Engenharia_Genetica

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30/11/2013
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FUNDAMENTOS 
DE 
ENGENHARIA 
GENÉTICA
O que é Engenharia Genética?
• É um conjunto de tecnologias que permitem a 
manipulação (modificação) de material genético 
in vitro
• Também conhecida como “Tecnologia do DNA 
Recombinante”
• Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de 
genes, recombinação de genes, ou DNA de 
diferentes espécies, e transferência de genes de 
uma espécie para outra, contornando o 
processo reprodutivo
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Os “pais” da Engenharia Genética
Herbert Boyer Stanley Cohen Paul Berg
Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que codifica 
uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA → isolar um fragmento específico 
de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor 
capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias 
idênticas 
Primeiras clonagens (1972-73): Paul Berg, Herbert 
Boyer e Stanley Cohen
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Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo
2) Método para juntar 2 moléculas de DNA 
covalentemente (inserto + vetor)
3) Método para introduzir moléculas de DNA na 
célula hospedeira 
4) Método para selecionar células contendo 
moléculas de DNA quimérico ou 
recombinantes
5) Métodos para o screening da característica 
procurada 
As “Ferramentas”
1) Células hospedeiras
2) Enzimas
3) Vetores
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CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Células hospedeiras
Características
• permitir a replicação do vetor
• permitir a seleção do vetor (sensibilidade a 
drogas ou auxotrofia)
• não deve modificar o DNA exógeno 
• não pode representar perigo ao meio ambiente
Podem ser procariotos (Escherichia coli) ou 
eucariotos (leveduras, células vegetais, 
células de insetos e mamíferos em cultura)
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Métodos de introdução do 
DNA na célula hospedeira
• Transformação com cloreto de cálcio (bactérias)
• Transdução (fagos empacotados in vitro)
• Transfecção (células de mamíferos)
• Eletroporação (leveduras e bactérias)
• Biolística ou “biobombardeamento” (plantas)
• Microinjeção (ovos e oócitos)
Gene Gun: bombardeamento de partículas
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Microinjeção
ENZIMAS
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Enzimas de Restrição
• São endonucleases que clivam o DNA em sequências 
específicas chamadas sítio de restrição.
• Quebram a ligação fosfodiéster 
• Os sítios de restrição são, geralmente, sequências 
palindrômicas (mesma sequência nos dois sentidos)
• Aplicações: 
- clivagem do DNA para gerar fragmentos com 
extremidades conhecidas (coesivas ou não) a fim de 
facilitar a clonagem
- Mapeamento de polimorfismo
Descoberta das E.R. (1971)
Werner Arber 
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Produzem extremidades coesivas ou abruptas 
(cegas)
EcoRI 5´-GAATTC-3´ (5´-salientes)
3´-CTTAAG-5´
PstI 5´-CTGCAG-3´ (3´-salientes)
3´-GACGTC-5´
SmaI 5´-CCCGGG-3´
3´-GGGCCC-5´
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Multiple Cloning Site (MCS)
(polilinker)
DNA Ligase
• Promover a união de moléculas de DNA 
pela formação de uma ligação 
fosfodiéster entre uma extremidade 3’-OH 
e outra 5’-PO4
• Aplicações: 
• Ligação entre fragmentos de DNA
• Reparo de “nicks” (cortes) no DNA
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DNA Ligase: ligação de 
fragmentos
DNA Ligase: reparo
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DNA Polimerases
• DNA polimerase DNA-dependente 
• Necessita uma extremidade 3’-OH 
• Direção da síntese 5’→3’
• Aplicações: 
�marcação de DNA para fazer “sondas radioativas” 
(DNA Pol I) 
�PCR (Taq Polimerase)
�Preenchimento de extremidades coesivas 
(fragmento Klenow da DNA Pol I)
Fosfatase Alcalina
• Retira grupos fosfato de extremidade 5’ 
ou 3’
• Transforma 5’-PO4 em 5’-OH 
• Aplicação: defosforilação da extremidade 
5’ do DNA para evitar reanelamento de 
plasmídios
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Transcriptase reversa
• DNA polimerase RNA-dependente
• Atividade polimerásica 5’→3’
• Requer primer
• Aplicação: síntese de cDNA
VETORES
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Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o DNA 
clonado. 
Características que os vetores devem possuir:
� habilidade de se duplicar na célula hospedeira
� marca genética para selecionar a célula 
contendo o vetor (resistência a drogas ou 
marcas auxotróficas)
� sítios de clonagem únicos
� quantidade mínima de sequências não-
essenciais.
Tipos de vetores
• Plasmídios
• Bacteriófagos (fagos)
• Cosmídios
• Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
• Vetores especiais para plantas, células de 
insetos e mamíferos
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Plasmídios
- Moléculas de DNA fita dupla circulares e de 
replicação autônoma (ORI) 
- Têm marcas de seleção para resistência a 
antibióticos ou complementação auxotrófica
- Podem-se clonar fragmentos de até 10 kb
- Clonagem por inativação dos genes de 
resistência a antibióticos (série pBR) ou por 
α-complementação do gene lacZ (série pUC)
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Bacteriófagos
• Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na 
célula hospedeira
Fago λλλλ
- dsDNA circular 
- foram retirados 20 kb do genoma do fago 
necessários para integração/excisão para serem 
substituídos por DNA exógeno e formar um genoma 
de 50 kb que é empacotado in vitro.
- Genomas maiores ou menores não são 
empacotados.
- ciclo lítico compulsório.
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Cosmídios
• São plasmídios contendo as extremidas “cos” do 
fago λ
• Capacidade de clonagem: 40 kb
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Cromossomos artificiais
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Geração de moléculas 
recombinantes
- Clonagem Molecular -
CLONAGEM
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Ligação de extremidades compatíveis
Criando um DNA recombinante
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Transformação Bacteriana
Seleção em placas contendo antibióticos
Clonagem de um 
fragmento de 
DNA exógeno em 
E. coli usando o 
pBR322 como 
vetor
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Clonagem em vetores contendo o gene LacZα
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The b-galactosidase gene is disrupted when another piece of DNA is cloned to disrupt 
it. The substrate "X-gal" turns blue if the gene is intact, ie. makes active enzyme. White 
colonies in X-gal imply the presence of recombinant DNA in the plasmid. 
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Bacteriófago lambda
- genes 
necessários à 
produção de 
fagos
- DNA exógeno de 
um tamanho 
compatível
- Recombinantes 
empacotados em 
partículas de 
fago viáveis
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Seleção
• Seleção: refere-se às condições que permitem que a 
multiplicação das células desejadas ou fagos (contendo
só o vetor ou vetor+inserto) enquanto restringindo
outras células de se multiplicarem. 
• Métodos de seleção típicos incluem: 
� resistência e sensibilidade a antibióticos; 
� requerimentos nutricionais (auxotrofia); 
� formação de placas (fagos). 
“Screening”
• O “screening” permite que todas as células 
cresçam mas evidencia os clones que 
apresentam uma característica desejada. 
Geralmente, esta caracterísitca está associada à 
presença de um inserto no vetor.
• Tipos de “screening”
�Resistência e sensibilidade a antibióticos; 
�Requerimentos nutricionais; 
�Seleção azul-branco (atividade β-galactosidase); 
�Específico (hibridação de ácidos nucleicos ou 
anticorpos). 
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Identificação de 
um clone de 
interesse
- hibridação com sonda radioativa;
- anticorpo específico
Bibliotecas de DNA
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Bibliotecas genômicas e de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o 
material genético de um organismo clonado em um vetor 
(geralmente, um fago)
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma
- têm introns
B) cDNA: - feita a partir de mRNA,
- representa os genes que são transcritos, 
- não têm introns, só as regiões codantes, 5’-
UTRe 3’-UTR de um gene, têm a cauda 
poli(A)
Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo celular 
específico; 
- “primer” de oligo(dT) e 
Transcriptase Reversa;
- DNA Polimerase I e 
dNTPs; 
- Clonagem em um vetor 
de escolha
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Algumas Aplicações da 
Engenharia Genética
� Análise da estrutura/função de genes
� Produção de proteínas de interesse 
industrial e terapêutico
� Engenharia proteica
� Criação de organismos transgênicos
� Terapia gênica
Proteínas Recombinantes
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Sequências de 
DNA de um 
vetor de 
expressão de 
E. coli
Vetores de expressão
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Plantas Transgênicas
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Animais Transgênicos
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Microinjeção de DNA no núcleo de ovo 
fertilizado de camundongo - gene do fator 
de crescimento humano
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Truta transgênica
“Andi”, o primeiro primata transgênico