Aula 04-Introdução a Cromatografia

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Introdução a cromatografia
Carlos Eduardo
 Definição de Cromatografia
Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes compostos em duas fases, que estão em contato íntimo
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais desses compostos. 
 Definição de Cromatografia
os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma das quais é estacionária (Fase estacionária) e a outra (Fase móvel) move-se em uma direção definida.
	A cromatografia pode ser utilizada
para a identificação de compostos, por
comparação com padrões previamente
existentes, para a purificação de
compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura.
 Definição de Cromatografia
Histórico
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
 Histórico da Cromatografia
1903-1906
Tswett
Michael 
Tswett
Separação de carotenóides 
e outros pigmentos
Botânico Russo
CaCO3 e
Alumina
mistura 
de 
pigmentos
Dissulfeto de carbono
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As diferentes formas de cromatografia:
1. Classificação pela forma física do
sistema cromatográfico
2. Classificação pela fase móvel
empregada
3. Classificação pela fase
estacionária utilizada
4. Classificação pelo modo de
separação
1. Classificação pela forma física do
sistema cromatográfico
		cromatografia em coluna 
		cromatografia planar.
EM COLUNA: cromatografia líquida, gasosa e supercrítica.
PLANAR: Centrífuga, em papel e camada delgada.
7
2. Classificação pela fase móvel empregada
		
-cromatografia gasosa
		
-cromatografia líquida
 		
-cromatografia supercrítica
cromatografia líquida clássica (CLC) ;
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
cromatografia gasosa (CG)
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR)
3. Classificação pela fase
estacionária utilizada
- fases estacionárias sólidas:
	
 
- fases estacionárias líquidas 
		este pode estar simplesmente adsorvido sobre um 	suporte sólido ou imobilizado sobre ele. 
- fases estacionárias quimicamente ligadas.
. 
4. Classificação pelo modo de
separação
Adsorção, 
Partição, 
Troca iônica, 
Afinidade, 
Exclusão ou misturas desses mecanismos.
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: 
	separação de moléculas pela massa molecular
	géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
	separação de moléculas pela carga elétrica
	géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
	separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
Cromatografia de afinidade:
	separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante 	géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia por adsorção
Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc.
AMOSTRAS
Fase estacionária
 (suporte sólido)
X
 Fase móvel
(líquido ou gás)
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
Duas Possibilidades
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária
Consiste de 2 sistemas:
Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um valor de Rf característico. 
Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação) diferentes compostos.
Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o composto isolado.
Cromatografia de Partição
distância de migração da substância
distância de migração do solvente
R
f 
=
Papel
ou placa de sílica
Amostra na origem
tempo 0 t 1 t2 tn 
direção do fluxo do solvente
Compostos separados
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
 grãos (beads) da resina com poros 
grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão “empurra” moléculas através da resina
tubos
 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. 
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). 
 Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
Cromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions 
Trocadora de cátions 
DEAE
CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
-
-
-
-
-
-
-
O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Cromatografia de troca iônica 
Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção
Eluição
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 
adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; 
eluição das proteínas adsorvidas.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Matrix
Affinity Ligand
Cromatografia por afinidade
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
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Passo 1: Carregamento da coluna
Passo 2: Chegada das moléculas
Passo 3: Interação das moléculas com os grupamentos ligantes
Cromatografia por afinidade
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
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Passo 4: Eliminação das moléculas não ligadas
Passo 5: Eliminação das fracamente ligadas
Passo6: Eluição da molécula de interesse e coleta da amostra purificada
Cromatografia por afinidade
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Diferentes tipos de cromatografia
Cromatografia planar (CP)
é uma técnica de partição líquido–líquido;
 Baseia-se na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases imiscíveis;
Este método é muito útil para a separação de compostos polares, sendo largamente usado em bioquímica.
Cromatografia planar (CP)
uma amostra líquida flui por uma tira de papel;
As moléculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela água;
atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa (polar).
Uma tira de papel de filtro 2 cm x 7 cm 
Fazer um círculo a 2 cm de distância da borda inferior
Fase Móvel:
etanol,
água 
Cromatografia planar (CP)
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	É uma técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária.
O Fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6.
Cromatografia em Camada Delgado (CCD)
Cromatografia em Camada Delgado (CCD)
Cromatografia em coluna
A cromatografia líquida clássica
 
é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas.
 
As fases estacionárias mais utilizadas são :
A sílica gel é a fase estacionária mais utilizada, 
sendo seguida pela alumina,
 pela celulose
Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição.
Cromatografia em coluna
Cromatografia em coluna
Concentração
Tempo ou volume
Coletor de frações 
Tempo 1
Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina
Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão
Tempo 2
Tempo n
Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações
Amostra com diferentes componentes 
Resina embebida em tampão 
Tempo zero
Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
Cromatografia em coluna
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Referências Bibliográficas
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográficos. 5ª ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993.
LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Performance liquid chromatography: fundamental principles and practice. Blackie Academic and Professional, 1995. 
CHAVES, M.H.; Análise de extratos de plantas por CCD: uma metodologia aplicada à disciplina “Química Orgânica”. Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562, 1997.
ANDRADE, J.B.; PINHEIRO, H.L.C.; LOPES, W.A.; MARTINS, S.; AMORIM, A.M.M. e BRANDÃO, A.M. Determinação de cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Química Nova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.
NETO, F.R.A.; CGAR em análise de resíduos. Química Nova, v. 18, n. 1, p.65-67, 1995.
Obrigado!