RELATORIO DE PRATICAS 3.docx

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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará.
Graduação Tecnológica em Gestão Ambiental.
Disciplina: Microbiologia Básica
Professora: Sâmara Sales
Relatório de Práticas Microbiológicas 03
Alunos:
Andreza Sousa
Helena Vasconcelos
Lígia Sousa
Fortaleza, CE
13 de fevereiro de 2017
Sumário
Introdução ------------------------------------------------------------- 5
Objetivos e Materiais ------------------------------------------------ 
Métodos --------------------------------------------------------------- 
Resultados e Discussões ---------------------------------------------
Conclusão ------------------------------------------------------------- 
Referências ------------------------------------------------------------ 
	
Introdução
	A obtenção da maior parte do conhecimento sobre metabolismos dos microrganismos provém do estudo de culturas laboratoriais. Para uma célula realizar fissão binária é necessária a coordenação de inúmeras reações químicas distintas e a organização de algumas estruturas particulares. Desde modo, é indiscutível a importância de aquilatar os meios de cultura e suas respectivas funções, como também ressaltar os indispensáveis nutrientes que são usados no metabolismo de cada microrganismo. (MADIGAN et al, 2010)
	São denominadas nutrientes as substâncias que se baseiam, de maneira principal, em macromoléculas, as quais são essenciais ao estabelecimento da vida. De acordo com o microrganismo, as exigências nutricionais variam, suprindo as carências individuais da célula para um desenvolvimento ideal. Por conseguinte, os meios de cultura são igualmente diversificados para abastecer cada situação.
	Conforme Madigan et al (2010, p. 111):
Meios de cultura correspondem às soluções nutrientes utilizadas para promover o crescimento de micro-organismos em laboratório. Pelo fato de a cultura em laboratório ser requerida para o estudo detalhado de um micro-organismo, é necessária atenção criteriosa na seleção e no preparo dos meios para que o cultivo seja bem sucedido.
	Os meios de cultura possuem diversas finalidades e podem ser classificados como definidos ou complexos. Os meios identificados como definidos têm quantidades precisamente conhecidas de compostos inorgânicos e orgânicos. Já os meios de cultura complexos são largamente utilizados em cultivo de muitos microrganismos, mas não se faz essencial o conhecimento de sua composição exata.
	No entanto, os microrganismos se encontram no ambiente natural, onde a localização e o isolamento são dificultosos devidos às condições não serem ideais. Ao serem utilizados para estudos, os microrganismos precisam ser isolados, a fim de que se possa conhecer suas características, classificações e seu papel na natureza, além de se poder identificar, muitas, vezes, o seu metabolismo, o que é importante para a descoberta e controle de várias doenças.
	 Diante disso, “os microbiologistas utilizam de meios diferenciais quando querem diferenciar os vários tipos de microrganismos em uma placa com ágar”, e meios seletivos, quando querem apenas permitir o crescimento de microrganismos específicos, pois esses apresentam algum indicador e/ou lactose, por exemplo. (PELCZAR, 1998, p. 155)
	Por esses motivos, confirma-se a importância de tomar conhecimento dos nutrientes absorvidos pelos microrganismos e, portanto, faz-se inseparável os estudos das provas bioquímicas das preparações e estudos dos meios. 
 
Objetivos
		
	Preparar diferentes meios de cultivo de microrganismos e discutir suas ações; 
	Conhecer os princípios das provas bioquímicas utilizadas na identificação de espécies microbianas;
	Executar técnicas e interpretar resultados de identificação de espécies bacterianas através de provas bioquímicas;
Materiais
Microrganismos: Escherichia coli, Salmonella sp, Shigella sp, Klebsiella sp, Enterobacter sp, e Serratia sp.
Meios de cultura e reagentes:
A1 Medium
Citrato de Simmons
Eosin Blue Methylene (EMB)
MacConkey
SIM
Triple Sugar Iron (TSI)
Diversos
Bastão de vidro
Pipeta
Estante para tubos
Tampões
Tubo de ensaio
Béquer
Agulha e alça de inoculação
Lamparina
Água destilada
Metodologia 
Esta prática foi realizada em três partes, na primeira, preparou-se o meio de cultura A1 Medium. Na segunda, fez-se a inoculação do microrganismo desconhecido, previamente identificado com o número 5, nos meios de cultura A1 Medium, Citrato de Simmons, Eosin Blue Methylene (EMB), MacConkey, SIM e Triple Sugar Iron (TSI). Por fim, na terceira, interpretou-se os resultados de identificação microbiana por meio de provas bioquímicas. 
As técnicas utilizadas e os procedimentos realizados em cada etapa serão descritos abaixo.
Preparação do Meio de Cultura A1 Medium
Descrição do Meio
Composição
Peptona de caseína (20g): constituída de peptídeos, aminoácidos livres e fatores de crescimento, então fornece nitrogênio, aminoácidos e vitaminas no meio;
Lactose (5g): Hidrato de carbono, composto por glicose e galactose, é fonte de carbono, e assim fornece a energia necessária ao desenvolvimento do microrganismo;
Cloreto de sódio (5g): substância inorgânica substância inorgânica classificada como sal, mantém o equilíbrio osmótico do meio; 
Salicina (0,5g): fonte de carboidratos fermentáveis que ajudam no desenvolvimento de microrganismos, junto à lactose fornece energia;
Triton X-100 (1g): surfactante;
Finalidade
Utilizado para a detecção de coliformes fecais em água e alimentos;
Classificação 
É um meio seletivo, permite o crescimento de um tipo de microrganismo ou inibe o crescimento de outros. Neste caso, normalmente é o microrganismo Escherichia coli;
Uma reação positiva à presença de coliformes é indicada pela produção de gás ou de gás dissolvido no local do cultivo do microrganismo.
Reações Bioquímicas
Uma reação positiva à presença de coliformes é indicada pela produção de gás ou de gás dissolvido no local do cultivo do microrganismo.
Pesagem dos Ingredientes
Fez-se a pesagem do meio de cultura em pó, desidratado, em uma balança específica. No rótulo da embalagem do meio possuía a informação de preparação, a cada litro de água devia-se colocar 31,5g de meio, mas utilizou-se apenas 80ml de água, dessa forma, por meio de regra de três, calculou-se que a massa necessário seria de 2,52g.
- Informações para pesagem
Meio de Cultura: A1 Medium
Indicação do rótulo: 31,5g / 1 Litro
Cálculo da massa a ser pesada: 2,52g / 80ml
Dissolução dos Ingredientes
Adicionou-se ao recipiente contendo o meio A1 Medium, uma quantidade de água destilada (medição feita com auxílio de uma proveta) aproximadamente a metade daquela necessária ao meio pronto. Agitou-se constatemente com um bastão vidro. 
Completou-se o volume do meio com o restante da água destilada após a formação de uma suspensão homogênea;
Aqueceu-se por poucos minutos
Distribuição dos Meios
Antes de distribuir o meio nos tubos de ensaio, previamente identificado com o código da equipe, colocou-se em cada um deles um tubo de Durham. Depois distribui-se o meio nos tubos de ensaio e inverteu-se o mesmo a fim de retirar bolhas de ar do tudo de Durham;Figura 1.4. Meio de cultura A1 Medium distribuído em tubo de ensaio. Note a presença do tudo de Durham.
A esterilização dos meios foi feita pelo monitor da disciplina;
Após os procedimentos, o meio foi guardado em estufa com temperatura adequada para posterior inoculação de microrganismos, que será descrita a seguir.
Inoculação do microrganismo nos meios de cultura
Nesta parte da aula prática inoculou-se o microrganismo 5 em cada um dos meios preparados pelas equipes do laboratório, estes meios foram: A1 Medium, Citrato de Simmons, Eosin Blue Methylene (EMB), MacConkey, SIM e Triple Sugar Iron (TSI). As técnicas utilizadas para a inoculação serão descritas a seguir:
Inoculação do microrganismoem meio liquido no meio contendo A1 Medium e meio SIM
Aqueceu-se ao rubro, na chama de uma lamparina, a alça de inoculação;
Com uso da mesma, transferiu-se assepticamente (flambando-se a boca do tudo ao abrir e ao fechar) parte da colônia do microrganismo 5 para o tubo de ensaio;
Guardou-se os tubos em estufas com temperatura controlada para o bom crescimento desses microrganismos, a fim de analisá-los na terceira parte da prática;
Inoculação do microrganismo em meio sólido para os meios contendo Citrato de Simmons, Eosin Blue Methylene (EMB), MacConkey, e Triple Sugar Iron (TSI)
Em todos eles utilizou-se a mesma técnica de inoculação, que será descrita abaixo:
Aqueceu-se ao rubro, na chama de uma lamparina, a agulha de inoculação;
Com o uso da mesma, transferiu-se assepticamente parte dos microrganismos para cada tubo de ensaio por meio da técnica em estrias;
Guardou-se os tubos em estufa com temperatura controlada para o bom crescimento desses microrganismos, a fim de analisar o metabolismo microbiano na terceira parte da prática;
Interpretação de resultados pelas provas bioquímicas
	Cada meio tem sua classificação e, portanto, função. Dessa forma, de acordo com as reações que ocorreram entre o microrganismo e o meio no qual foi inoculado, pode-se descobrir como funciona o seu metabolismo e quais nutrientes ele utiliza. 
	Dessa forma, será descrito abaixo os possíveis resultados encontrados em cada meio a fim de facilitar a descrição do microrganismo no tópico 5 deste relatório, o qual trará os resultados obtidos e as discussões.
Resultados e Discussões
	Cada microrganismo tem suas características específicas, assim, eles terão ações diferentes nos meios de cultura utilizados. Desse modo, a identificação da bactéria será feita por meio da análise das provas bioquímicas, que são as ações de cada microrganismo em determinado meio. 
	Utilizou-se a tabela abaixo, a qual contém os resultados das provas bioquímicas para os possíveis microrganismos, para comparar com os resultados obtidos na prática, a fim de identificar qual o microrganismo foi trabalhado.
	Característica
	E. coli
	Salmonella sp
	Shigella 
sp
	Klebsiella sp
	Enterobacter
	Serratia sp
	Motilidade
	V
	+
	+
	-
	+
	+
	H2S
	-
	+
	+
	-
	-
	_
	Indol	
	+
	-
	v
	-
	-
	_
	Citrato
	-
	v
	-
	+
	+
	+
	EMB
	Lac +
	Lac -
	Lac -
	Lac+
	Lac+
	Lac +
	Lactose
	+
	-
	-
	+
	+
	_
	Sacarose
	V
	-
	v
	+
	+
	+
	GlicoseTABELA 5.1. Resultados esperados das provas bioquímicas feitas com os microrganismos Escherichia coli, Salmonella sp, Shigella sp, Klebsiella sp, Enterobacter sp, e Serratia sp para comparação de resultados obtidos.
Obs: + (positivo), - (negativo), V (variável)
	+
	+
	+
	+
	+
	+
A tabela abaixo mostra os resultados obtidos por meio da inoculação do microrganismo desconhecido nos diversos meios.
Microrganismo inoculado: 5
	Provas
	Resultado dos Testes
	Observações
	Motilidade
	+
	
	H2S
	+
	
	Indol
	-
	
	VM
	Testes não realizados.
	VP
	
	Citrato
	-
	
	EMB
	-
	
	Lacose (MacConkey)
	+
	
	Lactose (A1 Medium)
	-
	Mas houve um crescimento mínimo no centro do líquido.
	Lactose (TSI)
	-
	
	Sacarose
	-
	
	GlicoseTABELA 5.2. Resultados obtidos das provas bioquímicas feitas com o microrganismo 5.
Obs: + (positivo), - (negativo), 
	+
	
FIGURA 5.1. Não houve reação no meio Citrato de Simmons.
FIGURA 5.2. Não houve reação no meio A1 medium, não houve a formação de gás no tudo de Durham.
FIGURA 5.3. Não houve reação no meio Agar MacConkey
FIGURA 5.4. Houve reação no meio TSI
FIGURA 5.5. O meio SIM ficou turvo.
FIGURA 5.6. Houve reação no meio EMB.
	Pela análise e comparação das duas tabelas, levantou-se a hipótese de que o microrganismo 5 pode ser a bactéria Salmonella sp pelos motivos abaixo:
No meio de cultuta Citrato De Simmons não houve reação, indicando que o microrganismo é citrato negativo, ou seja, não há a utilização do citrato como fonte de carbono. Assim, não houve reação e o pH do meio premasseu ácido e, portanto, na cor verde;
No meio A1 Medium não houve formação de gás do tubo de Durham, o que indica que não houve a fermentação da lactose, classificando o microrganismo como lactose negativo;
No meio TSI, a base ficou amarelo e o ápice adquiriu cor rosa avermelhado, o que indica que houve a fermentação da glicose, e é Sacarose/Lactose negativo;
O Meio SIM ficou turvo, indicando que há motilidade na amostra bacteriana; Além de não ter ocorrido formação de um anel róseo, indicando que não houve a degradação do aminoácido triptofano, classificando o microrganismo como Indol negativo;
Por fim, nos meios EMB e MacConkey não houve crescimento de microrganismo, o que mostra possíveis erros durante o processo de inoculação, indicando, assim, uma possível falha na identificação correta do microrganismo.
Conclusão
	Tornou-se possível constatar a importância dos meios de cultura, uma vez que o uso dos variantes destes possibilitam o cultivo de microrganismos específicos, a sua identificação em uma amostra mista e os estudos das reações bioquímicas.
	Por conta dos estudos da Microbiologia, é possível o avanço em diversas extensões da ciência, como na Medicina, por meio de estudo de microrganismos patogênicos e possíveis tratamentos, ressaltando a importância dos meios de cultivo seletivos.
	Além disso, é importante ressaltar a importância de todos os processos realizados, como o aquecimento ao rubro da agulha ou alça de inoculação, a transferência sempre próximo à chama e a inoculação correta, a fim de que não ocorram erros que possam comprometer a correta identificação do microrganismo
	Com o intuito de finalizar, é inequívoco ressaltar que apenas são realizáveis os avanços da Microbiologia na contemporaneidade devidos os esforços do cientista Robert Koch. 
REFERÊNCIAS
PELCZAR, M.J.; Chan, E. C. S; Krieg, Noel R. Microbiologia: aplicações. 2004. 2.ed. São Paulo: Pearson Education do Brasil.
MADIGAN, M. T; MARTINKO, J. M. J. P. Microbiologia de Brock. São Paulo: Prentice Hall, 2004.