Relatório 4 - Polifenoloxidases

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Avaliação da atividade e controle das
polifenoloxidases em alimentos
Eduardo Santos
João Pedro Mattiello
Matheus Spagiari
Ricardo Cavalheiro
Departamento de Ciências dos Alimentos, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av Bento Gonçalves nº 9500, CEP 91540-000,
Porto Alegre-RS, Brasil.
Porto Alegre, 27 de Novembro de 2013.
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Objetivo
Este trabalho tem como objetivo avaliar a ação das polifenoloxidases em frutas, assim como demostrar a atividade e as formas de controle dos efeitos das polifenoloxidases.
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 Introdução
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O escurecimento enzimático está relacionado à ação das enzimas polifenoloxidase (PPO) e peroxidades (POD), que utilizam compostos fenólicos como substratos e provocam alterações indesejáveis na cor, sabor e aroma dos vegetais.
O escurecimento enzimático é uma das reações mais estudadas em frutas, legumes e alimentos marinhos. Pesquisadores nas áreas de ciências dos alimentos, horticultura e fisiologia pós-colheita têm estudado esse fenômeno, devido à diversidade do seu impacto nestes sistemas; e como conseqüência o estudo da polifenoloxidase de vegetais é um tema de grande destaque, pela sua importância tanto na fisiologia quanto na bioquímica de diversos vegetais.
As polifenoloxidases (PPO) fazem parte de um grande grupo de enzimas conhecidas como oxidorredutases que oxidam fenóis a o-quinonas na presença de oxigênio molecular.
A PPO está amplamente distribuída na natureza, principalmente no reino vegetal, mas ocorre também em bactérias, fungos, plantas, mamíferos, artrópodes e crustáceos tais como camarão, lagosta e caranguejo.
A PPO é uma enzima que contém cobre no sítio ativo (figura 1) e atua como oxidase de função mista, catalisando dois tipos diferentes de reações, ambas na presença de oxigênio molecular: hidroxilação de monofenóis para o-difenóis e a oxidação de o-difenóis em compostos de cor ligeiramente amarela, as o-quinonas (figura 2).
Figura 1. Estrutura oxidada da catecolase de batata doce.
Figura 2. Reações catalisadas pela PPO e formação de compostos escuros (melaninas).
Procedimento Experimental
Avaliação da atividade da polifenoloxidase
Preparo do suco de maçã: 
descascou-se e extraiu-se a parte central da maçã. A qual foi homogeneizada em liquidificador com 250 mL de água destilada gelada. Por fim o extrato foi filtrado e mantido em Becker com gelo. 
Preparo dos tubos de ensaio:
Tubo 1) 5mL de água + 5mL do filtrado de maçã. Agitado e deixado a temperatura ambiente por 30 min; (Controle)
Tubo 2) 5mL de tampão pH 4,0 + 5mL do filtrado de maçã. Agitado e deixado a temperatura ambiente por 30 min;
Tubo 3) 5mL de tampão pH 8,0 + 5mL do filtrado de maçã. Agitado e deixado a temperatura ambiente por 30 min;
Tubo 4) 0,020g de bissulfito de sódio + 5mL do filtrado de maçã. Agitado e deixado a temperatura ambiente por 30 min;
Tubo 5) 0,020g de ácido ascórbico + 5mL do filtrado de maçã. Agitado e deixado a temperatura ambiente por 30 min.
Controle da atividade da polifenoloxidase
Foi descascados os vegetais (maçã, pêra ou batata) e divididos em seis partes aproximadamente iguais.
E preparados os copos de Becker da seguinte forma:
Becker 1) Vazio a temperatura ambiente;
Becker 2) Vazio a temperatura de 40° C e triturando a amostra;
Becker 3) Água destilada, temperatura ambiente;
Becker 4) Solução de Ácido Cítrico 0,2% (pH 2,5);
Becker 5) Solução de Ácido Cítrico 4% (pH 1,0);
Becker 6) Solução de Bissulfito de Sódio 2 ppm
Após 10 min e, com o auxílio de uma pinça, foram retirados os pedaços dos beckers 3, 4 e 5 e deixados sobre uma toalha de papel, identificando as amostras. Então foi observado o escurecimento das amostras.
Resultados
Avaliação da atividade da polifenoloxidase
Depois de passado o tempo foi verificado as mudanças de coloração assim como é mostrado na figuras 3 abaixo:
Figura 3. Tubos de ensaio de 1 à 5 (da esquerda para direita) para avaliação da atividade da polifenoloxidase.
O tubo 1 (mais a esquerda) apresentou uma coloração escurecida, sendo este considerado o tubo controle do processo.
O tubo 2 apresentou uma coloração um pouco menos escurecida com relação ao controle, isto devido a utilização da solução tampão de pH 4 a qual se distância do pH ótimo para o processo de escurecimento (pH 6 – pH 7).
O tubo 3 foi o que se apresentou mais escuro devido a utilização da solução tampão de pH 8 que se aproxima do valor ideal, citado anteriormente.
Os tubos 4 e 5 apresentarão coloração semelhante, ambos mais claro que o tubo controle. Isso devido à utilização do bissulfito de sódio que atua como redutor e a utilização do ácido ascórbico que diminui o pH da solução de forma análoga ao tubo 2. 
Controle da atividade da polifenoloxidase
Após transcorrido o tempo determinado foi possível avaliar as mudanças de coloração como é mostrado na figura 4.
Figura 4. Pedaços de frutas retirados dos beckers após o tempo determinado.
Os pedaços de frutas número 1 são considerados os controles da análise e possuem uma coloração escurecida devido a ação do oxigênio do ar. Estes são seguidos pelo pedaço que apresentou o maior escurecimento (2), isso devido a ter ficado exposto a temperatura de 40°C, temperatura esta a qual a enzima possui a maior atividade.
Os pedaços de número 3 apresentaram um escurecimento reduzido com relação ao controle devido estarem imersos em água, sem a presença de oxigênio para reagir.
Os pedaços apresentados em 4 e 5 sofrem o mesmo efeito da avaliação da atividade da polifenoloxidase, o bissulfito de sódio vai atuar como redutor e a utilização do ácido ascórbico vai diminui o pH afastando do pH ótimo para a enzima.
	
Conclusões	
	
Através do experimento é possível avaliar-se a atividade da enzima polifenoloxidase em diferentes condições e meios, assim como maneiras de otimizar a sua ação ou inibi-la.
Referências
- Izabella rodrigues chaves dos santos dissertação apresentada ao programa de pósgraduação em alimentos e nutrição, da faculdade de ciências farmacêuticas de araraquara – fcfar/unesp, 2009.