Biotecnologia_DNA recombinante

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BIOTEC 
 
Professora: Raquel Bagattini 
Curso: Ciências Biológicas - Bacharelado 
Período: 7º Semestre 
 
 
ü Aula Teórica: Engenharia genética. 
1 Técnicas do DNA recombinante: 
 - Enzimas de restrição e vetores de clonagem e de expressão, 
 - Vantagens da utilização das moléculas de DNA recombinante 
 - Princípios da transformação de bactérias, 
2- Bibliotecas de DNA (Bancos de DNA genômicos e de cDNA); 
- projeto genoma; 
3- Métodos de análise dos ácidos nucleicos: 
- Sequenciamento de DNA, 
- Reação de polimerização em cadeia (PCR) e PCR em tempo real 
 - Microarray 
 - Interferência de RNA (RNAi) 
 
1 - Técnicas do DNA recombinante 
• ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
São enzimas produzidas normalmente por bactérias e que possuem a propriedade de defendê-las de vírus 
invasores. Essas substâncias atuam como tesouras na molécula de DNA, reconhecem e atuam sobre sequências 
específicas, catalisando a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a 
determinadas bases (guanina, timina, citosina, adenina, 
uracila), levando a produção de fragmentos 
contendo pontas adesivas, que podem se ligar a outras 
pontas de moléculas de DNA que tenham sido 
cortadas com a mesma enzima. O local do “corte” é 
conhecido como sítio alvo. 
* Uma das primeiras enzimas de restrição foi a EcoRI, 
produzida pela bactéria Escherichia coli. Essa enzima 
reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre 
entre o G e o primeiro A, formando um corte coesivo. 
Ao cortarem o DNA, os fragmentos resultantes 
apresentam extremidades coesivas ou extermidades 
cegas. Quando as duas cadeias de DNA apresentam a 
mesma sequência, na mesma direcção, designa-se por 
palindroma. Utiliza-se a electroforese para visualizar os fragmentos resultantes dos cortes destas enzimas. 
• VETORES 
Um vetor de clonagem é uma fração de DNA que pode ser usado 
para inserir uma molécula de DNA estranha e tem a capacidade de 
ser inserido em um hospedeiro para fins de clonagem. Uma 
característica ideal de um vetor de clonagem é a fácil inserção e 
remoção do fragmento de DNA por tratamento de enzimas de 
restrição e tratamento de enzimas de ligação. Os plasmídeos 
geneticamente modificados são usados nesse caso. Já um vetor de 
expressão é especificamente usado para expressão de proteínas na 
célula hospedeira. Seu foco inicial é fazer m-RNA estável e assim 
produzir proteínas. 
 
 
• ETAPAS DA CLONAGEM DO DNA 
1 – Isolar o gene de interesse. 
Esse processo baseia-se em enzimas de restrição (que cortam o DNA) e na DNA ligase (que une/cola o DNA). 
Primeiramente é necessário isolar o fragmento de DNA de interesse. Para que se tenha o DNA recombinante, de 
duas origens diferentes, é necessário utilizar as enzimas de restrição. Essas enzimas reconhecem a sequência alvo 
específica e cortam seletivamente o fragmento que será 
utilizado. Se duas moléculas tiverem saliências 
correspondentes, elas podem parear bases e 
permanecer juntas. Contudo, elas não irão se combinar 
para formar uma molécula de DNA intacta até que 
sejam unidas pelo DNA ligase, que sela as lacunas do 
eixo do DNA. 
A meta na clonagem é inserir um gene alvo num 
plasmídeo. Usando uma enzima de restrição 
cuidadosamente escolhida, digerimos: O plasmídeo, 
que tem um único local de corte -> O fragmento do 
gene alvo, que tem um sítio de restrição (de corte) 
próximo a cada extremidade. Então, combinamos os fragmentos com DNA ligase, que os une para fazer um 
plasmídeo recombinante contendo o gene. 
2 - Inserir o plasmídeo na bactéria. 
Os plasmídeos e outros DNA podem ser introduzidos nas bactérias, num processo chamado transformação. 
Durante a transformação, é dado um choque (por exposição a alta temperatura, por exemplo) a células bacterianas 
especialmente preparadas que as encoraja a incorporar DNA estranho. 
O fragmento de DNA é inserido em um vetor, que é uma molécula de DNA na qual um gene é inserido para 
construir a molécula de DNA recombinante. 
Geralmente os plasmídeos (moléculas de DNA 
circulares existentes naturalmente nas bactérias) são 
usados como vetores para clonar fragmentos de 
DNA. Eles são projetados para permitir a inserção de 
um DNA exógeno, têm origens de replicação e são 
capazes de se replicar independentemente do 
cromossomo bacteriano. 
Assim, o fragmento do gene alvo se une ao vetor, através da DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante 
contendo o gene de interesse. A DNA ligase é a responsável por selar as lacunas do eixo do DNA, funcionando 
como uma “cola”. 
No entanto, apenas uma pequena minoria das bactérias vai ter sucesso em pegar um plasmídeo. Um plasmídeo 
geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que permite que as bactérias sobrevivam na presença de 
um antibiótico específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser selecionadas em placas com 
nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de 
plasmídeo podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um grupo pequeno, como um 
ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que todas carregam o mesmo plasmídeo. 
Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso acontece porque, durante uma 
ligação, fragmentos de DNA nem sempre ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, 
devemos coletar o DNA de várias colonias e ver se cada uma contém o plasmídeo certo. Métodos 
como digestão por enzima de restrição e PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos. 
3 - Cultivar lotes de bactérias portadoras de plasmídeo e usá-las como "fábricas" para fazer a proteína. 
Após as células com o plasmídeo recombinante serem identificadas, elas podem crescer em grande escala, 
replicando o fragmento de DNA. Nesse momento, damos às bactérias um sinal químico que as instrui a produzir a 
proteína alvo. As bactérias servem como “mini fábricas”, produzindo grandes quantidades de proteína. 
4 - Colher a proteína das plasmídeo e purifica-la. 
A proteína de interesse é então purificada, separada dos demais conteúdos das células, por exemplo, outras 
proteínas e macromoléculas. Isso garante que não haja nenhuma impureza, restando apenas o produto final, como 
no caso da insulina. 
• APLICAÇÃO DA CLONAGEM DE DNA 
A clonagem molecular possui inúmeras aplicações entre as possibilidades estão o desenvolvimento de proteínas 
recombinantes mais seguras para o tratamento de doenças, o aprimoramento da terapia genética, a produção 
vacinas, insulina, além do uso na agricultura (Plantas com inseticida, caso da Bt).