Adesão Bacteriana e Biofilmes em Alimentos

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Adesão Bacteriana e Formação de 
Biofilmes
Emiliane Andrade Araújo
III Simpósio do Programa de Educação Tutorial 
de Economia Doméstica: Segurança Alimentar
Universidade Federal de Viçosa
“Os microrganismos se depositam, 
interagem nas superfícies, iniciam o 
crescimento e, ao se liberarem, podem 
contaminar os alimentos”
Andrade, 2008
Expectativa do consumidor
Obtenção de alimentos:
Nutritivos
Saborosos
Seguros
Agentes Etiológicos
Bactérias
Fungos micotoxigênicos
Vírus
Protozoários
Agentes Químicos
Produção de Alimentos Seguros
Matéria prima (água)
Superfícies
Ar do ambiente de processamento
Manipuladores
Adesão e formação de biofilmes
Aspectos desejáveis
a) Obtenção de produtos fermentados
b) Tratamento de resíduos
c) Tratamento de água
Adesão e formação de biofilmes
Aspectos indesejáveis
a) Aumento da resistência à sanitizante
b) Processos corrosivos em equipamentos
c) Veiculação de microrganismos alteradores 
ou patogênicos
Aspectos relevantes
i) Natureza da superfície
ii) Natureza da microbiota contaminante
iii) Qualidade de água
iv) Ar de ambientes de processamento
v) Detergentes e Sanitizantes
vi) Procedimentos Operacionais Padronizados
Adesão Microbiana
a) Microrganismos Planctônicos
b) Microrganismos Sésseis
c) Microbiota Deterioradora
d) Microrganismos Patogênicos
e) Formas Esporuladas
Adesão e formação de biofilmes
Características dos microrganismos
Espécie, concentração de microrganismos, 
produção de EPS, hidrofobicidade, carga 
elétrica superficial, flagelo, fimbria, píli.
Superfícies
Microtopografia, tipo de resíduo, carga 
elétrica superficial, hidrofobicidade
Adesão e formação de biofilmes
Superfícies envolvidas 
Aço inoxidável, polietileno, polipropileno, 
policarbonato, vidro, aço carbono, teflon
Microrganismos envolvidos
Pseudomonas aeruginosa, P. fragi, 
Enterococcus faecium, Micrococcus spp, 
Listeria monocytogenes, Yersinia 
enterocolitica, Salmonella tiphy, Escherichia 
coli O157:H7, Staphylococcus aureus, 
Bacillus cereus, B. subtilis, B. 
stearothermophillus, B. sporothermodurans
Rugosidade da superfície
Adesão e formação de biofilmes
Adesão bacteriana: entre 104 e 105 UFC.cm-2
Biofilme bacteriano: entre 106 e 107 UFC.cm-2.
E a presença de exopolissacarídeos?
Mecanismo da adesão bacteriana
Ocorre em duas etapas
A. Microrganismos são atraídos para a superfície
por forças de van der Waals e por atração
eletrostática (Reversível).
B. Microrganismos produzem EPS que suportam a
adesão ( Irreversível).
(Marshal et al., 1971)
Mecanismo da adesão Bacteriana
Ocorre em 6 etapas
A. Transporte de nutrientes e matéria orgânica à
superfície
B. Formação de uma camada de nutrientes
C. Adesão do microrganismo à superfície
D. Crescimento celular
E. Intenso metabolismo no biofilme.
F. Liberação dos microrganismos das superfícies
Mecanismo teórico de vários estágios de 
adesão e formação de biofilmes
Bactéria
>50 nm Bactéria Bactéria
10 -20 nm <1,5 nm
Bactérias Bactérias
Deposição de 
matéria 
orgânica e 
inorgânica
Forças Van 
der Waals
Forças Van der 
Waals, 
interações 
eletrostáticas
Forças Van der 
Waals, interações 
eletrostáticas, 
interações 
específicas
Região reversível Região irreversível
Fonte: Busscher e Weerkamp (1987), Characklis (1984), Marshall (1971), Notermans et 
al. (1991)
Apêndices celulares bacterianos
Forças de adesão à superfícies
Adesão Bacteriana Reversível e 
Irreversível
Microtopografia da superfície de polietileno de 
regiões consideradas lisas, obtida pela 
microscopia de força atômica
Microtopografia da superfície de polietileno, 
contendo fendas e elevações, obtida pela 
microscopia de força atômica
Entender as interações eletroquímicas que ocorrem 
entre a bactéria e o substrato é importante no 
desenvolvimento de métodos de prevenção de adesão 
em superfícies comumente utilizadas no 
processamento de alimentos.
Adesão de Staphylococcus aureus ATCC 
6538 em policarbonato, observada em 
microscopia de epifluorescência
Adesão em superfícies
Staphylococcus aureus, 
aço inoxidável ASI 304, #4
Listeria inoccua, em 
polipropileno
Biofilme de Pseudomonas fragi em polietileno
MEV : Estágio inicial de um biofilme (5000X)/Pseudomonas 
fragi, 6h de incubação, aço inoxidável 
(Zoltai et al, 1981)
MEV: Um biofilme : Pseudomonas fragi ATCC
4973 aderida em aço inoxidável.
(Herald & Zottola, 1988
MEV : Biofilme: células de Pseudomonas fragi firmemente
aderidas em aço inoxidável após 24 horas de incubação.
Presença de exopolissacarídeo.
(Zoltai et al.; 1981)
Fotomicrografia e Escherichia coli O157:H7 aderida: 
flagelo e exopolissacarídeo evidentes.
(Bower et al., 1996)
Adesão e Formação de Biofilmes
• Como Avaliar ?
• Como Prevenir ?
Metodologias
• Testes laboratoriais;
• Teste em uso;
• Teste em uso simulado.
Metodologias
Testes laboratoriais
Métodos não visuais: Contagem em placas
Métodos visuais:
Microscopias Ótica
Contraste de fase
Epifluorescência
Eletrônica de varredura
Eletrônica de transmissão
Eletrônica de força atômica
Adesão por imersão e contagem
vortex
cupom
adesão Diluições seriadas
Remoção de 
planctônicas
Remoção 
de sésseis
Microscopia de Epifluorescência
• Quantificação de células aderidas às superfícies
transparentes ou não;
• Alaranjado de acridina;
• Bactérias vivas se coram de cor laranja;
• Resultado expresso em contagem direta ao microscópio 
por cm2 (CDM. cm-2);
Nº médio das células aderidas x fator do microscópio
Microscopia Eletrônica de Varredura
Permite analisar a interação
microbiana na matriz do
biofilme;
Ampla gama de aumento;
Alta resolução;
Rápida digitalização de
captação de imagens.
Andrade, 2008
Microscopia de força atômica
• Caracterização das propriedades das
superfícies;
• Não necessita de preparo prévio da amostra;
• Medidas em dimensões nanométricas.
Representação da técnica da microscopia de força atômica.
Fonte: SIBER, 2007.
Listeria innocua aderida em mica (MFA)
Fotomicrografia de superfície de poli (cloreto de vinila) (PVC) dupla face 
rugosa por microscopia eletrônica de varredura (microscópio LEO 1430 
VP). a) e b) aspectos não uniformes da superfície, c) ondulações com 
diâmetros variados; d) depressões com diâmetros variados
Fotomicrografia de superfície (PVC) com revestimento de tecido grosso 
por microscopia eletrônica de varredura a) presença de elevações; b) 
presença de microfuro, c) esgarçamento do tecido (seta); d) porosidade
Microscopia de epifluorescência
Aço inoxidável
6 h
PVC revestimento grosso
8 h
Granito
2 h
Mármore
8 h
PU dupla face
6 h
PVC revestimento fino 
10h 
Klebsiella oxitoca aderida em superfície 
de alface
Klebsiella oxitoca aderida em estomato de 
alface
Klebsiella oxitoca aderida a 
superfície de Alface
Metodologias
Teste em uso
Swab;
Rinsagem;
Placas de contato;
ATP bioluminescência.
Swab
Andrade, 2008
ATP bioluminescência
Andrade, 2008
Vantagens Capaz de detectar microrganismo e resíduo 
de alimentos;
Técnica simples e fácil de usar;
Resultado rápido.
Desvantagens Não detecta microrganismo patogênico;
Análise de apenas partes acessíveis do 
equipamento;
Custo elevado.
Metodologias
Teste em uso simulado
Transferência das condições da indústria para o
laboratório;
Desenvolvimento de metodologias e equipamentos parasimular as diversas condições;
São testes trabalhosos e exigem criatividade.
Modelo de linha de circulação de leite 1) cupom de prova curva 90 º; 2) cupom 
de prova cilíndrico; 3) cupom de prova tê; 4) controle de potência; 5) tanque 
com capacidade de 25 litros; 6) bomba centrífuga; e 7) controle de vazão.
Montagem do procedimento de administração da dieta em laboratório
Vamos analisar esta fotomicrografia sob 
a ótica interdisciplinar? 
A bactéria Pseudomonas fluorescens está aderida à 
superfície do aço inoxidável de um pasteurizador de 
leite.
Conhecimentos de microbiologia (Ciência) :
A bactéria possui flagelos, fimbria, píli, 
exopolissacarideo? É Gram positiva? É Gram 
negativa?
Conhecimentos de físico-química (Ciência)
Está adesão está suportada por forças de van der 
Waals, interações eletrostáticas, interações 
específicas?
Conhecimentos de Engenharia 
Qual a rugosidade da superfície? (Ra, Rz)
Qual a viscosidade do alimento? 
Qual a velocidade/Vazão/ no de Reynolds do 
alimento na superfície? 
Importância do conhecimento:
Aspectos que afetam o processo de adesão 
microbiana 
Conhecimentos envolvidos (Tecnologia):
Qual é o alimento e sua composição? 
Como os resíduos serão removidos?
Como os microrganismos serão removidos? 
Qual a importância da qualidade de água? 
Definicão de um Procedimento Operacional 
Padronizado (POP)
Dúvidas