Resumo Bioquímica ENZIMAS

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As enzimas são classificadas pelas reações que catalisam
- transferência de elétrons (íons hidretos ou [átomos de H)
- reações de transferência de grupo
- reações de hidrólise
- adição de grupos a ligações duplas ou formação de duplas ligações pela remoção de grupos
- transferência de grupos dentro da molécula para produzir formas isoméricas
- formação de ligações C-C, CS, CO, CN pelas reações de condensação acopladas à clivagem do ATP
COMO AS ENZIMAS FUNCIONAM / TRABALHAM
	O mecanismo da ação enzimática pode ser encarado de duas perspectivas diferentes. A primeira aborda a catálise em termos de alterações de energia que ocorrem durante a reação, ou seja, as enzimas fornecem uma rota de reação alternativa, energicamente favorável, diferente da reação não-catalisada. A segunda perspectiva descreve como o sítio ativo facilita quimicamente a catálise. 
- As enzimas afetam as velocidades da reação (aumentando) e não seu equilíbrio. 
E + S → ES EP E + P
 
 A energia nos sistemas biológicos é descrita em termos de energia livre, G. 
 Estado inicial da reação = estado basal ou estado fundamental.
 Variação de energia livre padrão = ∆Gº (298K, 1atm, [1M]). Como nos sistemas bioquímicos a concentração de H+ é geralmente muito distante de 1M, utiliza-se a variação de energia livre bioquímica padrão, ∆G’º (pH 7,0).
O equilíbrio (que em nenhum momento é afetado) entre S e P reflete a diferença entre as energias livres dos seus estados basais. Aqui, a energia livre de P do estado basal é menor que a de S, assim, ∆G’º é negativa e o equilíbrio favorece P. 
A. Alterações de energia que ocorrem durante a reação
	Há uma barreira energética entre S e P: a energia requerida para o alinhamento dos grupos que reagem, a formação de cargas transitórias instáveis, os rearranjos de ligações e outras transformações requeridas para a reação prosseguir em qualquer direção. Para sofrer a reação, as moléculas devem ultrapassar essa barreira e, portanto, elevar-se a um nível energético mais alto. No topo da energia da montanha está um ponto onde o decaimento para o estado S ou P é igualmente provável = ESTADO DE TRANSIÇÃO; que não dever ser confundido com intermediário de reação (ES ou EP), já que não é uma espécie química com estabilidade, é apenas um momento do deslocamento molecular com quebra ou formação de ligação e decai para o substrato ou produto. 
1. ENERGIA DE ATIVAÇÃO (∆G+) = A diferença entre os níveis de energia do estado basal e o de transição. 
- Alta ∆G+ = reação mais lenta
- Baixa ∆G+ = reação mais rápida
2. VELOCIDADE DA REAÇÃO 
Para as moléculas reagirem, devem conter energia suficiente para superar a barreira de energia do estado de transição. Na ausência de uma enzima, somente uma pequena proporção da população de moléculas pode possuir energia suficiente para atingir o estado de transição entre substrato e produto. A velocidade da reação é determinada pelo número dessas moléculas "energizadas". Em geral, quanto menor a energia livre de ativação, mais moléculas têm energia suficiente para superar o estado de transição e, assim, mais rápida é a velocidade da reação.
3. ROTA ALTERNATIVA DE REAÇÃO
 Uma enzima permite que uma reação ocorra rapidamente nas condições normais na célula, oferecendo uma rota de reação alternativa, com uma menor energia livre de ativação. A enzima não altera a energia livre dos substratos ou dos produtos e, logo, não altera o equilíbrio da reação.
B. Química do sítio ativo
1. Estabilização do estado de transição. 
O modelo chave-fechadura (1894) para as enzimas estruturalmente complementares aos seus substratos foi deixado de lado por causa da má interpretação que poderia gerar em relação à catálise enzimática, afinal, uma enzima assim seria pobre. Vejamos o exemplo de uma reação imaginária da quebra de um bastão metálico magnetizado, cuja enzima envolvida seria a bastonase. 				Na primeira figura (a), sem enzima, as interações magnéticas desempenham o lugar das interações fracas da ligação entre a enzima e o substrato. 							Na figura (b), temos uma bastonase com o sítio ativo (bolsão) revestido por magnetos firmemente ajustada ao bastão (complementar), e assim, o bastão (substrato) não consegue se curvar porque a enzima estabiliza o substrato, não ocorrendo a reação (enzima inútil) – complexo ES é mais estável e possui menor energia livre no estado basal que o substrato sozinha = aumento na energia de ativação. 														Na figura (c), temos uma enzima bastonase complementar ao estado de transição da reação (1946, Linus Pauling propôs que as interações ótimas entre E e S devem ocorrer apenas no estado de transição); que ajuda a desestabilizar o bastão contribuindo para a catálise da reação. O bastão se liga à bastonase, mas apenas um conjunto das interações magnéticas possíveis é utilizado para formar o complexo ES. A energia de ligação das interações magnéticas compensa o aumento da energia livre requerida para curvar o bastão. 
2. Outros mecanismos. 												O sítio ativo pode fornecer grupos catalíticos que aumentam a probabilidade de se formar o estado de transição. Em algumas enzimas, esses grupos podem participar em uma catálise ácido-básica geral, na qual os resíduos de aminoácidos doam ou aceitam prótons. Em outras enzimas, a catálise pode envolver a formação transitória de um complexo covalente enzima-substrato; ou pode envolver uma catálise por íons metálicos. 
* Catálise ácido-base geral (transferência de prótons mediada por outras classes de moléculas) = Muitas reações bioquímicas envolvem a formação de intermediários carregados instáveis que tendem a se degradar rapidamente às suas espécies reagentes constituintes impedindo a reação. Esses intermediários podem ser estabilizados através da transferência de prótons para ou de um substrato ou intermediário formando uma espécie que degrada mais facilmente em produtos. No sítio ativo das enzimas, várias cadeias laterais de aminoácidos podem atuar, semelhantemente, como doador e receptor de prótons.
* Catálise covalente = Uma ligação transitória é formada entre a enzima e o substrato. Isso altera o caminho da reação e resulta na catálise apenas quando o novo caminho tem uma energia de ativação menor que o caminho não catalisado. Ambas as novas etapas devem ser mais rápidas que a reação não catalisada. A ligação covalente formada entre a enzima e o substrato pode ativar um substrato para posterior reação de maneira que seja usualmente específica para o grupo particular ou a coenzima. 
*Catálise por íons metálicos = Metais ligados fortemente à enzima ou retirados da solução junto com o substrato podem participar da catálise de diversas maneiras. As interações iônicas entre a enzima ligada a um metal e o substrato podem ajudar a orientar o substrato para a reação ou estabilizar estados de transição da reação carregados. Os metais também podem mediar reações de oxi-redução por alterações reversíveis nos estados de oxidação dos íons metálicos. 
3. Visualização do estado de transição 
A conversão do substrato em produto, catalisada por enzimas, pode ser visualizada como sendo semelhante à remoção de um suéter de um bebê não-cooperativo. O processo possui uma elevada energia de ativação, pois a única estratégia razoável para remover a roupa (exceto rasga-la) requer que a agitação aleatória da criança determine uma posição em que ambos os braços fiquem completamente estendidos acima da cabeça - uma posição improvável. Entretanto, podemos visualizar uma mãe agindo como uma enzima, inicialmente entrando em contato com o bebê (formando o complexo ES) e, a seguir, orientando os braços do bebê para uma posição vertical e estendida, análoga ao estado de transição ES. Essa postura (conformação) facilita a remoção do suéter, resultando no bebê sem o blusão, que aqui representa o produto. (Nota: O substrato ligado à enzima [ES] está em um nível energético ligeiramente menor que o substrato não-ligado [S], o que explica a pequena "queda"na curva em ES.)
As velocidades e o equilíbrio da reação possuem definições termodinâmicas precisas
	Um equilíbrio tal como é descrito por uma constante de equilíbrio, Keq, ou apenas K. Sob as condições bioquímicas padrões, utiliza-se K’eq (ou K’). 
Da termodinâmica, as relações entre e K’eq e ∆G’º são descritas pela expressão: , onde R é a cte dos gases, 8,315J/mol K, e T é a temperatura absoluta, 298K (25ºC). Um valor negativo de ∆G’º reflete um equilíbrio de reação favorável, mas, isso não significa que a reação será rápida. 		A velocidade de qualquer reação é determinada pela concentração do(s) reagente(s) e por uma constante da velocidade = k. Para S P, tem-se v = k [S]; aqui, a velocidade depende apenas da concentração de S = reação de primeira ordem. Se a velocidade da reação depende da concentração de dois compostos diferentes ou se a reação for entre duas moléculas do mesmo composto = segunda ordem e k = M-1s-1, aí tem-se v = k[S1][S2]. 										A partir da teoria do estado de transição, podemos derivar uma expressão que relaciona a grandeza de uma constante de velocidade à energia de ativação: , onde k = cte de Boltzmann, e h = cte de Planck. O ponto importante aqui é que a relação entre k (cte velocidade) e a energia de ativação é inversa e exponencial. Em termos simplificados, essa é a base para a afirmação de que uma menor energia de ativação significa uma reação mais rápida. 
A energia de ligação contribui para a especificidade da reação e a catálise
- O que realmente separa as enzimas de outros catalisadores (competidores) é a formação de um complexo ES específico. A interação entre o substrato e a enzima nesse complexo é mediada pelas mesmas forças que estabilizam a estrutura protéica, incluindo pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas e iônicas. A formação de cada interação fraca é acompanhada pela liberação de uma pequena quantidade de energia livre, fornecendo um grau de estabilidade para a interação = energia livre de ligação. Se um centro ativo de uma enzima possui grupos funcionais arranjados otimamente para formar uma variedade de interações fracas com um substrato particular no estado de transição, a enzima não será capaz de interagir no mesmo grau com outra molécula. A própria enzima sofre uma alteração na conformação quando o substrato se liga, induzida por interações fracas múltiplas com o substrato = ajuste induzido, que serve para trazer grupos funcionais específicos da enzima em posição apropriada para catalisar a reação. 
- Os fatores físicos e termodinâmicos proeminentes que contribuem para a barreira da reação ∆G+ podem incluir: (1) a redução na entropia, na forma de decréscimo da liberdade de movimentação de duas moléculas na solução (benefício óbvio para ligar um substrato a uma enzima); (2) a concha de solvatação da água fazendo pontes de hidrogênio que circundam e ajudam a estabilizar a maior parte das biomoléculas na solução aquosa (mas as interações enzima-substrato substituem a maior parte ou todas as pontes de hidrogênio entre substrato e água – dessolvatação do substrato); (3) a distorção dos substratos que devem ocorrer em muitas reações; (4) a necessidade de alinhamento apropriado dos grupos funcionais catalíticos na enzima. A energia de ativação pode ser usada para ultrapassar todas essas barreiras (a energia de ligação envolvendo interações fracas formadas apenas no estado de transição da reação ajuda a compensar termodinamicamente qualquer distorção, principalmente redistribuição eletrônica, que o substrato precisa sofrer para reagir).
FATORES QUE AFETAM A VELOCIDADE DA REAÇÃO
Concentração do substrato
Um dos fatores que afetam a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima purificada é a concentração do substrato presente [S], e o estudo deste efeito na velocidade da reação é complicado pelo fato de a [S] variar durante o curso de uma reação à medida que o substrato é convertido em produto. Uma forma de simplificar este problema é medir a velocidade inicial da reação (V0). De maneira geral, as velocidades usadas nos cálculos cinéticos são velocidades iniciais. Para uma reação qualquer, a velocidade da reação será considerada inicial se, durante o tempo de medida da atividade, a variação da concentração do substrato for igual ou inferior a 5% da concentração inicial.					Em um experimento cinético a [S] é sempre muito maior que a concentração da enzima [E], e se o tempo de reação é suficientemente curto, as mudanças da [S] serão negligenciáveis, podendo ser considerada como uma constante. O efeito provocado em V0 pela variação da [S], quando a concentração de enzima é mantida constante está mostrado na Figura abaixo. Em concentrações pequenas do substrato, V0 aumenta quase linearmente com os aumentos de [S]. Em concentrações maiores de substrato V0 aumenta por incrementos menores em respostas aos aumentos da [S]. Finalmente, é alcançado um ponto acima do qual ocorrem apenas aumentos insignificantes em V0, mesmo diante de aumentos em [S], sendo este ponto chamado de velocidade máxima (Vmáx). 
 
Figura 1. Efeito da concentração de substrato na velocidade inicial de uma reação catalisada enzimaticamente.
O perfil cinético apresentado na Figura 1 levou Victor Henri a propor, em 1903, que uma enzima liga-se à molécula de seu substrato para formar o complexo ES, sendo este um passo obrigatório no processo catalítico enzimático. Esta idéia foi expandida em uma teoria geral da ação das enzimas, especialmente por Leonor Michaelis e Maud Menten, em 1913. Eles propuseram que a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido: 
A seguir, em um passo mais lento, o complexo ES se rompe com o reaparecimento da enzima livre e a formação do produto da reação P: 
A segunda reação (Equação 2) é mais lenta neste modelo e, portanto, limita a velocidade da transformação global do reagente em produto. Disto resulta que a velocidade da reação enzimática deve ser proporcional à concentração da substância reagente no segundo passo, ES.
Em qualquer instante de uma reação, a enzima existe em duas formas, a não ligada ao substrato, ou a forma livre E, e a forma ligada ES. Em concentrações pequenas do substrato [S], a maior quantidade da enzima estará na forma livre E. Nestas condições, a velocidade de reação será proporcional à [S] porque o equilíbrio da Equação 1, à medida que [S] aumentar, será deslocado na direção da formação de mais ES. A velocidade inicial máxima da reação (Vmáx) será atingida quando praticamente todas as moléculas da enzima estiverem na forma do complexo ES, e a concentração da enzima livre E é insignificante. Neste caso, diz-se que a enzima está “saturada” com o substrato e a velocidade da reação não aumenta mais com os aumentos de [S]. Em solução contendo um excesso de substrato, haverá um período cinético inicial chamado de estado pré-estacionário, ocorrendo o crescimento da concentração de ES. O estado pré-estacionário é, usualmente, de duração muito curta. A reação atinge o estado estacionário muito rapidamente e a concentração do complexo [ES] permanecerá praticamente constante durante o decorrer do tempo.
Equação de Michaelis-Menten
Modelo de reação: Michaelis e Menten propuseram um modelo simples, que explica a maioria das características das reações catalisadas por enzimas. Nesse modelo, a enzima combina-se reversivelmente com o substrato, formando um complexo ES que, subseqüentemente, degrada-se em produto, regenerando a enzima livre. O modelo, envolvendo uma molécula de substrato, é representado a seguir: 
 
S = o substrato
E = a enzima
ES = o complexo enzima-substrato
k = são as constantes de velocidade
A Equação de Michaelis-Menten (Equação 3) é a equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato. É uma expressão da relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade inicial máxima Vmáx, e a concentração inicial de substrato [S], todas relacionadasatravés da constante de Michaelis-Menten, Km. A constante de Michaelis-Menten é uma constante dinâmica, ou de pseudoequilíbrio, que expressa a relação entre as concentrações reais no estado estacionário ao invés de concentrações no equilíbrio. 
Uma relação numérica importante emerge da Equação de Michaelis-Menten no caso especial quando V0 é exatamente metade de Vmáx (Figura 1). Então:
Km é equivalente à concentração de substrato na qual V0 é igual à metade de Vmáx, e indica a “afinidade” de uma enzima pelo seu substrato. Quanto menor for o valor de Km, maior será a afinidade da enzima pelo substrato.
Todas as enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em relação à [S] são ditas seguir a cinética de Michaelis-Menten Entretanto, esta equação não depende do mecanismo de reação relativamente simples de dois passos. Muitas enzimas possuem mecanismos de reação muito diferentes entre si; como enzimas que catalisam reações com seis ou oito passos identificáveis, que exibem o mesmo comportamento cinético no estado estacionário. Portanto, o significado real e a magnitude de Vmáx e Km podem variar de uma enzima para outra. O significado real de Km depende de aspectos específicos do mecanismo de reação, como o número e as velocidades relativas dos passos individuas da reação. Considerando as reações de dois passos:
Para a reação de Michaelis-Menten, k2 é o limitante da velocidade; assim, quando k2 << k-1, Km se reduz ao valor k-1/k1 = constante de dissociação. Onde esta condição prevalece o Km representa uma medida da afinidade da enzima pelo substrato no complexo ES. Muitas vezes k2 >> k-1, e então Km = k2/k1. Em outros casos, k2 e k-1 são comparáveis e Km permanece com uma função mais complexa do relacionamento entre todas as três constantes de velocidade.
A Vmáx também varia muito de uma enzima para outra. Se uma enzima reage pelo mecanismo de dois passos de Michaelis-Menten, a Vmáx é equivalente a k2[Et], onde k2 é o passo limitante da velocidade. Entretanto, o número de passos da reação e a identidade do(s) passo(s) limitante(s) da velocidade podem variar de enzima para enzima. Na saturação, a maior parte da enzima está na forma EP e Vmáx = k3[Et], . Portanto pode-se definir a constante kcat (constante de velocidade de primeira ordem – número de renovação = número de moléculas de substrato que se convertem em produto em certa unidade de tempo em uma única molécula de enzima quando saturada com substrato) para descrever a velocidade limitante de qualquer reação catalisada por uma enzima nas condições de saturação. Cada enzima tem valores ótimos de kcat e Km que refletem o ambiente celular, a concentração do substrato normalmente encontrado in vivo pela enzima e a química da reação que está sendo catalisada.
- Características do Km. Km- a constante de Michaelis - é característico de uma enzima e de determinado substrato seu, e reflete a afinidade da enzima para aquele substrato. O Km é numericamente igual à concentração do substrato na qual a velocidade da reação é igual a ½ Vmax· O Km não varia com a concentração da enzima.
a. Km baixo. Um Km numericamente pequeno reflete uma alta afinidade da enzima pelo substrato, pois uma baixa concentração de substrato é necessária para atingir a metade da saturação da enzima- isto é, atingir a velocidade que é ½ Vmax.
b. Km alto. Um Km numericamente grande (elevado) reflete uma baixa afinidade da enzima pelo substrato, pois é necessária uma alta concentração de substrato para atingir a metade da saturação da enzima.
- Relação entre a velocidade e a concentração da enzima. A velocidade da reação é diretamente proporcional à concentração da enzima em qualquer concentração de substrato. Por exemplo, se a concentração da enzima é reduzida pela metade, a velocidade inicial da reação (v0), assim como a Vmax, são reduzidas à metade da velocidade original.
- Ordem de reação. Quando a [S] é muito menor que o Km, a velocidade da reação é aproximadamente proporcional à concentração do substrato. A velocidade da reação é então dita de primeira ordem com relação ao substrato. Quando a [S] é muito maior do que o Km, a velocidade é constante e igual à Vmax, A velocidade da reação, nesse caso, é independente da concentração de substrato e é dita de ordem zero em relação à concentração de substrato. 
A Equação de Michaelis-Menten pode ser algebricamente rearranjada em formas que são mais úteis no tratamento gráfico dos dados experimentais. 							Quando V0 é colocada em um gráfico contra [S], nem sempre é possível determinar quando a Vmax é alcançada, devido à ascensão gradual da curva hiperbólica em altas concentrações de substrato. Entretanto, se colocarmos 1/V0 versus 1/[S], obtém-se uma linha reta. Esse gráfico, o gráfico de Lineweaver-Burke (também chamado de gráfico dos duplos recíprocos) pode ser utilizado para calcular Km e Vmax, assim como para determinar o mecanismo de ação de inibidores enzimáticos.
Primeira ordem:
A segunda equação indica que quando [S] é muito pequena, a velocidade absoluta diminui a cada momento, à medida que [S] decresce. Porém, em um certo momento, uma fração constante de substrato presente se transforma em produto:
Como V0 diminui com o tempo na região de primeira ordem, gráficos de [S] e [P] contra o tempo são curvos. Pode-se determinar a quantidade de substrato utilizada ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo utilizando a equação integrada de velocidade de primeira ordem, cujo resultado será: 
Temperatura
- Aumento da velocidade com a temperatura. A velocidade de reação aumenta com a temperatura, até um pico de velocidade ser atingido. Esse aumento é devido ao aumento do número de moléculas com energia suficiente para atravessar a barreira de energia e formar os produtos da reação.
- Diminuição da velocidade com a temperatura. Uma elevação maior da temperatura resulta em redução na velocidade de reação, como resultado da desnaturação da enzima, induzida pela temperatura.
A influência da temperatura sobre a cinética da reação enzimática deve ser entendida em duas fases distintas: no princípio, aumentos de temperatura levam a aumentos de velocidade de reação, por aumentar a energia cinética das moléculas componentes do sistema, aumentando o número de choques. Esse efeito é observado em um intervalo de temperatura compatível com a manutenção da estrutura espacial da enzima. Temperaturas mais altas levam à desnaturação da enzima por alterarem as ligações químicas que mantêm sua estrutura tridimensional. Rompidas as pontes de hidrogênio, que são ligações bastante termolábeis, desencadeia-se uma cascata de alterações estruturais, levando a enzima a uma nova conformação ou a um estado sem estrutura definida. A temperatura que provoca desnaturação está, geralmente, pouco acima de sua temperatura ótima. Enzimas de baixo peso molecular compostas de uma única cadeia polipeptídica e possuindo pontes dissulfetos são geralmente mais estáveis ao calor do que enzimas oligoméricas, de alto peso molecular. O efeito da temperatura em uma enzima depende de um número de fatores que incluem o pH, a força iônica do meio e a presença ou ausência de ligantes. Os substratos freqüentemente protegem a enzima da desnaturação pelo calor. Na reação enzimática a constante de velocidade k é função crescente da temperatura do sistema. A influência da temperatura na constante de velocidade k obedece à lei de Arrhenius: k = k0 . e –α/ RT 
Onde:
• α: energia de ativação;
• R: constante dos gases perfeitos;
• T: temperatura absoluta do sistema.
A Figura 1 representa a equação acima. 
Representação da variação da constante de velocidade k com a temperatura absoluta T.
Lembrando que as enzimas são termolábeis, ao mesmo tempo que ocorre a reação enzimática que nos interessa, desenvolve-se também a reação de inativação térmica da enzima que atua no sistema: 
A constante de velocidade desta equação (k’) também é afetada pela temperatura de acordo com a lei de Arrhenius:
Sendo β a correspondente energiade ativação.
O efeito da temperatura na velocidade das reações é em geral expresso em termos de coeficiente de temperatura (Q10), fator pelo qual a velocidade aumenta quando a temperatura aumenta 10ºC:
	O banho de gelo faz parar a desnaturação, ou seja, mudança conformacional da enzima, enquanto o NaOH faz parar a reação (formação de produto).
pH
A estrutura e a forma do sítio ativo são decorrência da estrutura tridimensional da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais na estrutura protéica. Isto torna a atividade enzimática dependente do meio ambiente, notadamente do pH e da temperatura. O pH afeta a carga da cadeia lateral do aminoácido, alterando a afinidade dela pelo substrato.														A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade é máxima, a velocidade da reação diminui à medida que o pH se afasta desse valor ótimo, que é característico para cada enzima, mas com freqüência, está próximo do pH neutro. Ácidos, pela definição de Brönsted, são compostos capazes de dissociar-se, liberando H+. Ácidos fracos são aqueles em que a dissociação não é completa, restando em solução também uma porcentagem do ácido não dissociado; existe, portanto, um equilíbrio químico que pode ser escrito: HA↔ A+ H+								As concentrações relativas de HA e de A dependem do pH. Quando o valor do pH é baixo (alta concentração de prótons), o equilíbrio rearranja-se pelo aumento da concentração de HA e diminuição da concentração de A. Quando o valor do pH é alto (baixa concentração de prótons), ocorre o inverso. Os grupos R dissociáveis dos aminoácidos comportam-se de maneira análoga. 			Existe uma concentração hidrogeniônica que propicia um determinado arranjo de grupos protonados e desprotonados, que leva a molécula de enzima à conformação ideal para exercer seu papel catalítico. Esse pH ótimo depende do número e tipo de grupos ionizáveis que uma enzima apresenta, ou seja, depende de sua estrutura primária. Por outro lado, quando o substrato contém grupos ionizáveis, as variações de pH também poderão afetar sua carga. A Figura 1 apresenta uma curva experimental da V0 com relação à variação do pH (curva A) e a curva de estabilidade (curva B) para uma enzima. 
Efeito do pH na atividade e estabilidade de uma enzima, curva A: atividade da enzima, curva B: V0 em pH 6,8 após incubação em outros valores de pH. 
Observa-se que a incubação da enzima em pH 5 ou pH 8 não produz nenhum efeito na atividade medida em pH 6,8. Então, o declínio da atividade entre pH 6,8 e 8 e entre pH 6,8 e 5 deve resultar da constituição de uma forma iônica não adequada da enzima e/ou substrato. Quando a enzima é incubada em pH > 8 ou pH > 5, a atividade total não é obtida em pH 6,8. Portanto, parte do declínio na atividade acima de pH 8 e abaixo de pH 5 resulta em uma inativação irreversível da enzima. 
- Efeito do pH sobre a ionização do sítio ativo. A concentração de H+ afeta a velocidade de reação de várias maneiras. Primeiro, o processo catalítico geralmente requer que a enzima e o substrato tenham determinados grupos químicos em um estado ionizado ou não-ionizado, de modo a interagirem. Por exemplo, a atividade catalítica pode requerer que um grupo amino da enzima esteja na forma protonada. Em pH alcalino, esse grupo não está protonado e, desse modo, a velocidade da reação diminui.
- Efeito do pH sobre a desnaturação da enzima. Valores extremos de pH também podem levar à desnaturação da enzima, pois a estrutura da molécula protéica cataliticamente ativa depende do caráter iônico das cadeias laterais dos aminoácidos.
- O pH ótimo varia de acordo com a enzima. O pH no qual a atividade máxima da enzima é atingida difere para cada enzima e, geralmente, reflete a [H+] na qual a enzima funciona no organismo. Por exemplo, a pepsina, uma enzima digestiva do estômago, apresenta atividade máxima em pH 2, enquanto outras enzimas, destinadas a funcionar em pH neutro, são desnaturadas em meio com essa acidez.
O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas concentrações de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e o efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Como as enzimas são proteínas que contém muitos grupos ionizáveis, elas existem em diferentes estados de ionização, por isso, a atividade catalítica é restrita a uma pequena faixa de pH. A atividade da enzima deve ser então medida no pH ótimo. A estabilidade de uma enzima ao pH depende de muitos fatores como: temperatura, força iônica, natureza química do tampão, concentração de vários preservativos (por exemplo, glicerol, compostos sulfídricos), concentração de íons metálicos contaminantes, concentração de substratos ou cofatores da enzima e concentração da enzima. 
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
A catálise enzimática pode ser impedida ou diminuída por agentes moleculares, que, quando presentes no meio, ligam-se diretamente à enzima, impedindo sua ação = inibidores enzimáticos. Existem vários tipos de inibição: 
*Inibição Reversível: 
- Inibição Competitiva (inibidor compete o mesmo sítio que o substrato e deve ser, portanto ser relacionado estruturalmente com o substrato). 
 - Inibição Incompetitiva (trata-se de uma inibição por bloqueio do complexo ES. Supõe-se que existam na enzima dois sítios ativos: um reservado ao substrato e outro ao inibidor, mas este último só pode se fixar de modo reversível sobre o complexo intermediário ES). 
- Inibição Não-Competitiva (o inibidor não compete com o substrato pelo sítio ativo, mas vai ocupar outro sítio da enzima (sítio regulativo ou de inibição), formando além de complexos ES e EI, um terceiro complexo, enzima-inibidor-substrato (EIS)). 
- Inibição Mista (para alguns inibidores o complexo ESI possui alguma atividade catalítica ou o KEI e KESI não são iguais e nem infinitos. Também se liga em um sítio distinto do sítio ativo do substrato, mas ele se liga tanto em E quanto em ES). 
* Inibição Irreversível (Inibidores irreversíveis que se combinam com um grupo funcional na molécula da enzima e que é essencial para sua atividade, estes inibidores podem, também, promover a destruição de tal grupo. É comum a formação de uma união covalente entre um inibidor irreversível e uma enzima). 
INIBIÇÃO REVERSÍVEL COMPETITIVA = Os inibidores competitivos são substâncias que têm forma estrutural suficientemente semelhante à do substrato para poderem ligar-se ao sítio ativo da enzima (Figura 1). Faltam-lhe, entretanto, grupos químicos que pudessem levar a reação a cabo; o resultado da sua presença no meio de reação é o estabelecimento de uma competição entre as moléculas do inibidor competitivo e as do substrato pela ligação com o sítio ativo da enzima. O esquema da figura 1 representa um mecanismo em que E (a enzima livre), I e E•I estão em equilíbrio químico durante todo o processo catalítico; existe assim uma constante de equilíbrio Ki que relaciona as concentrações de equilíbrio destas três substâncias e que pode ser definida como a constante de dissociação do complexo E•I; onde tem-se que, quanto menor esse valor, maior a eficiência do inibidor (para inibir a enzima). 													Naturalmente, o porcentual de inibição resultante dependerá de dois fatores: (1) as concentrações relativas de substrato e inibidor competitivo; (2) da afinidade diferencial da enzima pelo substrato e pelo inibidor. Por suas características, a inibição competitiva é bastante específica. Como o inibidor se liga reversivelmente à enzima a competição pode se tornar favorável ao substrato, pela simples adição ao meio de reação de mais substrato, tornando mínima a probabilidade de uma molécula de inibidor se ligar à enzima. A reação, neste caso, exibirá uma Vmáx normal. Entretanto, o valor de Km aumentará na presença do inibidor. Resumindo, Inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo e, portanto o aumento da concentração do substrato pode deslocar oinibidor. Portanto Vmáx não se altera. O grau de inibição é marcado para baixas concentrações de substrato, mas diminui quando esta concentração aumenta podendo mesmo deixar de observar-se inibição para altas concentrações de substrato.														A Figura 2 mostra um conjunto de gráficos duplo-recíproco obtidos na ausência do inibidor e em duas concentrações diferentes de um inibidor competitivo. O aumento de [I] resulta na produção de uma família de linhas com intercepto comum no eixo 1/V0, mas com inclinações diferentes. Devido ao intercepto no eixo 1/V0 ser igual a 1/Vmáx observa-se que a velocidade máxima não muda quando a reação ocorre na presença de um inibidor competitivo, isto é, em uma dada reação enzimática sempre haverá uma concentração tão alta de substrato que deslocará o inibidor competitivo do sítio ativo da enzima, não importando quão alta seja a concentração do mesmo. 
Figura 1. Inibidores competitivos.
Figura 2. Gráfico duplo-recíproco da inibição competitiva.
- Efeito sobre a VMAX = O efeito de um inibidor competitivo é revertido pelo aumento da [S]. Em uma concentração de substrato suficientemente alta, a velocidade da reação atinge a VMAX observada na ausência do inibidor. 
- Efeito sobre o KM. Um inibidor competitivo aumenta o Km aparente para determinado substrato. Isso significa que, na presença de um inibidor competitivo, mais substrato é necessário para atingir ½ VMAX. 
- Efeito sobre a curva de Lineweaver-Burke. A inibição competitiva apresenta uma curva de Lineweaver-Burke característica, na qual as curvas da reação inibida e não-inibida interceptam o eixo do y em 1/Vmax (Vmax não é alterada). As reações inibida e não-inibida interceptam o eixo do x em pontos diferentes, indicando que o Km aparente é aumentado na presença do inibidor. 
Figura 3. Efeito da inibição sobre KM e VMAX
INIBIÇÃO REVERSÍVEL INCOMPETITIVA = Trata-se de uma inibição por bloqueio do complexo ES. Supõe-se que existam na enzima dois sítios ativos: um reservado ao substrato e outro ao inibidor, mas este último só pode se fixar de modo reversível sobre o complexo intermediário ES. 
A associação enzima-inibidor é não exclusiva. O inibidor não permite ao complexo ternário ESI evoluir para elaborar o produto. Neste tipo de inibição, a velocidade máxima (Vmáx) e Km são menores que na ausência de inibidor. A equação da velocidade é dada por:
INIBIÇÃO REVERSÍVEL NÃO-COMPETITIVA = O inibidor não compete com o substrato pelo sítio ativo, mas vai ocupar outro sítio da enzima (sítio regulativo ou de inibição), formando além de complexos ES e EI, um terceiro complexo, enzima-inibidor-substrato (EIS). A enzima é inativada quando o inibidor está ligado, o substrato estando também presente ou não. Uma concentração infinitamente alta de substrato não consegue levar toda enzima sob forma de ES, que é a forma produtiva. Para qualquer [I] uma parte da enzima permanecerá sob a forma [EIS], onde se pode prever que Vmáx será menor que a Vmáx observada na ausência de inibidor. Em geral, o efeito sobre Km é pequeno ou nenhum.
Na inibição não competitiva, gráficos construídos com os valores de velocidade obtidos experimentalmente produzem a família de linhas, com intercepto comum no eixo 1/[S] . Isto indica que Km para o substrato não é alterado por um inibidor não competitivo, mais Vmáx diminui.
Esse tipo de inibição pode ser reconhecido por seu efeito característico sobre Vmax. A inibição não-competitiva acontece quando o inibidor e o substrato ligam-se a sítios diferentes sobre a enzima. O inibidor não-competitivo pode ligar-se tanto à enzima livre quanto ao complexo ES, de modo a impedir que a reação ocorra. 
1. Efeito sobre a Vmax· A inibição não-competitiva não pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato. Desse modo, os inibidores não-competitivos diminuem a Vmax da reação.
2. Efeito sobre o Km. Os inibidores não-competitivos não interferem na ligação do substrato com a enzima. Assim sendo, a enzima mostra o mesmo Km na presença e na ausência do inibidor não-competitivo.
3. Efeito sobre a curva de Lineweaver-Burke. A inibição não-competitiva é facilmente diferenciada da inibição competitiva pela curva 1/v0 versus 1/[S], onde a Vmax diminui na presença de um inibidor não-competitivo, enquanto o Km não é alterado. 
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL = Inibidores irreversíveis são aqueles que se combinam com um grupo funcional na molécula da enzima e que é essencial para sua atividade, estes inibidores podem, também, promover a destruição de tal grupo. É comum a formação de uma união covalente entre um inibidor irreversível e uma enzima. Um substrato que se combina irreversivelmente com uma enzima pode assemelhar-se a um inibidor não competitivo porque Vmáx diminui, ao passo que Km permanece a mesma. A Vmáx diminui porque parte da enzima é completamente removida do sistema. 
Equação de Michaelis-Menten na presença de um inibidor irreversível:
ENZIMAS REGULADORAS
No metabolismo celular grupos de enzimas trabalham em conjunto, formando vias seqüenciais para desenvolver um dado processo metabólico. Nesses sistemas, o produto da reação da primeira enzima tornar-se o substrato da enzima subseqüente e assim sucessivamente. Em cada sistema enzimático, entretanto, há pelo menos uma enzima que determina a velocidade de toda a seqüência, porque ela catalisa a reação mais lenta ou a reação limitante da velocidade. Estas enzimas reguladoras têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, ajustando a velocidade de cada seqüência metabólica, devido às necessidades de energia e de biomoléculas requeridas no crescimento da célula e no seu auto-reparo. A atividade das enzimas reguladoras é modulada através de vários tipos de moléculas sinalizadoras, as quais são, em geral, pequenos metabólitos ou cofatores. Nas vias metabólitas existem duas grandes classes de enzimas reguladoras, as enzimas alostéricas e as enzimas reguladas pela modificação covalente.
ENZIMAS ALOSTÉRICAS
As enzimas alostéricas funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador. Estas enzimas são aquelas que possuem “outras formas” ou conformações induzidas pela união com moduladores. Em alguns sistemas multienzimáticos a enzima reguladora é inibida especificamente pelo produto final da via, sempre que este estiver em excesso em relação às necessidades celulares. Quando a velocidade da reação catalisada pela enzima reguladora diminui, todas as enzimas subseqüentes passam a operar em velocidades reduzidas, porque as concentrações de seus substratos diminuem proporcionalmente. Este tipo de regulação é chamado de inibição por retroalimentação. Os moduladores das enzimas alostéricas podem ser inibidores ou estimuladores, ou efetuadores alostéricos negativos ou positivos, respectivamente. O próprio substrato é freqüentemente um ativador e as enzimas reguladoras para as quais o substrato e o modulador são idênticos são chamadas de homotrópicas, quando o modulador é uma molécula diferente do substrato a enzima é heterotrópica. Algumas enzimas têm dois ou mais moduladores. Em adição ao sítio ativo ou catalítico, as enzimas alostéricas geralmente têm um ou mais sítios reguladores ou alostéricos para a ligação do modulador, sendo este específico para o seu modulador. As enzimas com vários moduladores geralmente têm sítio de ligação diferente e específico para cada um deles. Outras diferenças entre as enzimas não reguladoras e as alostéricas envolvem as propriedades cinéticas. As enzimas alostéricas mostram relações entre V0 e [S] que diferem do comportamento enzimático normal, do tipo Michaelis-Menten. Elas exibem saturação quando [S] é suficientemente alta, mas para algumas enzimas alostéricas quando V0 é colocada em gráfico contra [S] resulta em uma curva com saturação sigmóide e não na curva hiperbólica exibida pelas enzimas não reguladoras. 					Essas enzimas são compostas por subunidades múltiplas e o sítio regulatório, o qualliga o efetor, pode estar localizado em uma subunidade não-catalítica. A presença de um efetor alostérico pode alterar a afinidade da enzima pelo seu substrato ou modificar a atividade catalítica máxima da enzima ou ambos. Os efetores que inibem a atividade enzimática são denominados efetores negativos, enquanto aqueles que aumentam a atividade enzimática são denominados efetores positivos. As enzimas alostéricas geralmente possuem subunidades múltiplas e, freqüentemente, catalisam o passo comprometido com a via, no início da rota metabólica.
Efetores homotrópicos = Quando o substrato em si alua como efetor, o efeito é dito homotrópico. Um substrato alostérico funciona, mais freqüentemente, como um efetor positivo. Nesse caso, a presença de uma molécula de substrato em um sítio da enzima aumenta as propriedades catalíticas de outros sítios de ligação ao substrato, isto é, seus sítios exibem cooperatividade. Essas enzimas apresentam uma curva sigmoidal quando a velocidade de reação (v0) é relacionada com a concentração de substrato [S]. Isso contrasta com a curva hiperbólica característica da cinética de Michaelis-Menten, conforme discutido previamente. Efetores positivos e negativos de enzimas alostéricas podem afetar tanto a vmax quanto o Km ou ambos. 
Efetores heterotrópicos = O efetor pode ser diferente do substrato, em cujo caso o efeito é dito heterotrópico. Por exemplo, considere a inibição por retroalimentação mostrada na Figura 5.17. A enzima que converte A em B tem um sítio alostérico, no qual se liga o produto final E. Se a concentração de E aumenta (por exemplo, se ele não é utilizado tão rapidamente como é sintetizado), a enzima inicial da rota é inibida. A inibição por retroalimentação fornece à célula um produto de que ela necessita regulando o fluxo de moléculas de substrato em uma via que leva à síntese daquele produto.
MODIFICAÇÃO COVALENTE
	Algumas enzimas são submetidas a um processo de regulação que consiste na ligação covalente de um grupo químico à sua estrutura. Muitas enzimas podem ser reguladas por modificação covalente, mais frequentemente pela adição ou pela remoção de grupos fosfato de resíduos específicos de serina, treonina ou tirosina na enzima. A fosforilação de proteínas é reconhecida como uma das principais formas pelas quais os processos celulares são regulados.
Fosforilação e desfosforilação = As reações de fosforilação e desfosforilação são catalisadas por uma família de enzimas, denominadas de proteína-cinases, as quais utilizam trifosfato de adenosina (ATP)
como doador de fosfato. Os grupos fosfato são clivados de enzimas fosforiladas pela ação das fosfoproteínas-fosfatases. 
Resposta da enzima à fosforilação = Dependendo da enzima específica, a forma fosforilada pode ser mais ou menos ativa do que a forma não-fosforilada. Por exemplo, a fosforilação da glicogênio-fosforilase (enzima que degrada o glicogênio) aumenta sua atividade, enquanto a adição de fosfato à enzima glicogênio-sintase (enzima que sintetiza o glicogênio) diminui sua atividade. 
INDUÇÃO E REPRESSÃO DA SÍNTESE DE ENZIMAS
Os mecanismos reguladores descritos previamente modificam a atividade de moléculas enzimáticas existentes. Entretanto, as células também podem regular a quantidade de enzima presente - em geral alterando a velocidade da síntese da enzima. O aumento (indução) ou a diminuição (repressão) da síntese da enzima leva a uma alteração na população total de sítios ativos. (Nota: Nesse caso, a eficiência das moléculas existentes da enzima não é afetada.) As enzimas sujeitas à regulação da síntese em geral são aquelas que são necessárias apenas em um estágio do desenvolvimento ou em condições fisiológicas especiais. Por exemplo, níveis elevados de insulina, como resultado de altos níveis de glicose no sangue, levam a um aumento na síntese de enzimas-chave no metabolismo da glicose. Em contraste, enzimas que são continuamente utilizadas geralmente não são reguladas pela alteração da velocidade de sua síntese. Alterações dos níveis enzimáticos como resultado da indução ou da repressão da síntese protéica são lentas (de horas a dias), comparadas com as alterações reguladas alostericamente, as quais ocorrem em segundos a minutos.