 
______________________________ 
Gabriela da Silva Dias 
Aluna 
 
 
 
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Solange de Maria Toledo Serrano 
Orientador
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Dedicatória	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aos meus pais que me ensinaram 
a lição que nenhuma escola pode 
ensinar, às minhas amadas irmãs, 
Camila e Luciane, ao meu eterno 
namorado Alexandre e minhas 
pequenas Molly e Miney (em 
memória)
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Dedicatória	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha orientadora Dra. Solange 
Maria de Toledo Serrano pela 
oportunidade grandiosa e 
aprendizado, e ao Dr. André 
Zelanis pela impecável co-
orientação.
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Agradecimentos	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
Agradecimentos 
 
Esse pequeno espaço jamais representará a imensa gratidão que existe no 
meu coração para cada uma dessas pessoas citadas abaixo. 
 
Primeiramente agradeço a Deus por sempre me abençoar e guiar meus 
caminhos. 
 
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). 
 
À diretora do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada do Instituto 
Butantan, Dra. Solange Maria de Toledo Serrano, que me deu essa grandiosa 
oportunidade de conhecer o mundo da pesquisa científica e me abrir os 
horizontes para o que é a vida. 
 
Ao Programa de Pós Graduação em Toxinologia do Instituto Butantan e seus 
funcionários: Kimie e Rosana. 
 
Ao Dr. Hugo Armelin, diretor do CAT/cepid por permitir desenvolver o trabalho. 
 
Aos membros da banca de qualificação, Dra. Ana Maria Moura da Silva 
(Laboratório de Imunopatologia), Dr. Marcelo Santoro (Laboratório de 
Fisiopatologia) e a Dr. Ida Shigueko (Laboratório de Fisiopatologia) pelas 
sugestões, pelas críticas valiosas e elogios. 
 
Ao Dr. André Zelanis, pela paciência e dedicação que teve desde quando eu 
nem pensava em começar o mestrado até finalizar o mesmo. 
 
Aos colegas do Laboratório de Herpetologia que forneceram gentilmente os 
filhotes para que pudéssemos fazer a extração do veneno e desenvolver esse 
projeto. Em especial ao Dr. Sávio Stefanini e a Dra. Marisa Rocha que 
dispenderam um tempo precioso comigo. 
 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Agradecimentos	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
À todos meus amigos do Laboratório Especial de Toxinologa Aplicada, Dr. 
Alexandre Tashima, Dra. Aline Lopes, Dra. Amanda Asega, Debora Andrade, 
Edson Takeshi, Eduardo Kitano, que me acolheram tão bem desde o primeiro 
momento que entrei, e sem excessão, me ajudaram, apoiaram em todos os 
momentos que passei por aqui e se tornaram uma agradável extensão da 
minha casa. 
 
À Dra Ana Helena que teve uma contribuição valiosa para esse projeto. 
 
À Dra Milene Menezes pela amizade, carinho e risadas. À Msc Ana Karina 
pela amizade, conselhos e inúmeras conversas. À Dra. Eliana Blini Marengo 
pela doçura e Dra. Fernanda Bruni pela calma que transmite. E que juntas 
fazem uma quinta feira ótima. 
 
À Luciana Bertholim pela companhia no Alemão. 
 
Aos funcionários da Laboratório Especial de Toxinoliogia Aplicada, em especial 
Isaías, Zezé, Cissa e Dona Cida que me acompanham desde o começo. 
 
Aos meus amigos da pós graduação, Hugo Vigerelli, Karina Kodama e Tarcísio 
Liberato que dividiram comigo as angústias e alegrias do dia-a-dia na vida de 
um estudante de pós graduação. 
 
 
Aos meus pais, Nilo Dias e Eliete da Silva Dias por serem exemplos de vida e 
por sempre me proporcionar mais do que poderiam. 
 
Às minhas irmãs, Camila e Luciane que sempre estiveram presentes em todos 
os momentos da minha vida dividindo sorrisos e lágrimas. 
 
Ao meu namorado, Alexandre, por sempre me apoiar nas decisões difíceis e 
incentivar meus estudos. 
 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Agradecimentos	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
Aos meus padrinhos Eliane e Saulo, que sempre foram como segundos pais 
pra mim. E a toda minha família que é meu alicerce de vida. 
 
À minha prima-amiga querida Simone Beu. 
 
Às minha amigas queridas Karen e Patrícia, que me acompanham desde a 
época que não sabíamos das responsabilidades da vida. 
 
À família do Alexandre: Zê, Sui, Fábio e Dona Almira que se tornou minha 
família também.Às amigas Jussara Santana, Paula Gouvêa e Fernanda Sasaki. 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Epígrafe	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 “Ela acreditava em anjo e, 
porque acreditava, eles 
existiam”. 
A Hora da estrela - Clarice 
Lispetor 
 
 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Resumo	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
RESUMO 
 
DIAS G.S. Análise proteômica da variação individual em venenos de 
filhotes de Bothrops jararaca. 2013. 144 fls. (Mestrado em Toxinologia) - 
Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, São Paulo-
SP. 
 
Venenos do gênero Bothrops causam, além de efeitos locais, efeitos 
sistêmicos sobre os sistemas hemostático e cardiovascular. Mudanças 
ontogenéticas, além de variações relacionadas ao sexo do animal, na 
composição individual e atividades dos venenos de adultos, são características 
frequentemente reportadas na literatura, entretanto, a variação na composição 
individual de venenos de filhotes de serpentes deste gênero não é conhecida. 
Para este estudo, o veneno de 21 filhotes de B. jararaca foi extraído e 
estocado individualmente a -20°C até o uso. A quantificação de proteínas nos 
venenos variou entre os indivíduos, porém a maioria apresentou valores de 
110-120 mg/ml. Os perfis eletroforéticos foram analisados com e sem redução 
das pontes de dissulfeto das proteínas e diversas diferenças foram visualizadas 
entre os venenos. O perfil eletroforético dos venenos com coloração para 
glicoproteínas mostrou sutis diferenças. A análise por Western blot utilizando 
um anticorpo anti-bothropasina mostrou reconhecimento significativo, porém 
variável, de bandas contendo metaloproteinases, na maioria dos venenos. Da 
mesma forma, a análise utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2, revelou 
variação com relação às massas moleculares e intensidades das bandas 
reconhecidas contendo serinoproteinases. 
Considerando a importância da atividade proteolítica nos 
envenenamentos, foram utilizados dois substratos diferentes para a 
determinação dessa atividade: a proteína caseína, que pode ser degradada 
tanto por serinoproteinases como metaloproteinases e o substrato sintético L-
Benzoil-Arginil-pNA (L-BAPNA) que é degradado somente por 
serinoproteinases. Valores de atividade caseinolítica específica não 
apresentaram variação expressiva entre os venenos, porém quanto à atividade 
amidolítica sobre o substrato L-BAPNA os venenos mostraram 
significantemente diferentes, e alguns deles não apresentaram atividade 
enzimática sobre este substrato. Da mesma forma, a atividade coagulante 
sobre o plasma humano, determinada pela Dose Mínima Coagulante, mostrou-
se bastante variável entre os indivíduos. 
A análise dos venenos por cromatografia líquida acoplada a 
espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) apresentou diferenças 
significativas entre algumas amostras, contudo uma característica ubíqua foi a 
presença do tripeptídeo <EKW em todos os venenos, um importante 
tripeptídeo, que é inibidor de metaloproteinases. 
O perfil eletroforético dos venenos, analisados com as proteínas 
submetidas à redução de pontes de dissulfeto, mostrou significativa 
variabilidade e a identificação de proteínas por digestão in gel com tripsina 
seguida de análise por LC-MS/MS foi realizada com o objetivo de identificar 
proteínas diferencialmente expressas nos venenos individuais de filhotes. Por 
outro lado, a análise eletroforética comparativa dos venenos em condições não 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Resumo	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
redutoras mostrou perfis individuais menos variáveis, quando comparados com 
a análise com redução, e a identificação de proteínas presentes em uma região 
do gel, que era semelhante entre os venenos, levou à identificação de 
metaloproteinases, L-aminoácido-oxidase, e aminopeptidase, que seriam 
toxinas comuns entre eles. 
Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram a expressiva 
variabilidade individual nos venenos de filhotes de B. jararaca, fato que já 
havia sido demonstrado em venenos individuais de adultos desta espécie, e 
sugerem que a variação individual nos venenos está presente desde o 
nascimento, não sendo um reflexo da ontogenia do animal. Estes achados 
servem como subsídios para o entendimento das bases moleculares da 
variabilidade de venenos de serpentes, sobretudo da B. jararaca. 
 
Palavras-chave: Bothrops, veneno de serpente, proteômica, 
filhotes,variabilidade individual. 
 
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  G.S.	
  2013	
  
Abstract	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
ABSTRACT 
 
DIAS G.S. Analysis of the individual variation of the venom proteome of 
Bothrops jararaca newborn specimens. 2013.144 p (Mestrado em 
Toxinologia) - Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto 
Butantan, São Paulo-SP. 
Envenomation by Bothrops snakes cause local damage as well as 
systemic, hemostatic and cardiovascular effects. Ontogenetic changes and 
variations related to animal gender, composition and activities of individual 
adult venoms are features commonly reported in the literature, however, the 
variation in the composition of newborn snake venom is still unknown. 
For this study, venom from 21 newborn specimens of B. jararaca was 
milked and stored at -20°C until use. Protein quantification in the fresh venoms 
varied among individuals however most of them showed values between 110 
and 120 mg/ml. Venom electrophoretic profiles were analyzed under reducing 
and non-reducing conditions and showed various differential protein bands 
among the venoms. Glycoprotein staining showed some subtle variations in the 
individual venom glycoproteomes. Comparison of the venoms by Western blot 
analysis using an anti-metalloproteinase antibody (anti-bothropasin) showed 
intense recognition of various protein bands, however their molecular masses 
varied among the venoms. Likewise, recognition of serine proteinases in the 
venoms by an anti-serine proteinase antibody (anti-MSP1/MSP2) revealed 
bands of variable molecular masses in newborn venoms. 
Considering the importance of the proteolytic activity in B. jararaca 
accidents, two different substrates were used for measuring this activity: i) 
casein, a protein that can be degraded by both metalloproteinases and serine 
proteinases; ii) benzoyl-L-arginyl-pNA (L-BAPNA), a synthetic substrate which 
is only degraded by trypsin-like serine proteinases. The caseinolytic activity did 
not vary among the venoms, however, individual values of amidolytic activity 
upon L-BAPNA were significantly different among the venoms and some of 
them did not hydrolyze this substrate. Similarly, the coagulant activity was 
assessed by the determination of the Minimum Coagulant Dose and showed 
remarkable variability among the venoms. 
Analysis of the venoms by liquid chromatography coupled to tandem 
mass spectrometry (LC-MS/MS) showed significant differences between some 
samples, however, an interesting finding was the ubiquitous presence in these 
venoms of the tripeptide <E-K-W, which is an important inhibitor of venom 
metalloproteinases. The electrophoretic profiles of proteins submitted to 
reduction of disulfide bonds showed significant variability among the venoms 
and identification of proteins by in gel trypsin digestion followed by LC-MS/MS 
was carried out to identify proteins differentially expressed in the individual 
newborn venoms. On the other hand, the electrophoretic profiles of venoms 
analyzed under non-reducing conditions showed less individual variability and 
the identification of proteins present in a region of the gel which contained a 
broad protein band present in all venoms revealed the presence of 
metalloproteinases, L-amino acid oxidase, and amino peptidase as commoncomponents of these venoms. 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Abstract	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
Taken together, the results of this study demonstrate the significant 
individual variability in the venom of newborn B. jararaca specimens, a feature 
that has also been shown in adult specimens of this snake. Moreover, the 
findings of this work suggest that individual venom variability in B. jararaca exist 
since very early animal age and is not a result of ontogenetic changes. These 
findings can contribute for the understanding of the molecular basis of the 
variability of snake venoms, especially in B. jararaca. 
 
 
 
Keywords: Bothrops, snake venom, proteomics, newborn, individual 
variability.	
  
 
 
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  G.S.	
  2013	
  
Lista	
  de	
  Figuras	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. ................................................... 11 
 
Figura 2. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas 
não submetidas à redução) ............................................................................... 25 
 
Figura 3. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas 
submetidas à redução) ..................................................................................... 27 
 
Figura 4. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca com 
coloração fluorescente para glicoproteínas. ...................................................... 29 
 
Figura 5. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca 
utilizando o anticorpo anti- bothropasina.. ......................................................... 31 
 
Figura 6. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca 
utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2. ........................................................... 33 
 
Figura 7. Atividade proteolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando 
como substrato a caseína. ................................................................................. 35 
 
Figura 8. Atividade amidolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando 
como substrato Benzoil-Arginil-p-nitroanilida. ................................................... 36 
 
Figura 9. Perfis de LC-MS dos venenos de filhotes de B. jararaca .................. 39 
 
Figura 10. Espectro representativo (MS/MS) do sequenciamento do íon 
correspondente ao peptídeo <E-K-W. ............................................................... 40 
 
Figura 11. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de 
SDS-poliacrilamida (proteínas submetidas à redução) com indicação das 
bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS. ................. 42 
 
Figura 12. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de 
SDS-poliacrilamida (proteínas não submetidas à redução) com indicação das 
bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS.. ................ 49 
 
Figura 13. Comparação de características dos venenos de filhotes de B. 
jararaca machos e fêmeas utilizando o Teste T não pareado. .......................... 57 
 
Figura 14. Dendrograma do agrupamento hierárquico dos venenos de filhotes 
de B. jararaca, evidenciando a divisão em dois grupos principais .................... 59	
  
 
 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Lista	
  de	
  Tabelas	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a 
hemostasia. ......................................................................................................... 7 
 
Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados 
neste estudo. ..................................................................................................... 22 
 
Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B. 
jararaca filhotes. ................................................................................................ 23 
 
Tabela 4. Atividade coagulante dos venenos de 21 filhotes de B. jararaca sobre 
o plasma humano. ............................................................................................. 37 
 
Tabela 5. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de 
filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 11, por LC-MS/MS. ....................... 43 
 
Tabela 6. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de 
filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 12, por LC-MS/MS ........................ 50 
 
	
  
	
  
	
  
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Lista	
  de	
  Abreviaturas	
  e	
  Siglas	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
BPP: Bradykinin Potentiating Peptide (Peptídeo potenciador de bradicinina) 
BSA: Bovine Serum Albumin (soroalbumina bovina) 
CRISP: Cysteine- rich secretory protein ( Proteína secretada rica em cisteína) 
CTL: C-Type Lectin (Lectina tipo-C) 
DMC: Dose mínima coagulante 
DTT: DL-ditiotreitol 
FII: Fator II / Protrombina 
FIIa: Fator II ativado / trombina 
FLA2: Fosfolipase A2 
FX: Fator X / Fator de Stuart 
FXa: Fator X ativado 
IAA: Iodoacetamina 
IgG: Imunoglobulina G 
kDa: Kilodalton 
LAAO: L-aminoácido oxidase 
L-BAPNA: L-Benzoil-Arginil-pNitroAnilida 
LC: Liquid chromatography (cromatografia líquida). 
LC-MS/MS: Liquid Chromatography coupled to tandem mass spectrometry 
(Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas seqüencial) 
m/z: razão massa/carga 
MP: Metaloproteinase 
nm: nanômetro 
NPU: Número de peptídeos únicos 
PBS: Phosphate Buffered Saline (tampão fosfato-salina) 
pNa: para-nitroanilina 
Q-ToF: Quadrupole-Time of Flight (Quadrupolo- tempo de vôo) 
rpm: Rotações Por Minuto 
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato de sódio) 
Dias	
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Lista	
  de	
  Abreviaturas	
  e	
  Siglas	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
SDS-PAGE: Sodium Dodecil Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis 
(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio) 
SP: Serinoproteinase 
TFA: Trifluoracetic acid (ácido trifluoroacético) 
Tris: Tris (hidroximetil) aminometano 
VEGF: Vascular Endothelium Growth Factor (Fator de crescimento vascular 
endotelial) 
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Sumário	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
SUMÁRIO 
	
  
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1	
  
1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do gênero 
Bothrops ................................................................................................... 1	
  
1.2. Bothrops jararaca e seu veneno ....................................................... 6	
  
1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca ....................... 8	
  
 
2. OBJETIVOS ....................................................................................... 12	
  
 
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 13	
  
3.1. Extração dos venenos de filhotes ................................................... 13	
  
3.2. Quantificação de proteínas ............................................................. 13	
  
3.3. Eletroforese de proteínas em gel de SDS-poliacrilamida ............... 14	
  
3.4. Atividade caseinolítica .................................................................... 14	
  
3.5. Atividade amidolítica ....................................................................... 14	
  
3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima Coagulante 
(DMC) .................................................................................................... 15	
  
3.7. Análise do glicoproteoma ................................................................15	
  
3.8. Análise por Western blot ................................................................. 15	
  
3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas por LC-MS/MS
 ............................................................................................................... 16	
  
3.10. Análise do perfil proteico dos venenos por espectrometria de 
massas (LC-MS) .................................................................................... 19	
  
3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise em banco de 
dados ..................................................................................................... 19	
  
3.12. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos 
venenos ................................................................................................. 20	
  
 
4. RESULTADOS ................................................................................... 21	
  
4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos individuais de 
filhotes de B. jararaca ............................................................................ 21	
  
4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de venenos de filhotes 
de B. jararaca ......................................................................................... 24	
  
4.3. Sub-proteoma de metaloproteinases. Análise por Western blot com 
o anticorpo anti-bothropasina ................................................................ 30	
  
4.4. Sub-proteoma de serinoproteinases. Análise por Western blot com o 
anticorpo anti-MSP1/MSP2 .................................................................... 32	
  
4.5. Atividade proteolítica dos venenos individuais de filhotes de B. 
jararaca .................................................................................................. 34	
  
4.5.1. Atividade caseinolítica ................................................................. 34	
  
4.5.2. Atividade amidolítica .................................................................... 35	
  
Dias	
  G.S.	
  2013	
  
Sumário	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
4.6. Atividade coagulante dos venenos individuais de filhotes de B. 
jararaca .................................................................................................. 36	
  
4.7. Análise dos venenos de B. jararaca filhotes por espectrometria de 
massas (LC-MS) .................................................................................... 38	
  
_Toc3495774384.8. Identificação de proteínas por espectrometria de massas 
em bandas diferenciais dos venenos ..................................................... 41	
  
4.9. Identificação de proteínas por espectrometria de massas em bandas 
comuns dos venenos ............................................................................. 48	
  
4.10. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos 
venenos ................................................................................................. 56	
  
4.10.1. Teste de comparação de médias entre machos e fêmeas ........ 56	
  
4.10.2. Análise multivariada ................................................................... 57	
  
 
5. DISCUSSÃO ...................................................................................... 60	
  
 
6. CONCLUSÕES .................................................................................. 68	
  
 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 69	
  
 
 
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Introdução	
  
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1. INTRODUÇÃO 
	
  
	
  
1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do 
gênero Bothrops 
 
O gênero Bothrops pertence à família Viperidae, compreende mais de 30 
espécies de serpentes, e tem esta denominação decorrente da língua grega: 
“Bothros” significa fosseta ou cavidade e “ops”, que significa olho ou face, uma 
alusão à fosseta loreal, localizada entre a narina e os olhos destas serpentes. 
(Carrasco et al, 2012). São caracterizadas pela ‘cabeça em formato de lança’, e 
estão amplamente distribuídas em regiões tropicais como América Latina, mais 
específicamente do nordeste do México até a Argentina e parte das ilhas do Caribe 
(Campbell e Lamar, 2004). Diversas espécies pertencentes a este gênero são 
responsáveis pelos acidentes ofídicos no continente Sul americano (Salomão et al. 
1997; Warrel 2004). No Brasil, esse gênero compreende diversas espécies, dentre 
as quais estão: Bothrops jararaca (jararaca), B. jararacussu (jararacussu), B. 
alternatus (urutu-cruzeiro ), B. neuwiedi (jararaca-pintada) e B. moojeni (caissaca) 
(Melgarejo, 2003). O veneno dessas serpentes, que é produzido por glândulas 
exócrinas especializadas, consiste em uma secreção que contêm uma mistura 
complexa de proteínas e peptídeos bioativos que auxiliam a digestão de uma presa 
“não triturada”; constitui um mecanismo de defesa contra predadores/agressores e é 
o fator responsável pela subjugação das presas (Gans e Elliot, 1968; Thomas e 
Pough, 1979; Mackessy, 1993; Fry et al., 2006; Vonk et al., 2008). 
Algumas das proteínas presentes nos venenos do gênero Bothrops são 
enzimas, como serinoproteinases (Markland, 1998; Serrano e Maroun, 2005), 
metaloproteinases (Moura-da-Silva et al., 2007; Gutiérrez et al., 2005; Fox e 
Serrano, 2008), fosfolipases A2 (Kini, 2003, 2005), L-aminoácido oxidases (Du e 
Clemetson, 2002), e nucleotidases (Rael, 1998). Esses venenos contêm ainda 
outras proteínas como lectinas (Ogawa et al, 2005; Morita, 2005; Lu, 2005) e 
disintegrinas (Calvete et al, 2005). Os venenos produzidos por serpentes 
pertencentes à família Viperidae são conhecidos por conterem proteínas que 
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Introdução	
  
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interferem com o funcionamento normal do sistema hemostático (Markland, 1998; 
Braud et al, 2000; Fox e Serrano, 2005). 
As serinoproteinases de venenos de serpentes são classificadas no clan SA, 
família S1 da quimiotripsina (Barrett et al., 1995; Rawlings et al., 2008). A tripsina de 
mamíferos e as enzimas de venenos apresentam fold semelhante e, acredita-se, 
evoluíram a partir de um ancestral comum (Itoh et al., 1988). Estas enzimas 
possuem uma tríade catalítica bem conservada formada pelos resíduos His57, 
Asp102 e Ser195 (Serrano e Maroun, 2005). As serinoproteinases de venenos 
interferem especificamente nos mecanismos hemostáticos e apresentam resistência 
à inibição por inibidores plasmáticos de serinoproteinases (Parry et al., 1998). Em 
contraste com a tripsina, que apresenta uma vasta especificidade de substrato, as 
enzimas de venenos são caracterizadas pela alta especificidade, assim como as 
serinoproteinases de mamíferos que regulam a hemostasia (Serrano e Maroun, 
2005). 
As metaloproteinases de venenos de serpentes são classificadas na família 
M12 das metaloproteinases, juntamente com outros dois grupos dessas enzimas: A 
Disintegrin and Metalloproteinase (ADAM) e A Disintegrin and Metalloproteinase with 
Thrombospondin Motifs (ADAMTS). As metaloproteinases são componentes 
abundantes em venenos de viperídeos e possuem em seu domínio catalítico um íon 
inorgânico (normalmente zinco) coordenado pelas cadeias laterais de três resíduos 
de histidina presentes na seqüência HEXXHXXGXXH, que é altamente conservada 
nessas proteínas (Hite et al. 1994; Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano, 2008). 
Com base na estrutura de seus precursores e das proteínas em forma madura (pós-
processamento) as metaloproteinases são divididas em três classes: P-I a P-III. Os 
precursores destas proteínas contém em comum um peptídeo sinal, e um pró-
domínio, que mantém a enzima em estado latente, sem atividade proteolítica (Gramset al, 1993; Stocker e Bode, 1995). Enzimas da classe P-I apresentam apenas o 
domínio catalítico, com massa molecular entre 20 kDa e 25 kDa (Bjarnason e Fox, 
1995; Fox e Serrano, 2008). Enzimas da classe P-II possuem um domínio 
disintegrina na porção carboxil do domínio catalítico. Os precursores de enzimas da 
classe P-II podem gerar proteínas maduras formadas somente pelo domínio 
catalítico ou somente o domínio disintegrina (P-IIa), como a atrolisina-E, e também 
proteínas que conservam o domínio disintegrina na proteína madura como as 
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Introdução	
  
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metaloproteinases jerdonitina (proteína monomérica da classe P-IIb) e bilitoxina-1 
(proteína dimérica da classe P-IIc). Estes precursores ainda podem gerar proteínas 
maduras compostas por disintegrinas homo-diméricas, como a contortrostatina, ou 
hetero-diméricas, como a acostatina, das classes P-IId e P-IIe, respectivamente (Fox 
e Serrano, 2005, 2008). Já as enzimas da classe P-III são proteínas com massa 
molecular entre 50 kDa e 110 kDa que apresentam na sua forma madura, além do 
domínio catalítico, o domínio tipo-disintegrina seguido de um domínio rico em 
resíduos de cisteínas na região C-terminal (Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano, 
2008). A esta classe pertencem proteinases formadas pelos domínios citados, na 
forma monomérica (classe P-IIIa) como a atrolisina-A, HF3, e também na forma 
dimérica (classe P-IIIc), como a VAP1. Ainda, foi encontrada em venenos de 
viperídeos uma proteína composta somente pelos domínios tipo-disintegrina e rico 
em cisteínas, formada pelo processamento proteolítico de proteinases da classe P-
IIIb, como jarharagina, bothropasina e catrocollastatina, porém, o domínio catalítico 
destas enzimas ainda não foi isolado do veneno (Usami et al., 1994; Shimokawa et 
al., 1997). A antiga classe P-IV, hoje denominada classe P-IIId, é composta por 
enzimas que apresentam uma cadeia contendo os domínios encontrados nas 
proteinases da classe P-III, e mais duas cadeias de lectinas ligadas ao domínio rico 
em cisteínas por pontes dissulfeto. São representantes desta classe as proteinases 
RVV-X (Russell’s viper venom factor X activator) da Vipera russelli e VLFXA (Vipera 
lebetina venom factor X activator) da Vipera lebetina, ambas com atividade de 
ativação do fator X da coagulação (Fox e Serrano, 2005, 2008).	
  
As fosfolipases A2 (FLA2) são enzimas que hidrolisam glicerofosfolipídeos na 
posição sn-2 da cadeia de glicerol liberando lisofosfolípides e ácidos graxos (Kini e 
Iwanaga, 1986; Kini, 2003). São divididas em duas classes: citósólicas e secretadas, 
sendo as de veneno des serpentes, secretadas. As FLA2 de veneno apresentam 
similaridade de estrutura química e função catalítica com enzimas de mamíferos, 
entretanto as FLA2 de venenos são tóxicas e responsáveis por diversos efeitos 
farmacológicos, tais como interferência na agregação plaquetária, miotoxicidade, 
neurotoxicidade, entre outros (Gutiérrez e Lomonte, 1995; Kini, 1997, 2005). 
As lectinas tipo-C são proteínas que requerem íons de Ca+2 para sua 
interação com carboidratos específicos. Estas proteínas apresentam uma 
conformação típica em sua estrutura (um loop) cujos resíduos coordenam a ligação 
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com íons de cálcio (Drickamer, 1988). A maioria das lectinas encontradas em 
venenos de serpentes não apresenta o loop de ligação com íons de Ca+2 e nem 
todas se ligam a carboidratos (Clemetson et al. 2001). As lectinas tipo-C são 
proteínas diméricas, e apresentam massa molecular de cerca de 30 kDa. Estas 
proteínas estão envolvidas principalmente nas alterações de processos 
hemostáticos decorrentes do envenenamento, interagindo principalmente com 
receptors plaquetários (Zingali et al. 2001). 
A variação em proteomas de venenos animais ocorre em diversos níveis, 
includindo interfamília, intergênero, interespécie, intersubspécie e intraespécie. A 
variação intraespécie pode acontecer ainda individualmente, devido à variação 
sazonal, dieta, habitat, idade e dimorfismo sexual (Chippaux et al, 1991). A 
complexidade dos venenos de serpentes tem sido analisada pela 
complementaridade das abordagens de transcriptômica e proteômica, que permitem 
a elucidação da composição e variabilidade das proteínas e peptídeos, identificação 
de modificações pós-traducionais, avaliação do processamento de precursores e de 
proteínas maduras, análises de filogenia molecular, entre outras (Tubbs et al., 2000; 
Ho, 2002; Kashima et al., 2004; Francischetti et al., 2004; Serrano et al., 2005; 
Menezes et al., 2006; Fox et al., 2006; Ching et al., 2006; Cidade et al., 2006). 
Considerando que a diversidade e abundância de proteínas presentes nos 
venenos é extremamente variável, a análise proteômica é uma ferramenta 
importante para o entendimento da complexidade dos venenos. Análises 
proteômicas de venenos de serpentes têm revelado aspectos importantes em 
relação à variabilidade da composição do veneno, seja ela inter-específica ou intra-
específica (Fox e Serrano, 2008; Calvete et al, 2009; Gutiérrez et al., 2009). 
Neste contexto, diversos grupos têm estudado a complexidade e variabilidade 
dos proteomas de venenos de serpentes. Gutiérrez et al (2009) compararam o 
proteoma de venenos de B. asper, provenientes do Caribe e Costa Rica e 
verificaram variação geográfica com relação à presença de diversas classes de 
proteínas , tais como disintegrinas, FLA2, serinoproteinases, lectinas tipo-C, 
Cysteine-Rich Secretory Protein (CRISP), L-amino acido oxidase e 
metaloproteinases. Além disso, esses autores observaram ainda uma variação 
ontogenética importante, em que o veneno de espécimes neonatos apresentou uma 
alta proporção de metaloproteinases da classe P-III em relação ao veneno dos 
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espécimes adultos, que por outro lado, apresentou maior expressão de 
metaloproteinases da classe P-I e FLA2 do tipo Lys-49. Guércio et al. (2006) 
analisaram o perfil proteômico de venenos de exemplares juvenis, sub-adultos e 
adultos de B. atrox, evidenciando uma pronunciada expressão de metaloproteinases 
no veneno dos adultos. 
De acordo com Vellard (1937) a variação intraespecífica do veneno de B. 
atrox, resultou na variabilidade do quadro clínico e isso evidencia-se em espécies 
que tem uma distribuição geográfica mais ampla, como é o caso da espécie citada 
acima. Sendo assim a diversidade intraespecífica interfere na variabilidade clínica do 
envenenamento, logo, merece mais consideração uma vez que os acidentes podem 
requerer diferentes tipos de tratamento. Estudos de Saldarriaga et al. (2003) 
relataram maior atividade coagulante nos venenos de exemplares jovens de B. 
asper e B. atrox da Colômbia. 
A variabilidade geográfica e intra-específica de venenos de serpentes B. 
asper provenientes da Costa Rica foi demonstrada principalmente no que diz 
respeito à toxicidade (Jimenez-Porras, 1964; Gutierrez et al., 1980; Aragon e 
Gubensek, 1981; Moreno et al., 1988). Gutiérrez et al (1980) mostraram que 
venenos de serpentes provenientes de regiões do Caribe causavam nos pacientes 
maiores efeitos hemorrágico e mionecrótico do que aqueles advindos de diferentes 
partes do Pacífico, que por sua vez apresentavam alta atividade proteolítica sobre a 
caseína. 
O processo de desenvolvimento de um indivíduo até a sua fase adulta 
(ontogenia) tem também importante reflexos na composição dos venenos. A 
variação ontogenética foi observada também no veneno de B. atrox, em que a 
atividade coagulante foi mais intensa para os espécimes jovens em relaçãoao 
veneno dos adultos (Lopez-Lozano et al., 2002). Em conjunto, esses trabalhos e 
outros demonstraram que de fato o conhecimento sobre os proteomas do venenos 
bem como sua variabilidade, seja de que tipo for, podem impactar a pesquisa 
básica, não só para aqueles que estudam evolução de espécies e a relação entre o 
conteúdo dos venenos e os efeitos observados no envenenamento, como também 
as ações relacionadas ao tratamento, incluindo a seleção dos antissoros e também a 
seleção de espécimes para a produção dos antissoros. 
 
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1.2. Bothrops jararaca e seu veneno 
	
  
A B. jararaca é uma das mais importantes espécies causadoras de acidentes 
ofídicos no Brasil. Os acidentes botrópicos correspondem a mais de 75% dos 
acidentes ofídicos no Brasil, segundo estatísticas do Sistema de Informação e 
Notificação de Agravos (SINAN) (Ministério da Saúde, 2010). As serpentes B. 
jararaca são solenóglifas e possuem hábitos predominantemente noturnos e 
generalistas, no entanto, exibem uma notável mudança na dieta associada ao 
desenvolvimento ontogenético, alimentando-se de presas ectotérmicas 
(principalmente artrópodes, lagartos e pequenos anfíbios) durante a fase juvenil, e 
de animais endotérmicos (principalmente pequenos mamíferos) durante a vida 
adulta (Sazima, 1992; Martins e Sazima, 2002). Distribuem-se desde o Sudeste da 
Bahia até a porção nordeste do Rio Grande do Sul, ocupando uma diversidade de 
habitats, desde Mata Atlântica até regiões abertas e áridas, com domínio 
predominantemente de cerrado (Campbell e Lamar, 1989). 
A característica principal do veneno de B. jararaca é a intensa atividade 
proteolítica. Cidade et al. (2006) analisaram um transcriptoma da glândula de 
veneno de B. jararaca e identificaram que 53% dos transcritos de toxinas é 
constituído de metaloproteinases, e 28% é constituído de serinoproteinases. Grande 
parte das toxinas isoladas do veneno de B. jararaca tem ação sobre componentes 
da cascata de coagulação sanguínea ou sobre componentes da matriz extracelular e 
do epitélio vascular (Theakston e Kamiguti, 2002; Serrano e Maroun, 2005; Moura-
da-Silva et al. 2007). Do veneno da B. jararaca foram isolados e caracterizados 
diversos componentes que mostraram interferir em eventos envolvidos na 
hemostasia (Tabela 1), incluindo metaloproteinases, serinoproteinases, fosfolipases 
A2, lectinas tipo-C e uma nucleotidase. 
 
 
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Introdução	
  
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Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a hemostasia. 
Toxina Classe Atividade biológica Referência 
Bothrombina SP Atividade coagulante (liberação do 
fibrinopeptídeo A) sem efeito direto sobre 
plaquetas a menos que haja presença de 
fibrinogênio 
 
 
Nishida et al., 
(1994) 
PA-BJ SP Indução da agregação plaquetária pela 
interação com os receptores plaquetários 
PAR1 e PAR4 
 
Serrano et al., 
(1995); Santos et 
al., (2000) 
TL-BJ SP Atividade coagulante (liberação do 
fibrinopeptídeo A ) sobre plasma e 
fibrinogênio 
 
Serrano et al., 
(2000) 
KN-BJ SP Liberação de bradicinina do cininogênio 
bovino de baixo peso molecular e atividade 
coagulante (liberação do fibrinopeptídeo A) 
 
Serrano et al., 
(1998) 
Bothrops 
protease A 
SP Atividades amidolítica e fibrinogenolítica 
 
Mandelbaum e 
Henriques (1964); 
Murayama et al., 
2003; Paes-Leme et 
al., (2008) 
Bothropasina MP (P-IIIb) Hemorragia Mandelbaum et al., 
1982; Assakura et 
al., 2003 
 
Jararhagina MP (P-IIIb) Hemorragia 
 
Paine et al., 1992 e 
HF1 MP (P-III) Hemorragia 
 
Assakura et al., 
1986 
HF2 MP (P-III) Hemorragia 
 
Assakura et al., 
1986 
HF3 MP (P-III) Hemorragia Assakura et al., 
1986; Silva et al, 
2004 
 
Jararafibrase I MP (P-III) Hemorragia e fibrinólise 
 
 
Maruyama et al., 
1992 
Jararafibrase II, 
III, IV 
MP (P-II) Hemorragia e fibrinólise 
 
 
Maruyama et al., 
1992; Maruyama et 
al., 1993 
 
J proteinase MP (P-II) Atividade caseinolítica Tanizaki et al., 1989 
 
BJ-PI 
 
 
MP (P-I) Atividade fibrinogenolítica Oliveira et al., 2009 
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BJ-PI2 MP (P-I) Atividade fibrinogenolítica; pró-inflamatória Da Silva et al., 2012 
 
 
Bothrojaracina 
 
 
CTL 
 
Bloqueio da atividade da trombina sobre o 
fibrinogênio, bem como da ativação 
plaquetária mediada por fibrinogênio 
 
 
 
Zingali et al., 1993 
 
 
 
 
 
 
 
Bothrocetina CTL Indução da agregação plaquetária pela 
interação com o fator de von Willebrand 
Brinkhous et al., 
1981 
Jararaca GPIb-
BP 
CTL Inibição da agregação plaquetária pela 
interação com a glicoproteína plaquetária Ib 
Fujimura et al., 1995 
BJ-FLA2 
 
Bothrojaractivase 
FLA2 
 
MP (P-II) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NT 
Indução de agregação plaquetária 
 
Ativação do fator II da cascata de 
coagulação sanguínea e fibrinólise 
 
 
 
 
 
 
 
 
Inibição da agregação plaquetária induzida 
por ADP 
Serrano et al., 1999 
 
Berger et al., (2008) 
 
 
 
Santoro et al., 
(2009) 
 
 
 
 
NPP-BJ 
CTL –Lectina tipo-C; MP – Metaloproteinase; FLA2- Fosfolipase A2; SP- Serinoproteinase; 
NT nucleotidase. Tabela adaptada de Zelanis (2011) e atualizada. 
 
 
 
1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca 
 
A variabilidade individual do veneno de serpentes não é um assunto muito 
pesquisado; isso se dá pela dificuldade de manter os animais de forma individual 
nos biotérios. Embora o veneno de B. jararaca tenha sido alvo de diversos estudos, 
a extensão da variação individual de seu proteoma ainda é pouco conhecida. Em um 
estudo de Menezes et al. (2006) o proteoma do veneno de 18 espécimes de B. 
jararaca, provenientes de uma única ninhada, foi avaliado de forma individual, 
utilizando técnicas de eletroforese (unidimensional e bidimensional) e análise da 
atividades proteolíticas do veneno. Foi mostrado que venenos de fêmeas 
apresentavam um perfil eletroforético mais homogêneo quando comparado aos 
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machos, bem como uma maior atividade proteolítica sobre a caseína. Ainda, a 
variabilidade do proteoma do veneno desses 18 espécimes de B. jararaca não pôde 
ser atribuída a condições do meio ambiente, idade ou até mesmo a dieta, já que 
todas nasceram e foram criadas sob as mesmas condições em biotério, fato que 
aponta para a herança genética das serpentes exercendo um importante papel no 
fenótipo do veneno. De acordo com Pimenta et al. (2007) o perfil de LC-MS desses 
18 venenos individuais apresentou expressiva variabilidade. A análise da fração 
peptídica dos venenos por espectrometria de massas mostrou a presença de 11 
peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) (9a, 10b, 10c, 11a, 11d, 11e, 12b, 
12c, 13a, 13b, 14a) distribuídos pelos venenos, porém o único peptídeo que foi 
encontrado em todas as amostras analisadas foi o BPP13a. 
Em outro estudo, Furtado et al. (1991) mostraram que o veneno de filhotes de 
B. jararaca apresentava um valor 12 vezes mais alto para a atividade coagulante 
sobre o plasma quando comparado com o veneno dos adultos desta mesma 
espécie. No estudo de Zingali (1993) variações individuais também puderam ser 
vistas nos perfis de expressão de isoformas de bothrojaracina, um inibidor de 
trombina isolado do veneno de B. jararaca. Embora hajam estudos de variações 
individuais em venenos de serpentes, nada se sabe sobre essas variaçõesem 
venenos de filhotes. 
Em um estudo recente sobre a variabilidade do veneno de B. jararaca foi 
demonstrado que os venenos de espécimes filhotes e adultos apresentam atividade 
hemorrágica similar enquanto que o veneno de adultos tem uma atividade letal 
discretamente mais alta sobre camundongos, embora o veneno de filhotes seja 
extremamente mais potente sobre aves (Zelanis et al., 2010). Outro fato interessante 
é que a atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de dez vezes mais alta 
do que a do veneno de adultos. Essas diferenças nas atividades biológicas dos 
venenos foram também evidenciadas pelos perfis de eletroforese bidimensional, 
zimografia de gelatina, imunocoloração com anticorpos específicos, padrões de 
glicosilação e afinidade de glicoproteínas à concanavalina A. A análise da fração 
peptídica desses venenos revelou conteúdos diferentes de peptídeos em geral, 
enquanto que perfis semelhantes foram obtidos com relação aos BPPs. Em 
conjunto, esses resultados indicaram que a variação na dieta da B. jararaca, 
passando de presas ectotérmicas na idade juvenil para presas endotérmicas na vida 
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Introdução	
  
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adulta, está associada a mudanças no proteoma e peptidoma do veneno (Zelanis et 
al., 2010). Ainda, foi demonstrado que metaloproteinases estão entre as principais 
toxinas diferencialmente expressas nos venenos de indivíduos filhotes e adultos de 
B. jararaca e que o quociente de metaloproteinases da classe P-III/P-I é maior no 
veneno de filhotes do que no veneno de adultos (Zelanis et al, 2011). 
Em outro estudo foi mostrado que o transcriptoma de glândulas de veneno de 
espécimes adultos de B. jararaca apresenta principalmente transcritos de 
metaloproteinases (30%), precursor de peptídeos potenciadores de bradicinina 
(23%), lectinas tipo-C (22%), fosfolipases A2 (9%), e serinoproteinases (8%) (Zelanis 
et al., 2012). Por outro lado, em filhotes de B. jararaca, os transcritos de 
metaloproteinases são muito mais abundantes (53%), enquanto que outras classes 
de toxinas (fosfolipases A2, lectinas tipo-C, serinoproteinases e precursores de 
peptídeos potenciadores de bradicinina) aparecem em menor abundância. Esses 
achados, mostrando uma mudança substancial na composição do veneno durante o 
desenvolvimento do animal, correlacionam-se com análises de venenos de filhotes e 
adultos desta serpente, realizadas por abordagens proteômicas (Zelanis et al., 2010, 
2011). Utilizando abordagem proteômicas e peptidômicas, este trabalho visa analisar 
a variabilidade individual do veneno da serpente B. jararaca obtido de filhotes 
(Figura 1). 
 
 
 
 
Dias	
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Introdução	
  
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Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. (Foto:Sávio Stefanini)	
  
	
  
Considerando a variabilidade do veneno de B. jararaca relatada em diversos 
trabalhos e as implicações em aspectos clínicos e terapêuticos dos acidentes 
causados por filhotes e adultos de B. jararaca, torna-se importante um estudo 
detalhado, com um enfoque especial para a variabilidade individual dos venenos de 
filhotes. Uma abordagem proteômica associada a técnicas tradicionais de química 
de proteínas e ensaios biológicos pode evidenciar diferenças qualitativas ou 
quantitativas nos venenos de filhotes, fornecendo subsídios para o entendimento da 
variabilidade individual verificada nesta espécie e em venenos de outras espécies do 
mesmo gênero, no caso de venenos de espécimes adultos. Como regra geral na 
toxinologia, a exploração do conteúdo dos venenos de serpentes tem sido realizada 
com pools de venenos obtidos de espécimes adultos das serpentes, fato que aponta 
para o desconhecimento do conteúdo proteômico dos venenos de filhotes, e de sua 
variabilidade individual. 
 
 
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  2013	
  
Objetivos	
  
12	
  
	
  
 
	
  
	
  
2. OBJETIVOS 
 
 
O objetivo geral deste trabalho foi analisar as variações proteômicas 
individuais em venenos de espécimes filhotes de B. jararaca, nascidos na 
mesma época e mantidos nas mesmas condições de biotério. 
 
Objetivos específicos: 
 
- Analisar o perfil proteômico do veneno de cada espécime. 
- Analisar as variações proteômicas relacionadas ao sexo. 
 
 
 
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3. MATERIAL E MÉTODOS 
 
3.1. Extração dos venenos de filhotes 
 
A extração dos venenos de filhotes de B. jararaca foi realizada 
mensalmente, durante nove meses consecutivos no Laboratório de 
Herpetologia do Instituto Butantan, sob a coordenação do Pesquisador MSc. 
Savio Stefanini Sant'Anna. Foram selecionados espécimes filhotes (machos e 
fêmeas) de diferentes regiões do Estado de São Paulo, Santa Catarina e Minas 
Gerais e o estudo foi realizado com indivíduos cujo volume de veneno coletado 
era suficiente para a realização das análises, totalizando 21 amostras. Esses 
animais foram mantidos individualmente em cativeiro no Biotério de Serpentes 
do Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Para a extração de 
venenos, os animais foram inicialmente anestesiados com o auxílio de gás 
carbônico segundo protocolo descrito por Biasi et al. (1976) e, em seguida, o 
veneno foi extraído com o auxílio de capilares de vidro. 
Após a coleta, as amostras de veneno foram centrifugadas a 2000 x g, 
4°C, por 30 min, para remoção do muco salivar, bem como presas ou escamas 
que eventualmente estavam presentes no veneno extraído. Após este processo 
os venenos foram acondicionados a temperatura de -20°C até o momento do 
uso. Os venenos não passaram pelo processo de liofilização devido ao pouco 
volume obtido, e foram aliquotados para evitar repetitivos processos de 
descongelamento. 
 
3.2. Quantificação de proteínas 
 
A quantificação de proteínas presentes nos venenos foi realizada com 
diferentes quantidades de veneno, em triplicata, utilizando o reagente de 
Bradford (Bradford, 1976), adquirido da Sigma. Para estimar o teor protéico das 
amostras utilizamos uma curva padrão, construída com concentrações 
crescentes de soroalbumina bovina (Sigma). 
 
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3.3. Eletroforese de proteínas em gel de SDS-
poliacrilamida 
 
As análises eletroforéticas foram realizadas como descrito por Laemmli 
(1970). Foram utilizados géis de 10 x 8 cm x 1.5 mm e um sistema de 
eletroforese Hoefer (GE Healthcare). As amostras foram aquecidas a 95 °C 
durante 5 min e aplicadas em volume máximo de 30 µl. As corridas foram 
realizadas a temperatura ambiente. Para a coloração do gel foi utilizado o 
Coomassie Coloidal [(NH4)2SO4 8%, ácido fosfórico 0,68%, Coomassie Brilliant 
Blue-G250 (Sigma) 0,08%, metanol 25%]. A análise das imagens foi feita 
utilizando o software Image Master Platinum 6.0 (GE Healthcare). 
 
3.4. Atividade caseinolítica 
 
Para este ensaio foi utilizada a caseína N,N-Dimetilada (Sigma) como 
substrato, numa solução que continha 0,5 ml de solução tampão (Tris–HCl 0,1 
M, pH 8,8, CaCl2 0,01 M), contendo 0,01 mg ou 0,02 mg do veneno e 0,5 ml de 
caseína 2% (solubilizada no mesmo tampão), por 30 min, a 37 °C. A reação foi 
interrompida com 1 ml de ácido tricloroacético 5%, a mistura foi centrifugada a 
14.000 rpm, por 15 min e a absorbância do sobrenadante foi medida a 280 nm. 
Uma unidade de atividade foi definida como o aumento de 1 U da densidade 
óptica (DO) por min a 280 nm. A atividade específica foi expressa em 
unidades/mg de proteína. 
 
3.5. Atividadeamidolítica 
 
A atividade amidolítica foi determinada utilizando como substrato 
Benzoil-Arginil-p-nitroanilida (L-BAPNA) (Sigma), na concentração de 0,002 M 
em solução tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. O veneno foi utilizado nas doses 
de 0,01 mg e 0,02 mg de proteína em 450 µl de solução tampão. Após a adição 
da amostra de veneno à solução do substrato (450 µl), esta permaneceu por 30 
min a 37°C. A reação foi interrompida com 100 µl de ácido acético 30% e a p-
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nitroanilina que é liberada pela atividade amidolítica de serinoproteinases foi 
medida a 405 nm no espectrofotômetro (Gene Quant- Amersham Biosciences). 
 
3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima 
Coagulante (DMC) 
 
A Dose Mínima Coagulante (DMC) é definida como a menor quantidade 
de veneno capaz de coagular uma solução padronizada de fibrinogênio ou 
plasma citratado em 60 seg a 37°C (Theakston e Reid, 1983). Para este ensaio 
foi utilizado plasma humano citratado (contendo citrato de sódio 3,8%) e o 
ensaio foi realizado em triplicata. A 200 µL de plasma foram adicionados 100 
µL de veneno em diferentes concentrações (obtidas através de diluições 
seriadas). As soluções de plasma foram mantidas em banho de gelo durante o 
uso, e a 37°C, quando nas cubetas do fibrômetro (BBL Fibrosystem, Becton 
Dickinson). 
 
3.7. Análise do glicoproteoma 
 
Para a visualização das bandas de glicoproteínas presentes nas 
amostras de veneno analisadas por eletroforese foi utilizada a coloração 
fluorescente Pro-Q-Emerald (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. 
A coloração para glicoproteínas foi realizada após a separação das proteínas 
por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12%. A visualização das bandas 
foi obtida após a exposição dos géis em transiluminador de ultravioleta (UV) a 
300 nm. 
 
3.8. Análise por Western blot 
 
A visualização do sub-proteoma de metaloproteinases e 
serinoproteinases das amostras de veneno de B. jararaca foi realizada por 
imunocoloração com um antissoro policlonal anti-bothropasina 
(metaloproteinase da classe P-III do veneno de B. jararaca; (Mandelbaum et 
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al., 1982) e um antissoro policlonal anti-MSP1/MSP2 (serinoproteinases do 
veneno de B. moojeni; Serrano et al., 1993), respectivamente. Após a 
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12 % as proteínas dos venenos 
foram transferidas eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose 
(GE Healthcare) em uma cuba miniVE (GE Healthcare) preenchida com 
tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% e SDS 
0,037%). A transferência ocorreu sob voltagem fixa de 20V por 18 horas. Após 
este período, as membranas foram imersas em uma solução 0,5% de corante 
Ponceau S em ácido acético 1%, para se verificar a correta transferência das 
proteínas. Em seguida, as membranas foram lavadas com água destilada e 
imersas em uma solução de leite desnatado 5% em PBS (fosfato de sódio 
monobásico 0,05M, fosfato de sódio dibásico 0,05M, NaCl 0,15M) por 30 min, 
sob agitação. 
O anticorpo primário (policlonal, preparado em coelhos foi adicionado 
seguindo a diluição de 1:500 em uma solução de PBS contendo Tween 0,1%. 
As membranas foram incubadas por uma hora nesta solução, sob agitação. Em 
seguida, foram lavadas por 30 min com uma solução de PBS contendo Tween 
0,1%. Finalmente, foi adicionado o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho 
conjugado à peroxidase) na diluição de 1:1000 em solução de PBS contendo 
Tween 0,1% e as membranas foram imersas nesta solução por uma hora. A 
revelação se deu com a adição da solução de 4-cloro-1-naftol (Sigma) em Tris-
HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 e 0,5% de peróxido de hidrogênio. 
 
3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas 
por LC-MS/MS 
 
Bandas de proteínas de interesse, presentes no gel de SDS-
poliacrilamida, foram recortadas e submetidas ao processo de digestão in gel 
segundo o protocolo descrito por Hanna et al., (2000), com algumas 
modificações. Todos os reagentes que foram utilizados foram preparados no 
momento do uso. 
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Inicialmente os fragmentos de gel recortados foram incubados em 500 
µL de uma solução de metanol 50% /ácido acético 5% em água MilliQ® por 
duas horas. Em seguida, essa solução foi removida por aspiração com pipeta e 
500 µL foram adicionados aos fragmentos de gel, permanecendo por mais uma 
hora nesta solução. Em seguida, os fragmentos de gel foram desidratados pela 
incubação por 10 min (2 vezes de 5 min) em 200 µL de acetonitrila (100%). A 
solução de acetonitrila foi aspirada com pipeta e o restante evaporado em um 
sistema de concentração a vácuo (speed vac). Após esta etapa, os pedaços de 
gel foram reidratados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel) da solução 
redutora (ditiotreitol 10 mM em bicarbonato de amônio 100 mM). Decorrido o 
tempo de reidratação com DTT, a solução foi aspirada com pipeta e os 
fragmentos de gel foram incubados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel) 
da solução alquilante (Iodoacetamida 50 mM em bicarbonato de amônio 100 
mM). Em seguida, a solução alquilante foi removida por aspiração com pipeta 
e, os fragmentos de gel submetidos à incubação, por 10 min, em 100 µL (por 
fragmento de gel) de uma solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Após 
esta etapa, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e 200 µL (por 
fragmento de gel) de acetonitrila 100% foram adicionados e os fragmentos de 
gel incubados nesta solução por 5 min. A solução de acetonitrila foi retirada e, 
novamente, os fragmentos de gel incubados, por 10 min, em 200 µL (por 
fragmento de gel) da solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Na última 
etapa de desidratação, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e os 
fragmentos de gel incubados por 10 min (duas vezes de 5 min) em 200 µL de 
acetonitrila 100%. A solução de acetonitrila foi retirada por aspiração com 
pipeta e o restante evaporado em sistema speed vac. Os fragmentos de gel 
foram reidratados em 5 µL de uma solução de tripsina (50 ng/µL em 
bicarbonato de amônio 50 mM), em banho de gelo, por 30 min. Em seguida, a 
solução de tripsina foi retirada, uma solução de bicarbonato de amônio 50mM 
foi adicionada (em um volume suficiente para cobrir os fragmentos de gel) e os 
tubos contendo os fragmentos de gel foram incubados em banho 
termostatizado (a 37°C) por 18 horas. 
A extração dos peptídeos do gel foi feita com a adição de 30 µL (por 
fragmento de gel) da solução 1 - acido fórmico 5% (em água MilliQ) - e 
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incubação dos pedaços de gel por 10 min nesta solução, a temperatura 
ambiente. Em seguida, a solução contendo os peptídeos foi transferida para 
um novo tubo e, ao pedaço de gel do tubo anterior foram adicionados 12 µL 
(por fragmento de gel) da solução 2 - acido fórmico 5% em acetonitrila 50%. Os 
fragmentos de gel foram incubados por 20 min (duas vezes de 10 min) nesta 
solução, e a solução que foi transferida para o tubo contendo os peptídeos que 
foram extraídos com a solução 1. A solução será concentrada em speed vac e 
os peptídeos resultantes foram ressuspendidos em 20µL (por amostra) de 
ácido fórmico 0,1% e analisados em um espectrômetro de massas do tipo 
Quadrupolo – Tempo de Vôo com fonte de ionização nanospray (Q-ToF Ultima, 
Waters). 
Uma alíquota de4,5 µl da solução de peptídeos foi aplicada numa 
coluna de trapping (coluna C-18; 180 µm x 20 mm, diâmetro interno e 
comprimento, respectivamente, Waters) com fluxo de 15 µl /min, ajustado 
diretamente no programa do cromatógrafo nano Acquity (Waters). Em seguida 
a mistura de peptídeos foi submetida à cromatografia líquida de fluxo 
nanométrico, utilizando coluna C-18 capilar de 100 µm x 100 mm (Waters), 
num fluxo de 600 nl/min, com um gradiente de 0 a 80 % de acetonitrila 
(solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total de 20 min 
(3 % de B em 1 min; 60 % de B em 14 min; 80 % de B em 2 min e 30 
segundos; 80% de B em 1 min e de 80-3% de B em 1 min e 30 segundos). 
Como calibrante foi utilizada a infusão constante de uma solução de ácido 
fosfórico 0,1% / acetonitrila 25 % em água MilliQ®, num fluxo de 700 nl/min. 
No espectrômetro, a voltagem e a temperatura da fonte de ionização 
foram ajustadas para 3.4 kV e 100 °C, respectivamente. O espectrômetro foi 
operado no modo DDA, utilizando uma varredura de massas na região de m/z 
de 200 a 2000, seguida da dissociação induzida por colisão dos 3 íons mais 
intensos. O espectrômetro foi ajustado para operar com um tempo de exclusão 
dinâmica de 90 segundos (para se diminuir a aquisição repetitiva de um mesmo 
valor de m/z). 
 
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3.10. Análise do perfil proteico dos venenos por 
espectrometria de massas (LC-MS) 
 
Uma alíquota de 4,5 µl da solução de veneno (contendo 1 µg, em ácido 
fórmico 0,1 %) foi aplicada numa coluna de trapping (conforme descrito no item 
3.9.). A cromatografia ocorreu utilizando um gradiente de 0 a 80 % de 
acetonitrila (solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total 
de 60 min (3 % de B em 1 min; 45 % de B por 57,5 min; 80 % de B por 1 min e 
voltando a condição inicial de 80-3% de B em 1 min). A análise de massas foi 
realizada utilizando o espectrômetro Q-TOF Ultima (Waters), utilizando os 
mesmos parâmetros descritos anteriormente (item 3.9). 
 
3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise 
em banco de dados 
 
Para identificação dos peptídeos gerados pela digestão das proteínas 
com tripsina utilizamos o banco não redundante do National Center for 
Biotechnology Information (nrNCBI Databank) e restringimos o universo de 
busca à taxonomia Serpentes, que contava com 25211 proteínas depositadas 
na data 20 de Junho de 2011. Como parâmetros de busca foram utilizados: i) 
uma clivagem perdida pela tripsina; ii) resíduos de cisteína carbamidometilados 
(que foram escolhidos como uma modificação fixa) e resíduos de metionina 
oxidados (que foram escolhidos como uma modificação variável). Utilizando o 
programa Mascot (Matrix Science), acessado através de um servidor instalado 
no Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada (Mascot Server versão 2.2), 
para identificação, foram considerados os peptídeos cujos íons individuais 
excederam os valores de homology score associados e cujos scores para os 
íons de carga +1,+2, +3 e +4 e apresentaram valores maiores ou iguais a 10, 
20, 20 e 40, respectivamente. 
 
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3.12. Análise estatística comparativa de algumas 
propriedades dos venenos 
 
As amostras foram divididas em dois grupos: machos (n= 9) e fêmeas 
(n= 12). As variáveis analisadas foram: concentração proteica, atividade 
caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Para cada variável, 
foi realizado o teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov (Henderson, 2006), 
que mostrou que todas apresentavam distribuição normal. 
Para a comparação de médias entre os dois grupos, empregou-se o 
Teste T com amostras independentes, considerando igualdade de variâncias 
em todas as comparações, fator este definido através da análise de igualdade 
de variâncias (estatística F). Para o Teste T, considerou-se um intervalo de 
confiança de 95%. 
Para a realização das análises estatísticas foi utilizado o pacote Action® 
(Estatcamp), que é um software livre (URL: http://www.portalaction.com.br), 
instalado como suplemento do MicrosoftTM Excel. 
Para a análise de cluster, foi utilizado o método de agrupamento 
hierárquico, considerando como parâmetros a distância euclidiana e 
encadeamento completo. As variáveis utilizadas na análise foram: sexo, 
atividade caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Foi omitida 
da análise a informação acerca da procedência geográfica das amostras, de 
modo que qualquer agrupamento que porventura separasse as amostras de 
acordo com a região de procedência seria baseado um reflexo das 
características do veneno e/ou sexo das serpentes. 
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4. RESULTADOS 
 
4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos 
individuais de filhotes de B. jararaca 
 
Para este estudo foram coletadas amostras individuais de veneno de 21 
filhotes de B. jararaca. A coleta foi realizada mensalmente, durante 9 meses 
consecutivos, juntamente com o Pesquisador Msc. Sávio Sant´anna. Embora 
nascidas no Instituto Butantan, no Laboratório de Herpetologia, sua 
progenitoras (que chegaram em estado de prenhez) são provenientes de 9 
regiões diferentes (Tabela 2). A quantificação de proteínas foi feita utilizando 
duas concentrações do veneno em triplicata. A concentração de proteínas nos 
venenos frescos variou entre os indivíduos, porém a maioria deles apresentou 
valores entre 110 a 120 mg/ml, enquanto que dois espécimes apresentaram 
valores extremos abaixo (87 mg/ml) e acima (135 mg/ml) de concentração 
proteica (Tabela 3). 
 
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Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados neste estudo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Amostras Procedência Sexo 
1 São Bento do Sul-SC ♂ 
2 São Bento do Sul-SC ♀ 
3 São Bento do Sul-SC ♂ 
4 São Bento do Sul-SC ♂ 
5 São Bento do Sul-SC ♀ 
6 São Bento do Sul-SC ♂ 
7 São Bento do Sul-SC ♂ 
8 São Bento do Sul-SC ♂ 
9 Pilar do Sul-SP ♂ 
10 Pilar do Sul-SP ♀ 
11 Ibiúna-SP ♀ 
12 Ibiúna-SP ♀ 
13 São Lourenço da Serra-SP ♂ 
14 São Lourenço da Serra-SP ♀ 
15 São Lourenço da Serra-SP ♀ 
16 Extrema-MG ♀ 
17 Pilar do Sul-SP ♂ 
18 Araçariguama-SP ♀ 
19 Santana do Parnaíba-SP ♀ 
20 Ribeirão Pires-SP ♀ 
21 Tapiraí-SP ♀ 
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Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B. jararaca 
filhotes. 
 
Venenos Concentração proteica 
(mg/ml) 
1 86,64 ± 3,9 
2 108,28 ± 4,4 
3 113,15 ± 3,3 
4 90,9 ± 10,7 
5 110,86 ±14,2 
6 128,16 ± 3,9 
7 116,67 ± 16,2 
8 131,24 ± 12,0 
9 118,97 ± 10,0 
10 122,38 ± 11,5 
11 110,09 ±5,7 
12 129,71 ± 8,7 
13 123,35 ± 10,1 
14 110,50 ± 11,4 
15 118,91 ± 16,6 
16 127,76 ± 17,4 
17 127,24 ± 18,0 
18 106,15 ± 10,3 
19 134,66 ± 13,1 
20 119,13 ± 15,9 
21 108,92 ± 15,7 
Os valores representam a média ± desvio padrão de 3 determinações. 
 
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4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de 
venenos de filhotes de B. jararaca 
	
  
Para a comparação dos proteomas dos venenos, a análise do perfil 
eletroforético, seja ela realizada com ou sem redução das pontes de dissulfeto 
das proteínas,é uma técnica útil para se entender a natureza da complexidade 
dos componentes do veneno. Para visualização inicial do perfil protéico 
individual dos venenos, 20 µg de cada amostra foram submetidos à 
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12% e os géis foram corados com 
Azul de Coomassie Coloidal. 
Diversas diferenças foram visualizadas entre as 21 amostras de venenos 
de filhotes, sendo elas pertencentes à mesma ninhada ou à ninhadas 
diferentes. A variabilidade também pôde ser vista de acordo com o sexo e a 
região. Na Figura 2, pode-se verificar bandas distintas no perfil eletroforético, 
em condições não redutoras, desde a região de massa molecular abaixo de 10 
kDa, até acima de 70 kDa. Foram visualizadas bandas similares, mas não 
idênticas em intensidade, em todas as amostras, como aquelas presentes na 
região de 45-50 kDa. Verificamos também que todas os venenos apresentaram 
perfil de bandas bem distinto na região de 18 a 22 kDa. Na Figura 2, as massas 
moleculares indicadas para as bandas de proteínas dos venenos não são 
exatas já que as proteínas não foram submetidas à redução de suas pontes de 
dissulfeto e assim não são comparáveis exatamente àquelas das proteínas 
marcadoras de massa molecular que foram submetidas à redução.