Aula 05-CLAE

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Fundamentos da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência – CLAE
2013
Carlos Eduardo Miranda de Sousa
Farmacêutico CRF-PE 3408
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http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/Waters_HPLC_MS_TitlePg.html
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE (HPLC)
 A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados. 
 É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, cheias de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. 
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE (HPLC)
As separações cromatográficas produzem-se por um balanço de afinidades entre a amostra, a fase móvel e a fase estacionária (coluna cromatográfica).
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE (HPLC)
 Cromatografia líquida de alta velocidade;
 Cromatografia líquida de alto Desempenho;
 Cromatografia líquida de alta resolução;
 Cromatografia líquida de alta EFICIÊNCIA;
SINÔNIMOS
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Faz-se uso de uma coluna fechada, reaproveitável; 
A fase móvel é impulsionada através das colunas por um sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna;
As amostras são injetadas com auxílio de microseringas ou válvula de injeção;
Pode se fazer uso de diversos tipos de detectores;
Para o registro dos dados, pode usar um integrador e até um microcomputador.
 Princípios – CLAE (HPLC)
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 Princípios – CLAE (HPLC)
O HPLC emprega um conjunto de equipamentos especiais:
-Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel (Solvente ou Solventes);
-Sistema de Introdução da Amostra
-Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase Estacionária)
-Sistema de Detecção
-Sistema de Registro e Tratamento dos Dados
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 Princípios – CLAE (HPLC)
O HPLC emprega um conjunto de equipamentos especiais:
-
8
 Termos importantes
 Eluição:
	Passagem da FM (Eluente) pela FE
 Fase Móvel (FM):
	Mistura de solventes
 Fase Estacionária (FE):
	Sólido empacotado (coluna)
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 Eluato:
	Solvente + Solutos
 Banda Cromatográfica:
	Quando o pico está na coluna
 Termos importantes
 Cromatograma:
	Gráfico do detector
 Pico Cromatográfico:
	Gráfico do detector
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 Termos importantes
 Cromatógrafo:
	Instrumental utilizado
 Volume morto:
Tempo referente a uma substância sem retenção pela coluna
 Volume da coluna:
Volume de FM suportado pela coluna
V
=
0.68 x π x r2 x L
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w na linha de base
Fator de Capacidade;
Fator de seletividade;
Resolução;
Pratos teóricos;
Fator de cauda 
Parâmetros Cromatográficos
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Fator de capacidade e Fator de seletividade
13
Fator de capacidade
Se: 
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,33
k2 = 1,8
t 
r
o
o
k
=
t
t
14
Como ajustar o K?
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0 2 4 6 8 10
k’
Rs
1- 20
2- 10
Situação ideal:
 2 < k < 10 
K < 2	
baixa afinidade pela coluna
K > 10 
tempo longo de análise 
alargamento de bandas
R - Ajuste do percentual de solvente orgânico na fase móvel
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Fator de seletividade
k1 = 1,33
k2 = 1,8

k2
=
k1
Se: 
k1 = 1,3 
k2 = 1,8
Logo:
 = 1,38 
= 1 
Não houve separação
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Rs = 0.8
Rs = 1.25
Rs = 1.0
Resolução
Em função de:
 Seletividade ();
 Eficiência da coluna (N);
 Fator de retenção (k)
R
=
(
α-1 
√N
1
4
(
k
1+k
α
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Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Resolução
a
b
c
d
a
b
c
d
a
b
c
d
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
[ MeOH/THF/H2O ]
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Fator de cauda
É uma medida de simetria do pico, que pode ser calculada pela equação:
		T = a/b
AS= fator de simetria W 10%;
TF= fator de calda W 5%;
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
CASOS 
PRÁTICOS
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
Fase Móvel
Fase Móvel – Características
Elevado grau de pureza ou de fácil purificação;
Dissolver pouco gases (oxigênio); 
Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
Apresentar baixa viscosidade;
Ser compatível com o tipo de detector utilizado;
Apresentar polaridade adequada para a separação conveniente dos componentes da amostra;
Minutes
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
mAU
0
10
20
30
40
50
mAU
0
10
20
30
40
50
60
60
Fase Móvel: Acetonitrila/Água
Composição
Área
Altura
Assimetria
Tr
75:25
217620
5521
1.62
1.356
70:30
217469
25558
1.34
4.195
50:50
216527
15254
1.27
7.693
Média
NA
217205
32111
NA
4.41
DESPAD
NA
592
20918
NA
3.17
CV%
NA
0.27
65.14
NA
71.90
Fase Móvel- Eluição
Fase Móvel
27
Minutes
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
mAU
0
10
20
30
40
50
mAU
0
10
20
30
40
50
60
60
3.067
 
3.792
4.270
 
5.499
Gradiente de Fase Móvel
Fase Móvel
Bomba
Injetor
Coluna
Detector
Uma Bomba controla
até 4 canais de solvente;
A mistura é feita 
antes da bomba.
Válvula
Software
Fase móvel
INSTRUMENTAÇÃO
Bedor, D.C.G.
Injetores:
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Fase Estacionária – Características
Comprimento e diâmetro interno;
Tamanho de partículas;
Uniformidade e forma regular das partículas;
Enchimento uniforme da coluna;
Baixo custo;
Provoquem pequena queda de pressão.
Fase Estacionária – Características
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS): Aplicações em Farmácia
Bedor, D.C.G.
OBRIGADO
Contato:
Eduardo.miranda@nudfac.com.br
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