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TÓPICOS EM BIOTECNOLOGIA Material de Consulta Autores: Cristina Ferreira Juliana Aguiar Lara Pessanha Patrícia Rangel Coordenador: Victor Martin Quintana Flores Índice Biotecnologia..................................................................................................... 1 Biotecnologia no Brasil....................................................................................... 4 Regulamentação no Brasil................................................................................. 6 Biotecnologia Molecular.................................................................................. 7 Vetores de clonagem......................................................................................... 7 Proteínas recombinantes................................................................................... 8 Biotecnologia molecular no Brasil...................................................................... 8 Genômica.......................................................................................................... 9 Brasil na era genômica........................................................................................ 10 Tópicos em biotecnologia............................................................................... 10 I BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL.................................................................... 11 1-INTRODUÇÃO AOS PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS DE INTERESSE INDUSTRIAL..................................................................................................... 11 1- MICRORGANISMOS DE INTERESSE INDUSTRIAL.................................. 12 2- TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS................................................ 14 Processos submersos....................................................................................... 14 Processos em estado sólido........................................................................... 14 3- PROCESSOS FERMENTATIVOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS......... 14 Produção de Biomassa Microbiana................................................................ 15 Biomassa fúngica................................................................................................ 16 Processo de produção de proteína unicelular (SCP – Single Cell Protein)......... 16 Produção de biomassa bacteriana..................................................................... 16 Produção de Aminoácidos................................................................................ 17 Produção de ácidos orgânicos........................................................................ 18 1) Produção de Ácido Acético............................................................................. 18 Generalidades sobre a produção de vinagre....................................................... 19 Aplicações do ácido acético................................................................................ 19 2) Produção de Ácido Cítrico............................................................................... 19 Aplicações do ácido cítrico.................................................................................. 19 Bioquímica da produção do ácido cítrico............................................................. 20 Processo de Produção........................................................................................ 20 a) Processo Koji................................................................................................ 20 b) Processo de fermentação em superfície..................................................... 20 c) Processo de fermentação por cultura submersa....................................... 20 3) Produção de Ácido Lático............................................................................... 21 Principais características das bactériasláticas.................................................... 21 A) Bactérias homofermentativas.............................................................. 21 B) Bactérias heterofermentativas............................................................... 21 Processo de obtenção do ácido lático................................................................. 22 Aplicações do ácido lático.................................................................................... 22 Importância das bactérias láticas na indústria de alimentos............................... 22 Aspectos negativos da presença das bactérias ácido-láticas na indústria.......... 23 Microrganismos Probióticos................................................................................. 23 Produção de Etanol........................................................................................... 24 Vias de obtenção do etanol................................................................................. 24 1) Via Destilatória............................................................................................... 24 2) Via Sintética................................................................................................... 24 3) Via Fermentativa............................................................................................ 24 3.1) Preparo do substrato................................................................................. 25 3.2) Fermentação............................................................................................... 25 3.3) Destilação................................................................................................... 25 O agente fermentador......................................................................................... 25 5-PRODUÇÃO DE ENZIMAS.............................................................................. 26 6-BIOCONVERSÕES OU BIOTRANSFORMAÇÕES........................................ 27 Bioconversão de esteróides - síntese de cortisona............................................. 28 Outras Bioconversões efetuadas por microrganismos........................................ 28 Resumo dos principais produtos obtidos por fermentação microbiana..... 29 7-BIORREATORES............................................................................................. 29 Grupo 1............................................................................................................... 29 Grupo 2............................................................................................................... 29 Alguns Tipos de Biorreatores........................................................................... 31 II BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE.......................................................... 33 1-PRODUÇÃO DE INOCULANTES AGRÍCOLAS............................................. 33 2-PRODUÇÃO DE BIOINSETICIDAS - CONTROLE BIOLÓGICO................... 34 Microrganismos Entomopatogênicos................................................................... 35 Bacillus thuringiensis (Bt)................................................................................ 36 Produção de bioinseticidas.................................................................................. 38 Pesquisas e avanços da produção de bioinseticidas.......................................... 42 3-BIODIGESTÃO OU BIODEGRADAÇÃO........................................................ 44 Biodigestão Animal........................................................................................... 44 Biodigestão Natural........................................................................................... 44 Biofertilizantes................................................................................................... 45 Biogás................................................................................................................. 45 Aplicações do biogás...........................................................................................46 Tipos de Biodigestores para a Produção deBiogás............................................ 47 1) Biodigestor anaeróbico tubular................................................................... 47 2) Biodigestor de batelada ou de fluxo não continuo.................................... 48 Biolixiviação....................................................................................................... 49 Biorremediação.................................................................................................. 50 Xenobióticos........................................................................................................ 50 Aplicações da biorremediação............................................................................ 51 Microrganismos biorremediadores...................................................................... 52 Metabolismo microbiano...................................................................................... 54 Metabolismo de compostos aromáticos halogenados......................................... 55 Metabolismo de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH’s)...................... 55 Limitações e peculiaridades do processo............................................................ 56 Fatores que influenciam a biodegradação de compostos orgânicos em ecossistemas naturais...................................................................................... 56 Relações entre compostos químicos e biodegrabilidade.............................. 57 Heterogeneidade do resíduo............................................................................... 57 Efeitos de concentração...................................................................................... 57 Persistência ou toxicidade................................................................................... 58 Condições adequadas para o crescimento microbiano....................................... 58 Modificações químicas........................................................................................ 58 Modificações físicas............................................................................................ 58 Modificações biológicas....................................................................................... 58 Tecnologias de biorremediação.......................................................................... 58 Reatores tipo bioslurry ou reatores de fase lama.......................................... 59 Landfarming....................................................................................................... 59 Fitorremediação................................................................................................. 60 Fitoextração........................................................................................................ 60 Fitodegradação.................................................................................................. 60 Rizofiltração....................................................................................................... 60 Fitoestabilização................................................................................................ 60 Fitovolatilização................................................................................................. 60 Rizorremediação................................................................................................ 60 Avaliação e desenvolvimento de novas capacidades biorremediadoras............ 61 A) Manipulação por transferência de plasmídios............................................... 61 B) Manipulação por transferência de genes...................................................... 62 4-TRATAMENTO BIOLÓGICO DE EFLUENTES.............................................. 62 Tratamento primário.......................................................................................... 63 Tratamento secundário..................................................................................... 63 Tratamento terciário.......................................................................................... 63 Tratamento Biológico Aeróbico....................................................................... 63 1) Lodos Ativados.............................................................................................. 64 2) Filtros Biológicos.......................................................................................... 64 3) Lagoas de Estabilização e Lagoas Aeradas............................................... 65 Tratamento Biológico Anaeróbico................................................................... 66 III BIOTECNOLOGIA E SAÚDE.......................................................................... 67 1-VACINAS E SOROS........................................................................................ 68 SOROS................................................................................................................ 68 Produção de soros............................................................................................ 68 Uso de biotecnologia moderna........................................................................ 70 VACINAS............................................................................................................. 70 Classificação geral das vacinas....................................................................... 71 1− Vacinas inativadas ou inertes.................................................................... 71 2− Vacinas “vivas” atenuadas......................................................................... 71 3− Vacinas produzidas por recombinação genética..................................... 72 4− A vacina de ácido nucléico......................................................................... 73 Composição das vacinas.................................................................................. 73 O antígeno.......................................................................................................... 73 O solvente.......................................................................................................... 74 Conservantes, antibióticos, estabilizadores.................................................. 74 Adjuvantes......................................................................................................... 74 Produção de vacinas......................................................................................... 74 Teste da funcionalidade da vacina...................................................................... 77 Produção de vacinas em ovos......................................................................... 77 Produção de vacina por animais e plantas transgênicas.............................. 78 Produção de vacinas em plantas..................................................................... 79 Vacina contra o câncer...................................................................................... 80 Vacinas de DNA................................................................................................. 80 Avanços na produção de vacinas.................................................................... 82 principais produtores oficiais de vacinas e soros são.................................. 82 2- TERAPIA GÊNICA.......................................................................................... 83 Considerações Gerais Bases para o estudo da terapia gênica................................................................ 83 Gerando informações sobre os genes................................................................. 83 Expressão gênica e tratamento exógeno de doenças....................................... 84 Diagnóstico de doenças genéticas......................................................................84 Princípio básico da terapia gênica................................................................... 84 Aplicações da terapia gênica............................................................................... 85 Terapia de linhagem germinativa..................................................................... 86 Terapia de linhagem somática.......................................................................... 87 Exemplo do uso da terapia gênica somática....................................................... 87 Técnicas de terapia gênica somática................................................................... 88 Importância da escolha e conhecimento do gene alvo.................................. 88 Vetores para transferência gênica................................................................... 89 Métodos físicos.................................................................................................... 90 Métodos químicos................................................................................................ 90 Lipossomas.......................................................................................................... 91 Sistemas não-lipídicos......................................................................................... 91 Sistemas virais................................................................................................... 92 Segurança no uso de vetores virais.................................................................... 93 Retrovírus............................................................................................................ 93 Adenovírus........................................................................................................... 93 Desvantagens do uso de retro e adenovírus....................................................... 94 Outros vírus disponíveis como vetores................................................................ 94 Combinações de Elementos Virais e Não-Virais................................................. 95 DNA Mitocondrial................................................................................................. 96 Formas de administração do vetores para terapia......................................... 96 Os principais alvos da terapia gênica............................................................. 97 Patologias mais especificamente relacionadas................................................... 99 Aplicação da terapia gênica em humanos...................................................... 99 Perspectiva futuras para o uso de terapia gênica.......................................... 100 3- BIOMIMÉTICA, BIOENGENHARIA E BIOMATERIAIS................................. 101 Biomimética........................................................................................................ 101 Exemplos da aplicação da biomimética.............................................................. 101 Biomimética e Medicina regenerativa.............................................................. 102 Bioengenharia e engenharia de tecidos.......................................................... 104 Biomateriais....................................................................................................... 107 4- CLONAGEM.................................................................................................... 112 Clonagem Natural.............................................................................................. 112 Bipartição............................................................................................................. 113 Fragmentação...................................................................................................... 113 Gemulação........................................................................................................... 113 Partenogênese..................................................................................................... 114 Multiplicação vegetativa....................................................................................... 114 Esporulação......................................................................................................... 115 Clonagem Induzida............................................................................................ 116 Clonagem animal................................................................................................. 116 Clonagem vegetal................................................................................................ 117 Multiplicação vegetativa artificial.......................................................................... 117 Estaca................................................................................................................. 117 Mergulhia............................................................................................................ 117 Enxertia............................................................................................................... 118 Alporquia............................................................................................................ 118 Clonagem in vitro de plantas.............................................................................. 118 Clonagem reprodutiva....................................................................................... 121 Processo de clonagem de mamíferos................................................................. 122 Ovelha Dolly......................................................................................................... 122 Vaca Margarida.................................................................................................... 123 Clonagem animal no Brasil.................................................................................. 124 Problemas na clonagem reprodutiva................................................................... 124 Perspectivas da clonagem reprodutiva................................................................ 125 Clonagem terapêutica....................................................................................... 125 Células tronco...................................................................................................... 126 Cordão umbilical e placenta................................................................................. 127 Células embrionárias........................................................................................... 128 Uso de células tronco na terapia......................................................................... 129 Considerações sobre da clonagem terapêutica.................................................. 131 Considerações finais sobre clonagem............................................................ 131 Regulamentação.................................................................................................. 132 Clonagem molecular.......................................................................................... 132 IV ORGANISMOS TRANSGÊNICOS.................................................................. 134 Animais Transgênicos....................................................................................... 134 1- O que é um animal transgênico?............................................................... 134 2- Histórico dos animais transgênicos.......................................................... 134 3- Como são obtidos os animais transgênicos?.......................................... 135 3.1- Técnicas utilizadas para geração de animais transgênicos.................. 136 3.1.2. Agregação de células-tronco geneticamente modificadas................. 136 3.1.3. Vetores Virais........................................................................................... 137Retrovírus........................................................................................................... 137 Adenovírus......................................................................................................... 137 3.1.4. Transferência de DNA mediada por espermatozóides......................... 138 3.1.5. Microinjeção pronuclear: a geração do camundongo Victor............ 138 3.1.6- Transferência nuclear............................................................................. 140 3.1.7- Transformação por eletroporação......................................................... 140 3.1.8- Knockdown de genes e RNA interference............................................ 141 4. Aplicações dos animais transgênicos................................................... 141 4.1- Aplicações na Medicina............................................................................. 141 4.2- Pecuária e Indústria................................................................................... 142 4.3-Utilização dos animais transgênicos como biorreatores...................... 143 4.4- Introdução de novas características importantes economicamente.. 144 Plantas Transgênicas...................................................................................... 146 5- O que é uma planta transgênica?.......................................................... 146 6- Histórico das plantas transgênicas....................................................... 147 7- Como são produzidas as plantas transgênicas?................................. 148 7.1- Transferência por Agrobacterium.......................................................... 149 7.2. Eletroporação de Protoplastos............................................................ 154 7.3.- Método Biobalístico................................................................................. 155 8- Como regenerar as plantas transgênicas?........................................... 157 9- Qual a importância dos organismos transgênicos?............................ 158 10-Perspectivas em OGM´s.......................................................................... 160 Referências Bibliográficas.............................................................................. 161 1 BIOTECNOLOGIA No período da pré-agricultura cada pessoa necessitava de um quilômetro quadrado de terra para tirar seu alimento, após o aparecimento das fazendas, da agricultura, 100 pessoas podiam viver com a produção obtida neste mesmo espaço. Desde o período mais remoto a melhoria tecnológica tem sido importante para o desenvolvimento e instalação da espécie humana no planeta. Na realidade, a biotecnologia se iniciou neste período. Hoje, a biotecnologia, além do melhoramento da biodiversidade, pode fazer modificações genéticas e criação, inclusive mudando geneticamente as formas de vida existentes. A Biotecnologia é uma das áreas de estudo com mais rápido crescimento e procura. A modificação da definição de biotecnologia ao longo do tempo permite identificar as mudanças no pensamento científico e a evolução do processo biotecnológico. Assim, de acordo com vários autores biotecnologia é: 1. “A utilização dos sistemas celulares para a obtenção de produtos ou o desenvolvimento de processos industriais”. CNPq, Programa Nacional de Biotecnologia, Brasil, (1981) 2. “O emprego de organismos vivos na geração de produtos benéficos para a espécie humana. É a aplicação de seres biológicos em processos técnicos e industriais”. U. S. Environmental Protection Agency, (1995) 3. “Compreende um vasto conjunto de técnicas que usam seres vivos, ou parte deles, para produzir ou modificar produtos, aumentar o crescimento de plantas e animais ou, ainda, desenvolver microrganismos para usos específicos”. Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da UFSC, (1995) 4. “Uso de conhecimentos sobre os processos biológicos e sobre as propriedades dos seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos de utilidade”. Conselho de Informações Sobre Biotecnologia, CIB, (2007). http://www.cib.org.br 5. “É o estudo ou a manipulação de um ou mais componentes básicos de organismos vivos: tecidos, células, proteínas, genes ou DNA. Pode incluir a identificação e caracterização de genes, a engenharia genética e o cultivo de células”. Parlamentary Commissioner for the Environment (PCE), New Zealand, (2008) 6. “É a ciência que usa organismos vivos ou seus componentes para produzir bens e serviços. Envolve a manipulação e a modificação de organismos, freqüentemente em nível molecular, para criar novas e práticas aplicações para a agricultura, medicina e indústria”. www.smartstate.qld.gov.au/ strategy/strategy05_15/glossary.shtm, (2008) 7. "É a aplicação da ciência e da engenharia para o uso direto ou indireto de organismos vivos, ou parte deles ou seus produtos, na sua forma natural ou modificada”. www.cambridge.gov.uk/ccm/cms-service/download/asset/, (2008) 2 Antes de apresentar uma definição mais moderna e completa precisamos considerar alguns pontos importantes: • O “sistema biológico” não inclui somente seres vivos e integrais, mas também parte deles ou seus produtos; • O “sistema biológico” pode compreender tanto organismos naturais quanto modificados; • A manipulação dos sistemas biológicos deve ser feita de maneira deliberada e controlada; • O desenvolvimento de processos biotecnológicos inclui o conhecimento de várias disciplinas científicas; • O desenvolvimento de processos biotecnológicos tem como objetivo final a geração de produtos e/ou serviços úteis à espécie humana. Assim, podemos formular um conceito que será considerado durante toda a apostila: “Biotecnologia é o conjunto de técnicas e métodos industriais que viabilizam a obtenção de BENS E SERVIÇOS de interesse para o ser humano, tendo como agentes de transformação, de uma forma integral ou parcial, células animais, vegetais, microrganismos ou vírus”. A biotecnologia tem caráter multidisciplinar usando conhecimento e ferramentas descritos na Biologia molecular, Biologia celular, Bioquímica, Genética, Microbiologia, Imunologia, Química, Engenharia Industrial, Informática. A integração dessas disciplinas pode ser visualizada no diagrama abaixo. Figura 1. Diagrama representativo da multidisciplinaridade da biotecnologia A biotecnologia, seus processos e serviços tem tido um impacto profundo na nossa vida diária, desde os alimentos que comemos aos medicamentos que são utilizados para tratar as mais diversas doenças. De forma alargada, a Biotecnologia 3 está relacionada com a produção comercial de produtos gerados pela ação metabólica de microorganismos. A biotecnologia, entretanto, é tão antiga quanto à prática da agricultura e a produção de pães e vinhos. Quatro mil anos antes de Cristo, a fermentação para a fabricação de pães e cervejas já era realizada no Egito. Queijos e vinhos eram produzidos na China e os Babilônios utilizavam o controle de população de palmeiras na região com polimerização das árvores fêmeas. Mesmo as práticas mais recentes, como a produção de antibióticos e a inseminação artificial, já eram utilizadas de forma rudimentar entre 100 e 1.800. Em 1.322, os árabes foram os primeiros a usarem técnicas de inseminação para produzirem cavalos superiores. A Biotecnologia moderna, também conhecida como Biotecnologia Molecular, emergiu como nova área de investigação graças à fusão das técnicas da engenharia genética com a microbiologia industrial tradicional. A biotecnologia molecular envolve estudos e desenvolvimento da química combinatorial de biomoléculas, os processos de biotransformação e aplicação de biocatalisadores, a tecnologia de ácidos nucléicos,a engenharia de proteínas, a aplicação de moléculas menores em controles de metabolismo e em farmacologia. As suas aplicações são essencialmente dirigidas para a área de obtenção de produtos industriais de alto valor agregado. Na área de saúde, incluem-se nessa vertente a construção e produção de moléculas recombinantes de ácidos nucléicos e de proteínas, usadas em vacinação humana e animal e em terapia molecular na medicina, e de moléculas estruturais usada em engenharia tecidual. O potencial para a manipulação genética de um organismo foi, então, aplicado não apenas aos microorganismos, mas também a plantas e animais, tendo um impacto profundo em áreas como a saúde, a agricultura e o ambiente. A capacidade da Biotecnologia Molecular para proporcionar benefícios sem precedente a toda à humanidade encontra-se amplamente reconhecida, incluindo (mas não se limitando a): • Ferramentas para um diagnóstico mais preciso, prevenção ou cura de uma vasta gama de doenças tanto infecciosas como genéticas; • Um aumento significativo no rendimento das colheitas agrícolas, através da criação de plantas transgênicas resistentes às pragas de insetos, doenças, vírus ou fungos, e a situações de estresse abiótico tais como secas prolongadas, baixas temperaturas ou intensa radiação UV; • O desenvolvimento de microrganismos que produzem antibióticos, aminoácidos, enzimas, produtos químicos e determinados aditivos alimentares; • O melhoramento genético de gado de criação; • A eliminação de xenobióticos ambientais. Especificamente, a Biotecnologia Farmacêutica abre-se como uma nova porta para o desenvolvimento e design de fármacos biológicos, os chamados compostos biofarmacêuticos. 4 O futuro da Biotecnologia promete muitos avanços na produção de biofármacos, no desenvolvimento de sistemas de libertação de fármacos, e em outras especialidades biofarmacêuticas, incluindo polipeptídios, proteínas (recombinantes), e antibióticos. Fornece ainda meio para a compreensão e descodificação dos mecanismos e processos que estão na base do desenvolvimento de determinadas doenças. No âmbito da biotecnologia tradicional, as tecnologias com maiores aplicações na agricultura são a cultura de tecidos, o controle biológico de pragas e a fixação biológica de nitrogênio. A cultura de tecidos (ou cultura in vitro) “compreende a cultura de células, tecidos ou órgãos, em condições de assepsia e meios de cultura artificiais (contendo compostos como água, sais minerais, vitaminas, fonte de carbono e reguladores de crescimento)” (Oliveira, 2000). O controle biológico de praga consiste na utilização de microorganismos (vírus, bactérias e fungos) para combater pragas. Esta é uma técnica que vem ganhando importância nos últimos anos. Os desastres ambientais, a demanda crescente de alimentos e produtos de primeira necessidade em função do crescimento populacional, a expansão dos mercados consumidores nos países desenvolvidos e o aumento de pragas foram os fatores que contribuíram para valorizar o uso de bioinseticidas nas atividades agrícolas. No âmbito da biotecnologia moderna, se destacam a aplicação de duas tecnologias: o uso da engenharia genética para produção de novas variedades vegetais e os estudos genômicos de plantas e fitopatógenos com o objetivo de combater doenças e melhorar a qualidades dos alimentos. Dentre as promessas da biotecnologia, se destacam o aumento da produtividade e redução de custos, inovações e melhoras na qualidade dos alimentos e utilização de práticas agrícolas mais ecológicas. Além das conseqüências nas atividades agrícolas, a manipulação genética das plantas trará impactos em outros setores produtivos, como na floricultura e jardinagem, na indústria química e na indústria farmacêutica, com a possibilidade, a partir de plantas geneticamente modificadas, de produzir fitoterápicos mais eficientes ou ainda, desenvolver vegetais biorreatores com aplicações em diversas atividades industriais. Biotecnologia no Brasil Em 2000, a pesquisa em biotecnologia no Brasil apresentava os seguintes números: 6.616 pesquisadores, distribuídos em 1.718 grupos e 3.814 linhas de pesquisas. As ciências agrárias e médicas contavam, respectivamente, com 1.075 e 503 linhas de pesquisa. Nos últimos anos a comunidade científica brasileira desenvolveu uma respeitável capacidade de manipulação das novas ferramentas da biotecnologia, tais como a tecnologia do DNA recombinante e as pesquisas genômicas e proteômicas. Atualmente a biotecnologia integra a base produtiva de diversos setores da economia brasileira. 5 A maioria dos grupos de pesquisa se insere no desenvolvimento de tecnologias direcionadas ao agronegócio, seguido por aquelas focadas em saúde humana. Completam a seqüência de grupos que pesquisam saúde animal e, por último os de meio ambiente. Ainda, 7% dos grupos investigam tecnologias direcionadas às quatro áreas e 5% não pesquisam tecnologias, mas debatem legislações, história e fatores econômicos que interferem no desenvolvimento da biotecnologia. A biotecnologia é uma ciência cujos conhecimentos são empregados em diversos segmentos e setores da economia, desde os mais tradicionais e amplamente difundidos entre as pessoas, até aqueles mais recentes, surgido a partir de inovações radicais. A indústria biotecnológica se refere ao conjunto de segmentos conforme apresentado no esquema abaixo. Figura 3. Produtos e técnicas usadas pelas áreas principais em biotecnologia. No âmbito da biotecnologia tradicional, as principais aplicações na saúde humana são: a produção de biofármacos, de imunobiológicos, de reagentes biológicos para diagnósticos e de hemoderivados. A figura 3 apresenta os principais produtos de cada grupo e a tecnologia utilizada na produção. 6 As principais aplicações no âmbito da biotecnologia moderna são: o uso da engenharia genética para a produção de biofármacos (p. ex.: insulina e hormônio do crescimento), de vacinas (vacinas recombinantes contra hepatite B); e os estudos genômicos para prevenção e cura de diversas doenças (terapia gênica e farmacogenômica). A grande marca do modelo de política imunológica no Brasil é a forte presença do setor público na produção de vacinas e soros, através das organizações públicas de pesquisas, como o Instituto Butantã, Fiocruz, Tecpar e outras. De forma geral, todos os segmentos nos quais estão inseridas atividades de biotecnologia apresentam oportunidades de investimento. É através das atividades de P&D (Pesquisa e desenvolvimento) em biotecnologia que diversas soluções para doenças, reprodução, alimentação e meio ambiente estão sendo e ainda serão encontradas. Existem diversas empresas no Brasil atuando em cada uma das grandes áreas da biotecnologia, como apresentado abaixo. Quadro 1. Distribuição das empresas por área da biotecnologia Regulamentação no Brasil Em relação à regulamentação, algumas medidas foram tomadas pelo governo brasileiro nos últimos anos para o desenvolvimento da biotecnologia. Dentre estas medidas destaca-se a criação de um quadro regulatório das atividades relacionadas com a biotecnologia moderna. A criação deste ambiente institucional propício a investimentos no setor contou com as seguintes medidas: • Lei de Patentes: Editada em 14 de maio de 1996. 7 • Lei de Proteção aos Cultivares: Promulgada em 25 de abril de 1997. • Lei n. 8.974: Lei promulgada em janeiro e regulamentada por dois decretos, um em 1995 e outro em 1998, que dispõem sobre a vinculação, competência e composição da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança. • Lei de Acesso aos recursos Naturais: os projetos da Lei Nacional de Acessos aos Recursos Genéticos e seus Produtos Derivados ainda se encontram emdiscussão na Comissão de Assuntos Sociais do Senado e sem aprovação. BIOTECNOLOGIA MOLECULAR Nos últimos 30 anos o mundo vem testemunhando uma revolução biológica de dimensões nunca antes vista. Processos em que a natureza poderia levar centenas de milhares de anos são agora realizados de um dia para outro com o auxilio da engenharia genética e da biologia molecular. Essas transformações induzem reestruturações importantes nas áreas da agricultura, medicina e farmácia, produção animal, meio ambiente, entre outras. Dentro deste contexto, a Biotecnologia se destaca como uma das atividades científicas, econômicas e tecnológicas mais promissoras do próximo século. A biotecnologia de moléculas é um termo para o processo de manipulação dos genes num organismo. Envolvem frequentemente o isolamento, a manipulação e a introdução do DNA num outro organismo, geralmente para verificar a expressão de um gene. O objetivo é de introduzir novas características num ser vivo para aumentar a sua utilidade, tal como aumentando a área de uma espécie de cultivo, introduzindo uma nova característica, ou produzindo uma nova proteína ou enzima, o que explica o principio básico da transgenia. Os processos de indução da modificação genética permitiram que a estrutura de seqüências de bases completas de DNA fossem decifradas, portanto facilitando os estudos de genômica e a clonagem de genes. Umas das mais conhecidas aplicações da biotecnologia molecular são os organismos geneticamente modificados (OGM). Existem muitas possíveis aplicações biotecnológicas da modificação genética, por exemplo, vacinas orais produzidas nas frutas. Vacinas produzidas em bactérias. Uma das maiores ambições de alguns grupos de pesquisadores é a possibilidade da melhoria das capacidades humanas físicas e mentais pelo uso da engenharia molecular Vetor de clonagem A introdução de fragmentos de DNA contendo genes de interesse numa célula, só culminará na reprodução da mensagem genética de tal gene, se este estiver contido num vetor de clonagem apropriado. Tais vetores contém sequências de regulação importantes para que a maquinaria celular possa ler a informação contida no gene. Os vetores que são responsáveis por este processo, podem ser plasmídios, vírus e outros, também manipulados geneticamente. 8 O estudo da informação genética trabalha com construções moleculares necessárias para a expressão de proteínas em bioprocessos industriais usando os organismos vivos, ou a produção de vetores visando à transferência de genes requerida em terapia gênica. Os conceitos científicos básicos da construção de vetores estão atualmente bem elaborados. O desenvolvimento nessa área deve envolver essencialmente o aperfeiçoamento de vetores visando a sua maior estabilidade e produtividade. Proteínas recombinantes A produção de proteínas recombinantes em grande escala já abrange os substitutos de hormônios ou mediadores intercelulares humanos e proteínas virais potencialmente usadas na vacinação ou imunomodulação em humanos e animais. A produção de proteínas recombinantes envolve uma série de passos, iniciando-se com a identificação e caracterização genética da proteína e das suas propriedades bioquímicas, e a definição dos requisitos estruturais para a sua atividade funcional, como o processamento pós-traducional, glicosilação, formação de heterodímeros etc. A produção propriamente dita envolve a escolha do vetor de expressão, a escolha de células em função da complexidade de processamento molecular necessário para a obtenção da proteína funcional, o aperfeiçoamento do bioprocesso de produção, e a separação, purificação e preparo para o uso médico da proteína. O uso médico de mediadores hormonais, fatores de crescimento e citocinas estão em franca expansão, em função de avanços consideráveis alcançados na compreensão de vias de sinalização intercelular e intracelular. As enzimas envolvidas são freqüentemente identificadas e caracterizadas, abrindo a possibilidade da estimulação ou inibição de suas atividades. Uma nova geração de moléculas moduladoras das atividades enzimáticas está encontrando aplicação farmacológica ampla. A atenção particular deverá ser dada à expressão de proteínas em sistemas alternativos, além de sistemas tradicionais que usam microrganismos ou células animais. Os sistemas mais complexos devem permitir a expressão simultânea de mais de um gene com obtenção de proteínas heterodiméricas. A expressão de proteínas humanas em vegetais e animais superiores é muito promissora, devendo levar à produção de complexos moleculares fisiologicamente ativos, com um rendimento produtivo muito mais importante, a baixo custo. Biotecnologia Molecular no Brasil No Brasil, a primeira parte dos processos citados pode ser feita, em grande parte, nas instituições acadêmicas de pesquisa biomédica. O Brasil possui centros de excelência em bioquímica, ciências biomédicas e farmacológicas, assim como na área de imunologia dirigida para a vacinação. A competência de pesquisas nessa área já está instalada, e recursos humanos de mais alto nível estão disponíveis. 9 Todas as análises de capacidade e produtividade científica nacional apontam essas áreas como de excelência, tanto em termos de geração de novos dados científicos, como em termos de capacidade de formação de recursos humanos. A atenção particular deverá ser dada às doenças transmissíveis de animais. Algumas delas são bem conhecidas na agropecuária global (peste suína, febre aftosa), e os processos tradicionais de tratamento e prevenção são disponíveis e aplicados no Brasil. A segunda parte do desenvolvimento da biotecnologia molecular envolve, além de pesquisas acadêmicas, a validação e a implantação de processos industriais. Embora existam no Brasil centros de excelência em engenharia de processos, a interação com a área de biotecnologia não está enraizada, e mecanismos de estimulação dessa interação deverão ser implementados. No Brasil os centros de competência em biotecnologia fazem parte de sistema público acadêmico e de instituições governamentais de pesquisa, que possuem uma estrutura e quadros científicos de excelente nível. A transferência de competência adquirida no setor público para a área industrial já está sendo realizado naturalmente, mostrando a viabilidade desse modelo de desenvolvimento. Entretanto a irregularidade de investimentos, a pesquisa e o desenvolvimento de bioprocessos no país está ainda insuficiente, e os centros que já possuem núcleos instalados devem receber o apoio adequado para um desenvolvimento rápido. GENÔMICA Os avanços impressionantes da genômica na última década terão efeitos consideráveis na área médica. O seqüenciamento do genoma humano nos traz a informação do tamanho do problema a ser estudado. O numero menor do que esperado de genes identificados nos ensina que a sua interatividade e os fenômenos pós-transcricionais são mais amplos e mais relevantes do que inicialmente avaliados. Enquanto a beleza da simplicidade do código genético nos permite o uso de sistemas automatizados de seqüenciamento e uma análise computacional da sua estrutura, a compreensão da sua função e, conseqüentemente, dos desvios patológicos, envolve sistemas conceituais teóricos e operacionais muito mais complexos. Por um lado, estudos combinatórios de seqüências associadas estatisticamente com certas patologias nos fornecem ferramentas potencialmente úteis em aplicações médicas imediatas da genômica. A capacidade de identificação de fatores genéticos de risco individual ou populacional para o desenvolvimento de certas patologias traz claramente benefícios na previsibilidade de riscos decorrentes de certos padrões de interação com o meio ambiente e a possibilidade de prevenção dasconseqüências não desejadas. O seqüenciamento de genoma humano, e o projeto de análise de genoma do câncer, representam muito mais um início de uma nova era de pesquisa biomédica do que um resultado final. As aplicações médicas desse conhecimento dependem da capacidade de análise de sistemas complexos, já que a maioria de patologias 10 dominantes (doenças cardiovasculares, doenças degenerativas, câncer, doenças infecciosas) é dependente de fatores multigênicos. Os dados gerados na genômica abrirão oportunidades para estudos biotecnológicos a fim de melhorar a vida humana. Brasil na era da genômica Graças ao esforço da FAPESP associada, na área de saúde, com o Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer de São Paulo, o Brasil é atualmente um dois países mais desenvolvidos na área de genômica, e a infra-estrutura instalada garante a manutenção dessa posição nos próximos anos. Esse esforço pode servir de exemplo para outras áreas. Em paralelo com a capacidade já instalada de estudos genômicos moleculares, o Brasil dispõe de uma capacidade invejável de pesquisa instalada na área de estudos celulares e de sistemas complexos, capazes de entrar em pesquisas da época pós-genômica. Esses centros são essencialmente localizados em grandes Universidades Federais (destacam-se as UFRJ, UFRGS, UNIFESP, UFMG) e, na área de infectologia, nos centros de pesquisa da FIOCRUZ. O Governo Federal deve prever e planejar um esforço particular nessa área, para valorizar esse capital de excelência de recursos humanos já existentes. Tópicos em biotecnologia Considerando o estudo das ferramentas desenvolvidas nas diversas áreas que sustentam a biotecnologia, assim como as informações sobre os bens e serviços gerados serão apresentados quatro principais tópicos (grandes áreas) da biotecnologia.Os tópicos em biotecnologia abordados são: I – Biotecnologia Industrial; Tipos de processos fermentativos Principais produtos industriais de interesse. Técnicas em biotecnologia industrial Tipos de biorreatores II – Biotecnologia e Meio ambiente Produção de inoculantes agrícolas e bioinseticidas Processos de biodigestão e biodegradação – biofertilizantes, biogás, biolixiviação, biorremediação, rizorremediação e fitorremediação Tratamento de efluentes III – Biotecnologia e saúde Produção de soros e vacinas Terapia gênica Princípio da biomimética, bioengenharia de tecidos e biomateriais Processos e aplicações da clonagem IV – Organismos transgênicos Transgenia animal e vegetal Técnicas em transgenia Aplicação e uso de organismos transgênicos 11 I BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL 1-INTRODUÇÃO AOS PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS DE INTERESSE INDUSTRIAL Os microrganismos são amplamente utilizados em processos biotecnológicos visando à produção de uma grande variedade de compostos com aplicação industrial. Esta variedade de aplicações torna a biotecnologia um ramo da ciência extremamente amplo e multidisciplinar. Na biotecnologia industrial, o termo Fermentação apresenta significados específicos e peculiares, os quais devem ser primeiramente compreendidos, antes de falarmos sobre os processos fermentativos propriamente ditos. Do ponto de vista da bioquímica, fermentação consiste em um processo de degradação de um substrato, efetuado pela célula microbiana, a fim de produzir energia (ATP), sob condições anaeróbicas. Em contrapartida, do ponto de vista biotecnológico, o termo fermentação se refere a qualquer transformação intermediada por um microrganismo através de uma seqüência de reações bioquímicas, visando à obtenção de um produto de interesse. Neste caso, as reações podem acontecer na presença ou na ausência de oxigênio (condições aeróbicas ou anaeróbicas). O reator onde ocorre o processo é chamado de fermentador ou biorreator, conforme estudaremos mais adiante. Deste modo, são considerados Processos Fermentativos, transformações envolvendo: processos anaeróbicos, respiração microbiana, biossíntese, fotossíntese e respiração com substratos inorgânicos. A tabela abaixo ilustra alguns destes processos fermentativos, bem como os produtos produzidos por estes, de acordo com o metabolismo realizado pelo microrganismo. TIPO DE METABOLISMO DESCRIÇÃO EXEMPLOS Fermentação Produção de energia por reações de oxirredução envolvendo substâncias orgânicas. Realizada por microrganismos anaeróbios ou anaeróbios facultativos sob limitação de O2 Acetona, butanol, etanol, ácido láctico, 2,3-butanodiol Respiração Maximização da produção de energia, via ciclo de Krebs, favorecendo crescimento o celular. Realizada por microrganismos aeróbicos e anaeróbicos facultativos. Biomassa protéica de fungos, fermento de panificação Biossíntese Produtos finais do anabolismo Vitaminas, antibióticos, enzimas e outras proteínas, polissacarídeos e aminoácidos Fotossíntese Conversão de energia luminosa em energia química Biomassa protéica de algas unicelulares Respiração com redutores inorgânicos Produção de energia química com doadores inorgânicos de elétrons Biogás, lixiviação microbiológica de minérios 12 Como pudemos observar na tabela, os microrganismos são utilizados em diversos processos biotecnológicos, com aplicações em diversas áreas, desde a indústria farmacêutica (produção de antibióticos e vacinas), indústria de bebidas e alimentos (produção de etanol, aminoácidos, biomassa microbiana, vitaminas, enzimas), até no meio ambiente, na agricultura e na produção de energia (produção de biogás, biofertilizantes e bioinseticidas, lixiviação microbiológica). A seguir apresentamos uma lista com algumas das diversas aplicações biotecnológicas de microrganismos de importância industrial: 1. Produção biomassa microbiana 2. Produção de aminoácidos 3. Produção de ácidos orgânicos 4. Produção de alimentos por fermentação lática: picles, azeitona, queijos, iogurtes. 5. Produção de etanol 6. Produção de enzimas 7. Produção de vacinas 8. Produção de antibióticos 9. Produção de solventes 10. Produção de polissacarídeos 11. Produção de lipídeos 12. Produção de bioinseticidas 13. Produção de inoculantes agrícolas 1- MICRORGANISMOS DE INTERESSE INDUSTRIAL Entre os microrganismos com aplicação industrial em processos fermentativos, incluem-se, principalmente as bactérias, os bolores ou fungos filamentosos e as leveduras ou fungos unicelulares. Para a execução com sucesso de um processo fermentativo, é necessário que as características do agente fermentativo, sejam respeitadas. Dependendo de cada grupo, gênero, espécie e linhagem microbiana, tanto em termos de crescimento quanto de formação de produtos, haverá a necessidade de formulação de um meio de cultura que contenha os nutrientes necessários e em concentrações adequadas. Além da composição do meio de cultura, condições ambientais como temperatura, pH e suprimento de oxigênio também são fundamentais para o adequado desempenho do microrganismo no processo fermentativo. Visando à sua aplicação na obtenção de produtos de interesse industrial, os microrganismos devem apresentar, ainda, algumas características importantes, como as listadas a seguir: • A cultura deve ser pura; • O microrganismo deve ser estável geneticamente e de fácil manipulação; • O microrganismo deve apresentar elevada eficiência na conversão do substrato no produto de interesse; • Deve apresentar estabilidade fisiológica. Não basta apenas ter uma linhagem hiperprodutora de uma dada substância. É preciso que ela mantenha esta 13 capacidade em todas as etapas do processo, desde a escala laboratorial até as escalas intermediária e industrial; • O composto de interesse deve ser produzido no menor tempo possível,além de ser facilmente recuperável e, preferencialmente produzido com ausência de qualquer substância ou produto tóxico; • O microrganismo não deve produzir substâncias incompatíveis com o produto. Um microrganismo ideal deve produzir um mínimo de outras substâncias, uma vez que isto leva a uma maior disponibilidade de nutrientes para a síntese do composto de interesse, além de facilitar o processo de recuperação do produto; • O crescimento do microrganismo não deve depender da utilização de meios de cultura dispendiosos. O ideal é que ele seja capaz de crescer rapidamente em meios de cultivo alternativos e baratos (melaço, caldo de cana-de-açúcar, soro de leite...); • O microrganismo não deve ser patogênico; • O microrganismo deve permitir manipulação genética; • O microrganismo deve apresentar características metabólicas que possibilitem sua autoproteção contra contaminação (por ex. crescimento em pH baixo ou em temperaturas elevadas, ou produção de um inibidor microbiano aceitável); Como pudemos observar, muitas são as características que um microrganismo deve apresentar. E vocês devem estar neste momento se perguntando: “Mas será possível que um único microrganismo tenha todas estas características?”. O que observamos de fato é que nem sempre é possível agregar todas estas características em um único microrganismo. O importante é se adequar as características que um microrganismo em questão apresenta ao tipo de processo fermentativo utilizado e ao tipo de produto a ser produzido. Se o valor agregado do produto final for alto, por exemplo, justifica-se o uso de condições de processo mais complexas e até mesmo que envolvam um custo mais elevado. Um exemplo disto é a produção de enzimas de restrição, as quais apresentam uma ampla aplicação na área de biologia molecular. Estes produtos são fabricados e comercializados em pequenas quantidades, possuem elevado valor agregado e devem ser produzidos sob condições que garantam a sua adequada recuperação e purificação, além de não comprometer a sua atividade. Neste caso, meios de cultura dispendiosos podem e devem ser utilizados. 14 2- TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS Os processos fermentativos podem ser classificados como: Processos submersos - caracterizados pela presença de água livre no meio. São fermentações em fase líquida. No ocidente, a maior parte dos processos fermentativos industriais é conduzida em sistemas submersos. Produção de enzimas, etanol, acetona, antibióticos e bioinseticidas são alguns desses exemplos. Processos em estado sólido - também denominados de processos em estado semi-sólido, são caracterizados pela ausência de água livre no meio, com um menor teor de umidade no meio em comparação aos processos submersos. Vários produtos são obtidos por fermentações em estado sólido, destacando dentre esses, as enzimas fúngicas, além do molho de soja (molho shoyu) e alguns tipos de queijos. Em geral, utiliza-se o sistema sólido para a realização de processos envolvendo fungos filamentosos, devido ao seu crescimento em condições aeróbicas e à sua forma de crescimento em micélios que é favorecida nessas condições. Os dois tipos de processos possuem vantagens e algumas limitações: Devido à ausência de água livre, os sistemas em estado sólido operam com menores volumes, facilitando a concentração do produto final e o tratamento de efluentes. O baixo grau de umidade nos sistemas sólidos torna o ambiente inapropriado para muitos microrganismos potencialmente contaminantes. Nos sistemas submersos, a remoção do calor decorrente do processo é facilitada, além de permitir um melhor controle das variáveis de processo, como pH, temperatura e suprimento de oxigênio. Outro aspecto é o fato de o conhecimento da engenharia de processo dos sistemas submersos ser incomparavelmente maior do que o dos sistemas em estado sólido. É importante ainda ressaltar que os processos fermentativos, sobretudo os da indústria de alimentos, apresentam peculiaridades que são consideradas verdadeiros segredos industriais, sendo, portanto, o grande trunfo e tesouro dos fabricantes, os quais optam por manter em sigilo alguns detalhes do processo operacional. 3- PROCESSOS FERMENTATIVOS NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS Uma variedade de produtos produzidos por microrganismos possuem aplicação na indústria de alimentos. Aminoácidos, proteínas oriundas da biomassa microbiana, vitaminas, polissacarídeos, ácidos e açúcares são alguns exemplos de produtos utilizados largamente na indústria alimentícia. Lista de produtos microbianos importantes na indústria de alimentos, produzidas por alguns microorganismos que utilizam como fonte de carbono o ácido pirúvico. 15 Produtos Função Organismo D-arabitol Açúcar Candida diddensis Beta-caroteno Pigmento Blakeslae trispora Ácido cítrico Acidulante Aspergillus niger Diacetil Saborizante (manteiga) Leuconostoc cremosis Ésteres de ácido graxo Fragrâncias de frutas Pseudomonas spp Declactona Fragrâncias de pêssego Sporobolomyces odorus Genariol Fragrâncias de rosa Kluyveromyces lactis Ácido glutâmico Intensificador de sabores Corinebacterium glutamicum Ácido lático Acidulante Estreptococos e Bacilos Lisina Aminoácido Corinebacterium glutamicum Manitol Açúcar Torolopsis mannitofaciens Nisina Antimicrobiano Streptococcus lactis 6-pentil-2-pirona Fragrâncias de coco Trichoderma viride l-fenilalanina Precursor do aspartame Bacillus polymyxa Prolina Aminoácido Serratia marcerscens Polissacarídeos termoestáveis Espessante Argobacterium radiobacter Vitamina B-12 Vitamina Propionibacterium Goma xantana Espessante Xanthomonas campestri Produção de Biomassa Microbiana A Biotecnologia é diretamente orientada para a aplicação industrial de microrganismos (ou parte deles), para o desenvolvimento de produtos ou a conversão de materiais. O produto mais direto é o próprio microrganismo, obtido através de multiplicação celular. A biomassa microbiana é usada principalmente como fonte de proteínas para a alimentação humana e para produção de ração animal. As leveduras de panificação são o exemplo mais antigo da utilização de proteínas de microrganismos unicelulares (SCP- Single Cell Protein) na indústria de alimentos. Neste sentido, fungos filamentosos, leveduras, bactérias e algas são fontes de proteínas de fácil acesso e produzidas a custos relativamente baratos. Em alguns países, como o Japão e em países da costa pacífica da América do Sul, algas são intensamente utilizadas como fonte de proteína. Esta é comercializada de forma desidratada e salgada e utilizada devidamente temperada como acompanhamento em inúmeros pratos tradicionais da nossa região ou até como prato principal. As leveduras são também muito utilizadas como fontes de proteína na indústria microbiológica. Para isto, elevadas quantidades de extratos de leveduras em pó são produzidas, sendo usadas como aditivos em meios de cultura (líquido, semi-sólido ou sólido). Estes extratos são usados tanto em laboratórios como 16 reagentes de qualquer meio de cultura ou na indústria que utilizam leveduras como agentes produtores. Certamente que a utilização de qualquer microorganismo como fonte de proteína irá depender de vários fatores como, por exemplo, tipo de substrato a ser utilizada, disponibilidade de matéria prima, velocidade e multiplicação do organismo, toxicidade, digestibilidade e valor nutritivo do produto final. Biomassa fúngica 1) Fungos filamentosos formadores de cogumelos comestíveis • Ex: Agaricus campestris, Lentinus edodes - cultivados utilizando-se diferentes substratos lignocelulósicos (bagaço de cana, palha de arroz, serragem, polpa de café, folha de mandioca, etc.) • Atualmente, desenvolvem-se estudos sobreproteína microbiana para consumo animal e do homem, a partir de resíduos agrícolas utilizados para crescimento fúngico. 2) Micoproteína ou proteína fúngica • Produzida a partir do gênero Fusarium, e está sendo estudada como substituto de carne. É considerada uma proteína de elevada qualidade. 3) Levedura alimentícia • A levedura é fonte de proteínas e vitaminas do complexo B e minerais. No estado seco, contém cerca de 50% de proteína de boa qualidade. Processo de produção de proteína unicelular (SCP – Single Cell Protein) • Utilizam-se matérias primas que sejam abundantes na região de produção e de baixo custo, ricas em carboidratos oriundos de resíduos industriais, de destilarias, de processamento de alimentos, soros de leite e resíduos lignocelulósicos oriundos de bagaço de cana, papéis velhos, etc. • Consiste primeiramente, na transformação de hidratos de carbono da matéria- prima em matéria celular, com suplementação de sais de amônio e fósforo os quais são importantes para o crescimento do microrganismo. • Na obtenção de proteína unicelular de leveduras, a conversão da matéria- prima em proteína é conduzida em fermentadores que são dotados de dispositivos para agitação e aeração, objetivando fornecer oxigênio que é essencial ao desenvolvimento dos microrganismos. • Finalizada a fase de conversão, segue-se o processo de recuperação, que consiste em separar a massa celular dos outros componentes indesejáveis do meio de cultura, o que se consegue por processos de centrifugação, lavagem, filtração e secagem. Produção de biomassa bacteriana Usada na produção das chamadas culturas “starter” ou iniciadoras (biomassa microbiana utilizada para iniciar um processo fermentativo), as 17 quais servem como ponto de partida para a produção de outros produtos de importância industrial. As indústrias de laticínios e as de embutidos são as principais usuárias dessas culturas iniciadoras, para a produção de queijos, iogurtes e bebidas fermentadas, como o Yakult. Produção de Aminoácidos A grande aplicação dos aminoácidos está na alimentação humana e no enriquecimento de ração animal, pois um grande número de aminoácidos essenciais não é sintetizado por animais e pelo homem e, portanto, devem ser introduzidos na dieta. Aproximadamente 66% dos aminoácidos produzidos são utilizados na indústria de alimentos, 31% como aditivos de rações, 4% em medicina e cosmética, e como matéria-prima na indústria química. Na indústria de alimentos, são utilizados para realçar o sabor ou conferir um sabor característico ao alimento, caracterizando o chamado efeito flavorizante. O ácido glutâmico na forma de glutamato sódico, e o ácido aspártico na forma de aspartato sódico e L-alanina são muito utilizados como flavorizantes de diversos tipos de alimentos, incluindo suco de frutas. • A L- histidina é comumente utilizada na indústria de laticínios, uma vez que atua como antioxidante e evita a rancificação do leite em pó (degradação de gorduras e lipídeos por hidrólise ou oxidação), que ocasiona um odor e aspecto desagradável ao alimento e altera as suas propriedades. • A L- lisina é utilizada na nutrição humana e animal e é também usada no enriquecimento nutricional de alimentos de origem vegetal. • O aspartame (L-alfa-aspartil-L-fenilalanina metil éter) é um produto importante na indústria de bebidas não alcoólicas e serve como edulcorante artificial (substância que confere ao alimento um gosto doce) em refrigerantes gasosos. Como matéria-prima para a produção industrial do aspartame utilizam-se L-fenilalanina e ácido L-aspártico, que são ambos, produtos da indústria microbiológica. • Muitos aminoácidos são utilizados na medicina como componentes de soluções no tratamento pós-operatório e têm sido também empregados como desintoxicantes nas disfunções hepáticas e gastrointestinais, em moléstias nervosas e mentais e ainda como tônico orgânico. • Na indústria química, são empregados na produção de polímeros, fibras, resinas, na fabricação de cosméticos e como substâncias surfactantes (compostos caracterizados pela capacidade de alterar as propriedades superficiais e interfaciais de um líquido). • Muitos microrganismos podem sintetizar aminoácidos a partir de compostos nitrogenados inorgânicos. A taxa e a quantidade de síntese de alguns aminoácidos podem exceder as necessidades celulares para a síntese protéica, resultando na excreção dos mesmos para o meio ambiente. • Alguns microrganismos são capazes de produzir quantidades de aminoácidos (lisina, ácido glutâmico, triptofano) suficientes para justificar seu emprego comercial. Muitas espécies de microrganismos, especialmente 18 bactérias e fungos, são capazes de produzir grandes quantidades de ácido glutâmico. Espécies dos gêneros Micrococcus, Arthrobacter e Brevibacterium são usadas na produção industrial do ácido glutâmico (produzem no mínimo 30g de aminoácido/L de meio). Produção de ácidos orgânicos As bactérias utilizadas industrialmente são as anaeróbias e microaerófilas, para a produção de ácido acético, lático, glucônico, propiônico e outros, ou para a produção de alimentos como queijos, picles, chucrutes, vinagres, leites fermentados e outros. As bactérias envolvidas nos processos para obtenção de ácidos são principalmente as do gênero Acetobacter e Lactobacillus. Os fungos também são usados na produção de ácidos por via fermentativa. Os principais ácidos produzidos são: cítrico, glucônico, fumárico, lático, gálico, ácidos graxos e outros. 1) Produção de Ácido Acético A Fermentação acética é uma reação química que consiste na oxidação parcial, aeróbica, do álcool etílico, com produção de ácido acético. Esse processo é utilizado na produção de vinagre comum e do ácido acético industrial. Desenvolve- se também na deterioração de bebidas de baixo teor alcoólico e na de certos alimentos. É realizada por bactérias acéticas, produzindo ácido acético e dióxido de carbono. Na indústria de alimentos, o grupo das bactérias acéticas é de grande importância na fabricação de vinagres. Grupo das bactérias acéticas: •••• Família Pseudomonodaceae: bastonetes Gram-negativos, aeróbicas, móveis, apresentam ou não flagelo polar. •••• Formam ácido por oxidação incompleta de açúcares ou álcoois: (1) acetaldeído é formado por oxidação; (2) acetaldeído é convertido a ácido acético. 75% do acetaldeído é convertido em ácido acético, e os outros 25% em etanol. •••• São razoavelmente tolerantes a condições ácidas. Suportam pH < 4.0 (pH ótimo em torno de 5.0 a 6.0). •••• Ocorrem na superfície de plantas, flores e frutas. Flora secundária em matéria vegetal em decomposição. São bastante exigentes nutricionalmente. •••• Principais diferenças que as distinguem do gênero Pseudomonas: o Toleram ph mais ácido o Apresentam menor atividade proteolítica o Motilidade limitada e não são pigmentadas (com exceção de Gluconobacter oxydans que produz um pigmento marrom). •••• São contaminantes indesejáveis na fabricação de vinhos. •••• Juntamente com as leveduras e as bactérias láticas, as bactérias acéticas têm sido freqüentemente citadas como deteriorantes na indústria de bebidas. 19 •••• O tipo de deterioração que eles produzem inclui sabores desagradáveis, crescimento limoso e formação de gás. Generalidades sobre a produção de vinagre •••• A produção do vinagre envolve dois tipos de alterações bioquímicas: (1) uma fermentação alcoólica de um carboidrato; (2) uma oxidação do álcool até ácido acético. •••• Existem diversos tipos de vinagres produzidos, dependendo do tipo de material usado na fermentação alcoólica (sucos de frutas, xaropes contendo amiláceos hidrolisados). •••• Emprega-se inicialmente uma fermentação por leveduras para a produção do álcool. A concentraçãoalcoólica é ajustada entre 10 a 13% sendo então exposta às bactérias do ácido acético (um processo aeróbio), que vai oxidar a solução alcoólica até que se produza o vinagre na concentração desejada. Aplicações do ácido acético • Como condimentos em saladas (vinagre); • Como solvente; • Na produção de perfumes e corantes; • Na neutralização e interrupção da revelação de filmes e papéis fotográficos; • Na obtenção de sais metálicos para a fabricação de tintas e inseticidas; • Na produção aspirina; • É usado em alguns exames diagnósticos para detecção de doenças; 2) Produção de Ácido Cítrico O acúmulo do ácido cítrico por alguns fungos foi descoberto por volta de 1893 quando Wehmer, descobriu que o Citromyces (hoje identificado como Penicillium sp) e Mucor possuíam a capacidade de acumular este ácido durante o seu cultivo. Atualmente, a fermentação industrial para a produção do citrato é conduzida utilizando uma única espécie de fungo, Aspergillus niger. Aplicações do ácido cítrico • Cerca de 70% da produção é utilizada pela indústria de alimentos e bebidas; 12% pela indústria farmacêutica e 18% por outras indústrias. • Na indústria de alimentos, usa-se em larga escala como acidulante por apresentar sabor agradável, baixíssima toxicidade e alta solubilidade. Além disso, esse ácido tem capacidade de se complexar com metais pesados como o ferro e o cobre. Essa propriedade tem conduzido à sua utilização como estabilizante de óleos e gorduras para reduzir a sua oxidação catalisada por esses metais. Essa propriedade aliada ao baixo grau de corrosão a certos metais tem permitido seu uso na limpeza de caldeiras e instalações especiais. 20 • Na indústria farmacêutica, o ácido cítrico é usado como estabilizante de ácido ascórbico por causa de sua ação quelante. Nos antiácidos e analgésicos efervescentes, o ácido cítrico é usado juntamente com carbonatos e bicarbonatos para gerar CO2. • Sais de citrato, como citrato trissódico e citrato tripotássico são usados na medicina para evitar a coagulação do sangue e na indústria alimentícia como emulsificante para fabricação de certos produtos como o queijo. • Ésteres de ácido cítrico, como trietil, tributil e acetildibutil, são usados como plastificantes não tóxicos nas películas plásticas de embalagens de alimentos. Bioquímica da produção do ácido cítrico Essencialmente a glicose é transformada em piruvato pela via glicolítica. O piruvato é transformado em acetil CoA, que entrará no ciclo de Krebs para a formação do citrato. Processo de Produção Três processos são usados para a fabricação de ácido cítrico: a) Processo Koji - no qual o substrato utilizado é sólido (farelo de trigo e amido de batata doce) e é empregada uma linhagem específica de A. niger. Durante este processo, o substrato sólido deve atingir uma temperatura específica antes de ser inoculado com o koji (preparado contendo amilases e proteases obtidas da cepa de A. niger. O substrato inoculado com o fungo é distribuído em bandejas especiais e depois de cinco a oito dias, o koji é recolhido e o ácido cítrico produzido é extraído com água. b) Processo de fermentação em superfície - o micélio do fungo A. niger cresce sobre a superfície de um meio de cultura viscoso (comumente chamado na indústria de mosto), o qual é distribuído em bandejas e mantido em condições estáticas (sem agitação). Este processo, considerado artesanal, é ainda utilizado por muitos fabricantes e possui muitos segredos industriais. c) Processo de fermentação por cultura submersa - o fungo se desenvolve inteiramente submerso no meio de cultura líquida (mosto), mantido sob intensa agitação, o que serve para assegurar a homogeneidade tanto da distribuição dos microrganismos quanto dos nutrientes. Estas características conferem vantagens ao processo submerso em relação ao processo de superfície. A presença de um carboidrato prontamente metabolizável é essencial para uma boa produção de ácido cítrico. Maltose, sacarose, manose, glicose e frutose são os açúcares mais apropriados para a produção de ácido. Na prática, o ácido cítrico é produzido a partir de carboidrato purificado (sacarose) ou da fonte de carboidrato bruto, de preço mais conveniente, como melaço de cana de açúcar, melaço de beterraba, sacarose bruta, caldo de cana, e hidrolisado de amido. 21 A presença de metais como contaminantes dessas matérias-primas constitui o principal problema na fermentação cítrica. Além disso, em alguns produtos encontram-se substâncias inibidoras e/ou promotoras de crescimento, a maioria pouco conhecidas ou analisadas. Algumas técnicas são usadas para remover ou neutralizar a inibição por esses contaminantes como, por exemplo, a adição de ferrocianato de potássio e metanol. 3) Produção de Ácido Lático Foi o primeiro ácido orgânico a ser fabricado industrialmente por fermentação. Os principais gêneros de bactérias láticas são os Lactobacillus e Streptococcus. A escolha de uma espécie depende do carboidrato metabolizado pelo microorganismo e da temperatura a ser empregada no processo: • Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus: temperatura na faixa de 45 - 50°C • L. casei e Streptococcus lactis: temperatura ao redor de 30°C • L. pentosis, L. leishmanii: temperatura acima de 30°C. Principais características das bactérias láticas São bactérias Gram positivas, microaerofílicas e não formadoras de esporos. Usualmente não apresentam motilidade, são catalase-negativas, apresentam colônias pequenas e apigmentadas. São bactérias que apresentam exigências nutricionais e mecanismo biossintético pobre, necessitando para o seu crescimento de meios ricos em carboidratos, peptonas e hidrolisados protéicos, extrato de levedura, vitaminas e nucleotídeos. Estas características regulam a distribuição destas bactérias na natureza, sendo encontradas em abundância em substratos ricos, como leite, carnes e legumes. São bactérias acidófilas, tolerando baixos valores de pH do meio (entre 4,5 e 6). As bactérias láticas podem ser divididas em dois subgrupos bioquímicos de acordo com os produtos formados a partir de glicose: C) Bactérias homofermentativas São muito importantes e têm grande interesse na fabricação do ácido lático. Os primeiros estágios da via metabólica da fermentação lática são os mesmos da fermentação alcoólica, ou mais especificamente a via de Embden-Meyerhof ou via glicolítica. O intermediário importante para a formação do ácido lático é o ácido pirúvico. No final da via glicolítica, o ácido pirúvico, sob a ação da enzima lactato desidrogenase dá origem exclusivamente ao ácido lático. D) Bactérias heterofermentativas A fermentação da glicose por essas bactérias resulta em vários produtos. Enquanto as bactérias homofermentativas degradam a glicose através da via glicolítica, as heterofermentativas degradam a glicose através da via oxidativa das pentoses fosfato. Os compostos intermediários importantes na via 22 heterofermentativa são o ácido pirúvico e o aldeído acético. O rendimento líquido em ATP é de 2 moles / mol de glicose pela via homofermentativa e apenas de 1 mol / mol de glicose pela via heterofermentativa. Processo de obtenção do ácido lático Obtém-se o ácido lático a partir de diversas matérias-primas, subprodutos ou resíduos da indústria alimentícia, como soro do queijo, melaço, glicose de milho. Empregam-se, também, resíduos, como os das indústrias de papel e polpa de celulose e aglomerados que contém polímeros de açúcar. Os substratos utilizados principalmente são glicose, lactose e sacarose. Porém, substratos amiláceos como os de milho, batata e mandioca podem ser empregados, desde que pré-hidrolisados enzimaticamente. A concentração em açúcares do mosto é ajustada na faixa de 5 a 20% de acordo com o
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