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30/11/2013 1 FUNDAMENTOS DE ENGENHARIA GENÉTICA O que é Engenharia Genética? • É um conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) de material genético in vitro • Também conhecida como “Tecnologia do DNA Recombinante” • Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo 30/11/2013 2 Os “pais” da Engenharia Genética Herbert Boyer Stanley Cohen Paul Berg Clonagem Molecular Para se estudar um determinado gene que codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo. Clonagem = fazer várias cópias idênticas Clonagem de DNA → isolar um fragmento específico de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias idênticas Primeiras clonagens (1972-73): Paul Berg, Herbert Boyer e Stanley Cohen 30/11/2013 3 Requerimentos 1) Método para clivar o DNA alvo 2) Método para juntar 2 moléculas de DNA covalentemente (inserto + vetor) 3) Método para introduzir moléculas de DNA na célula hospedeira 4) Método para selecionar células contendo moléculas de DNA quimérico ou recombinantes 5) Métodos para o screening da característica procurada As “Ferramentas” 1) Células hospedeiras 2) Enzimas 3) Vetores 30/11/2013 4 CÉLULAS HOSPEDEIRAS Células hospedeiras Características • permitir a replicação do vetor • permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia) • não deve modificar o DNA exógeno • não pode representar perigo ao meio ambiente Podem ser procariotos (Escherichia coli) ou eucariotos (leveduras, células vegetais, células de insetos e mamíferos em cultura) 30/11/2013 5 Métodos de introdução do DNA na célula hospedeira • Transformação com cloreto de cálcio (bactérias) • Transdução (fagos empacotados in vitro) • Transfecção (células de mamíferos) • Eletroporação (leveduras e bactérias) • Biolística ou “biobombardeamento” (plantas) • Microinjeção (ovos e oócitos) Gene Gun: bombardeamento de partículas 30/11/2013 6 Microinjeção ENZIMAS 30/11/2013 7 Enzimas de Restrição • São endonucleases que clivam o DNA em sequências específicas chamadas sítio de restrição. • Quebram a ligação fosfodiéster • Os sítios de restrição são, geralmente, sequências palindrômicas (mesma sequência nos dois sentidos) • Aplicações: - clivagem do DNA para gerar fragmentos com extremidades conhecidas (coesivas ou não) a fim de facilitar a clonagem - Mapeamento de polimorfismo Descoberta das E.R. (1971) Werner Arber 30/11/2013 8 Produzem extremidades coesivas ou abruptas (cegas) EcoRI 5´-GAATTC-3´ (5´-salientes) 3´-CTTAAG-5´ PstI 5´-CTGCAG-3´ (3´-salientes) 3´-GACGTC-5´ SmaI 5´-CCCGGG-3´ 3´-GGGCCC-5´ 30/11/2013 9 Multiple Cloning Site (MCS) (polilinker) DNA Ligase • Promover a união de moléculas de DNA pela formação de uma ligação fosfodiéster entre uma extremidade 3’-OH e outra 5’-PO4 • Aplicações: • Ligação entre fragmentos de DNA • Reparo de “nicks” (cortes) no DNA 30/11/2013 10 DNA Ligase: ligação de fragmentos DNA Ligase: reparo 30/11/2013 11 DNA Polimerases • DNA polimerase DNA-dependente • Necessita uma extremidade 3’-OH • Direção da síntese 5’→3’ • Aplicações: �marcação de DNA para fazer “sondas radioativas” (DNA Pol I) �PCR (Taq Polimerase) �Preenchimento de extremidades coesivas (fragmento Klenow da DNA Pol I) Fosfatase Alcalina • Retira grupos fosfato de extremidade 5’ ou 3’ • Transforma 5’-PO4 em 5’-OH • Aplicação: defosforilação da extremidade 5’ do DNA para evitar reanelamento de plasmídios 30/11/2013 12 Transcriptase reversa • DNA polimerase RNA-dependente • Atividade polimerásica 5’→3’ • Requer primer • Aplicação: síntese de cDNA VETORES 30/11/2013 13 Os Vetores São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado. Características que os vetores devem possuir: � habilidade de se duplicar na célula hospedeira � marca genética para selecionar a célula contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas) � sítios de clonagem únicos � quantidade mínima de sequências não- essenciais. Tipos de vetores • Plasmídios • Bacteriófagos (fagos) • Cosmídios • Cromossomos artificiais de levedura (YAC) • Vetores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos 30/11/2013 14 Plasmídios - Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autônoma (ORI) - Têm marcas de seleção para resistência a antibióticos ou complementação auxotrófica - Podem-se clonar fragmentos de até 10 kb - Clonagem por inativação dos genes de resistência a antibióticos (série pBR) ou por α-complementação do gene lacZ (série pUC) 30/11/2013 15 Bacteriófagos • Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na célula hospedeira Fago λλλλ - dsDNA circular - foram retirados 20 kb do genoma do fago necessários para integração/excisão para serem substituídos por DNA exógeno e formar um genoma de 50 kb que é empacotado in vitro. - Genomas maiores ou menores não são empacotados. - ciclo lítico compulsório. 30/11/2013 16 30/11/2013 17 Cosmídios • São plasmídios contendo as extremidas “cos” do fago λ • Capacidade de clonagem: 40 kb 30/11/2013 18 Cromossomos artificiais 30/11/2013 19 Geração de moléculas recombinantes - Clonagem Molecular - CLONAGEM 30/11/2013 20 Ligação de extremidades compatíveis Criando um DNA recombinante 30/11/2013 21 Transformação Bacteriana Seleção em placas contendo antibióticos Clonagem de um fragmento de DNA exógeno em E. coli usando o pBR322 como vetor 30/11/2013 22 Clonagem em vetores contendo o gene LacZα 30/11/2013 23 The b-galactosidase gene is disrupted when another piece of DNA is cloned to disrupt it. The substrate "X-gal" turns blue if the gene is intact, ie. makes active enzyme. White colonies in X-gal imply the presence of recombinant DNA in the plasmid. 30/11/2013 24 Bacteriófago lambda - genes necessários à produção de fagos - DNA exógeno de um tamanho compatível - Recombinantes empacotados em partículas de fago viáveis 30/11/2013 25 30/11/2013 26 Seleção • Seleção: refere-se às condições que permitem que a multiplicação das células desejadas ou fagos (contendo só o vetor ou vetor+inserto) enquanto restringindo outras células de se multiplicarem. • Métodos de seleção típicos incluem: � resistência e sensibilidade a antibióticos; � requerimentos nutricionais (auxotrofia); � formação de placas (fagos). “Screening” • O “screening” permite que todas as células cresçam mas evidencia os clones que apresentam uma característica desejada. Geralmente, esta caracterísitca está associada à presença de um inserto no vetor. • Tipos de “screening” �Resistência e sensibilidade a antibióticos; �Requerimentos nutricionais; �Seleção azul-branco (atividade β-galactosidase); �Específico (hibridação de ácidos nucleicos ou anticorpos). 30/11/2013 27 Identificação de um clone de interesse - hibridação com sonda radioativa; - anticorpo específico Bibliotecas de DNA 30/11/2013 28 Bibliotecas genômicas e de cDNA As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor (geralmente, um fago) Tipos: A) Genômica: - clonado diretamente do genoma - têm introns B) cDNA: - feita a partir de mRNA, - representa os genes que são transcritos, - não têm introns, só as regiões codantes, 5’- UTRe 3’-UTR de um gene, têm a cauda poli(A) Biblioteca de cDNA - mRNA de um tipo celular específico; - “primer” de oligo(dT) e Transcriptase Reversa; - DNA Polimerase I e dNTPs; - Clonagem em um vetor de escolha 30/11/2013 29 Algumas Aplicações da Engenharia Genética � Análise da estrutura/função de genes � Produção de proteínas de interesse industrial e terapêutico � Engenharia proteica � Criação de organismos transgênicos � Terapia gênica Proteínas Recombinantes 30/11/2013 30 Sequências de DNA de um vetor de expressão de E. coli Vetores de expressão 30/11/2013 31 30/11/2013 32 Plantas Transgênicas 30/11/2013 33 Animais Transgênicos 30/11/2013 34 Microinjeção de DNA no núcleo de ovo fertilizado de camundongo - gene do fator de crescimento humano 30/11/2013 35 Truta transgênica “Andi”, o primeiro primata transgênico
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