biocel apoptose (1)

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Apoptose
junior pereira
(ENFERMEIRO)
Apoptose
Apoptosis=grego para ‘falling off’ (Caír, desfazer)
Processo fisiológico de morte celular programada
Processo activo
Inibição deste processo é activa e altamente regulada
Fases:
A Célula Compacta-se
A membrana forma invaginações
A cromatina condensa
O DNA Fragmenta-se
A célula morta divide-se em vesículas membranares (corpos apoptóticos) que são fagocitados
Os processos bioquímicos da apoptose
Proteólise
Fragmentação genómica
Perda de assimetria da membrana celular
Fragmentação celular
www.nih.gov/sigs/Aboutapo.html
Apoptose versus Necrose
Apoptose
Determinada genéticamente
Ocorre dentro dos intervalos fisiológicos
Célula compacata-se
Resulta de diversos passos intrinsecamente regulados
Participa no equilibrio homeostático do organismo
Fenómeno individual celular (suícidio celular)
Nunca ocorre perda de estanquicidade membranar
As vesículas formadas são removidas por fagocitose, num processo muito rápido que não deixa vestígios
Necrose
Determinada genéticamente
Resulta da alteração súbita de um ou mais intervalos fisiológicos (pH, Temperatura, [iónicas], etc)
Citoplasma “incha”
Resulta da inviabilização metabólica da célula
Não tem funções homeostáticas
Fenómeno colectivo a todas as células vizinhas 
Resulta na perda de estanquicidade da membrana
O derramamento do fluido celular inicia processos tecidulares (inflamação) que duram horas ou dias e originam marcas duradouras (cicatrizes)
Controlo da apoptose
A apoptose em condições biológicas é uma resposta celular a variações subtis 
no meio extracelular
Na membrana citoplasmática
No interior da célula
O mesmo estímulo pode desencadear apoptose num tipo de célula, ser inócuo noutro, e desencadear a proliferação noutro
A resposta de um tipo de célula a um dado estímulo pode ser variável pois depende de outros factores celulares (ex:fase de maturação) e ambientais (outros estímulos)
Funções da apoptose
Moldar os tecidos na embriogénese
Eliminar células alteradas (ex. cancro)
Eliminar células que deixaram de ser necessárias (ex. Sistema Imunológico)
Programmed Cell Death
A. Form digits
B. Form lumina
C. Vestigal structure
D. Mullerian/Wolffian
E. Cull extras (neurons)*
F. Cull immune system* 
G. Cull damaged cells*
*focus of many studies 
Anomalias da apoptose
Malformações congénitas
Doenças Neurodegenerativas
Disfunções imunológicas
Tumores
Apoptose em patologias
Cancro
Inibição da apoptose 
HPV inactiva o promotor do p53
EBV aumenta a produção de bcl-2
Algumas Leucemias B expressam níveis elevados de bcl-2
Melanoma inibe a expressão de Apaf-1
Alguns tipos de cancros do pulmão e do colon secretam uma proteína que bloqueia o FasL
Alguns tipos de tumores expressam níveis elevados de FasL induzindo apoptose nas CTL que com elas interactuam
Doenças Auto-imunes
Defeitos na indução de apoptose 
Defeitos na selecção celular
Dificuldade em desligar as respostas imunológicas
Imunodeficiências
Excesso de apoptose
Deficiências na selecção positiva
Regulação da apoptose
Estudos em Caedorhabditis elegans permitiram identificar 4 grupos de genes:
Responsáveis por desencadear a apoptose
Genes envolvidos no processo apoptótico
Genes necessários para a fagocitose dos corpos apoptóticos
Genes necessários para a dissolução final dos corpos fagocitados
detonação
apoptose
fagocitose
dissolução
bloqueio
Ced-9
Egl-1, ces-1, ces-2
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
Ced-1,ced-2,ced-5, 
ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
Apoptose em mamíferos
detonação
apoptose
fagocitose
dissolução
bloqueio
Ced-9 
Egl-1, ces-1, ces-2
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
Ced-1,ced-2,ced-5, 
ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
A Família bcl-2
BH= bcl-2 homology domain
Ancoragem 
à membrana
Ligação a 
proteínas
de outras 
famílias
Promoção da apoptose
Na ausência de 
BH1 e BH2
Three subfamilies
Bcl-2 (survival, 4BH)
Bax (apoptosis, 3BH)
BH3 only (apoptosis)
Formação de 
homo/hetero-dimeros
Apoptose mediada por sinais internos à célula
A membrana da mitocondria contém bcl-2 ligado a Apaf-1
Dano interno provoca:
Dissociação entre o bcl-2 e Apaf-1
Saída de cyt-c para o citoplasma
O cyt-c e o Apaf ligam-se a caspase-9 formando o apoptosoma (com ATP)
Os apoptosomas agregam, a caspase-9 inicia uma cascata de activação de caspases por proteólise
Degradação de proteínas estruturais do citosol
Degradação do DNA nuclear
www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
Apoptose mediana por sinais externos à célula
Fas e o receptor do TNF são proteínas de membrana constitucionais
A ligação de FasL e TNF induz:
Activação de caspase 8
Inicia a cascata de activação de caspases
Degradação de proteínas estruturantes
Degradação do DNA nuclear
www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
Apoptotic Pathways
Extrinsic pathway the death machinery is triggered by death ligands interacting with DRs to activate initiator caspases. Intrinsic pathway centers on mitochondria which release cyto-c into the cytosol activating caspase cascade.
The extrinsic and intrinsic death pathways can operate singly but crosstalk between the pathways occurs at many levels.
Cyto-c binds Apaf-1 in turn binds to procaspase-9 and activates it and the cascade.
Smac/DIABLO released from mitochondria can bind to IAPs overcoming their inhibition on various caspases. 
The extrinsic and intrinsic death pathways are linked by the cleavage of Bid by caspase-8.
Cleaved Bid translocates to mitochondria and induces Bax/Bak-dependent release of mitochondrial proteins.
Death Receptors
Modular Structures
CRD=cysteine rich extracellular domain
DD=cytoplasmic death domain
Adapters/FADD,etc
contain DDs to interact with receptors and transmit apoptotic signal to machinery Receptors have unique features to recognize ligand with specificity
TNFR1/TNF-α, lymphotoxin alpha
Fas (CD95)/FasL, DAXX
DR3 & DR4/TRAIL
Not Death Receptors
Other TNF members, B & T cell antigens, lack DDs
Executioners of Apoptosis
Caspases: A Common Pathway
Caspases are proteases involved in 2 stages of the apoptotic pathway
Caspases are synthesized as inactive procaspases that are activated by cleavage to form the active dimer
A complex forms at the receptor that activates caspase-8 to ‘initiate’ the pathway
Caspase Activation
Synthesized as single chain precursor
Cleavage site at conserved Asp-297
N-peptide contains death-effector domain required to recruit the death receptors (DRs) to the cytosolic face
Caspase Family Members
Structural features
CARD (caspase recruitment domain
DED (death effector domains) for adaptors
Caspase cleavage
Site separates subunits
Substrate cleavage
caspase cleaves motifs (P1-P4 )in substrates
Pro-apoptotic regulators promote caspase activation
Figure 23-50
Some trophic factors prevent apoptosis by inducing inactivation of a pro-apoptotic regulator
Figure 23-50
Death Machinery
Initiators of cascade caspases-1,-8, -9, -10
Effectors of cascade caspases-2, -3, -6, -7
Proteins cleaved during execution phase of apoptosis (eg, PARP, lamin A) for irreversible cell death decision
Caspase	 Substrates		Cleavage motif
Caspase-1	 pro-IL-1beta	YVHD-A
Caspase-3	 PARP		DEVD-G*
		 DNA-PK		DEVD-N
		 Rb			DEAD-G
Caspase-8	 all other pro-caspases
Caspase-9	 PARP		DEVD-G*
		 procaspase-3	DEVD-G*
Cysteine Aspartate-specific Proteases
Caspase Inhibitors
Defining motif BIR= baculovirus IAP repeat
Multiple BIR domains
CARD for caspase recruitment domain
RING domain homolog of ubiquitin E3 adaptors
Caspase Inhibitors
IAPs (inhibitors of apoptosis)
BIR motif necessary/sufficient for anti-apoptotic activity
XIAP, cIAP1, cIAP2 inhibit processing of procaspases-3, 6, 7 by inhibiting cytochrome-c induced activation of caspase-9
FLIPS (FLICE inhibitory proteins)
Contain 2 death effector domains (DEDS) 
DEDs interfere with FADD/caspase-8
interaction and activation
Block early events of other death receptors (TNFR1,TRAIL/DR4)
Peptide inhibitors
Synthetic peptide sequences based on substrate binding pocket motif in positions P1-P4 (Ac-YVAD-cho, c-DEVD-cho)
Apoptotic Pathways Converge:
Role of Bcl-2 Family
Extrinsic Pathway:
Ligation of receptors
Adaptor recruitment
Activation of caspase-8
Transmit death signal
Intrinsic Pathway:
Cellular stress (x-ray/drug)
Mitochondria integrator
Bcl-2 family regulators
Activation of caspase-9
The Bcl-2 Family Mechanism of Action
Bcl-2/Bcl-XL/Apaf-1
BH4 of Bcl-2 & Bcl-XL bind to C-term of Apaf-1 inhibiting binding to Casp-9 
Bcl-2 and cyto-c
Bcl-2 directly or indirectly prevents release of cyto-c from mitochondria
Bid of BH3 family mediates release of cyto-c c/o PT
Bax death pathway
BH1 and BH2 form pores
Death caspase independent
Summary of Bcl-2 Family Roles 
Mitochondrial dysfunction
Many apoptotic stimuli use mitochondrial dysfuntion to signal apoptosis (intrinsic cues)
Steroids
Drugs (DNA damage)
Irradiation (redox imbal)
Loss of growth factors
Ceramide generation
Distinct ‘BH3 only’ proteins respond to specific death stimuli
Activated BH3 proteins translocate to mitochondrial surfaces to associate with Bcl-2 related proteins to form membrane-spanning pores
Cytochrome c release induces formation of the apoptosome, a ternary complex of cyto-c, Apaf-1 and caspase-9
Apoptosis disrupts mitochondrial membrane potential
PT (permeability transition)
Mitochondrial Permeability Transition
Effectors of PT
Divalent cations Ca2+
ROS and nitric oxide
Conc of some peptides (transport signal sequens)
Lipid mediators
Any major change in energy balance (ATP, NAD) or redox state
PT functions to integrate stress responses and any major damage of cells will trigger PT.
PT itself causes change in energy and redox balance, when massive, can lock the cell into irreversible stage.
Permeability Transition Pore 
Bcl-2 family members control PTP channel
Bcl-2 proteins in membrane of mitochondria
PTP a large pore induced by necrotic or apoptotic signals
OM, outer membrane
IM, inner membrane
IMS, inner membrane space
PT is achieved by H+ ion gradient generated by electron transport. 
The H+ gradient is used by the FoF1 synthase to synthesize ATP.
Opening of PTP results in mitochondrial depolarization, uncoupling of oxidat phosphorylation and swelling of mitochondria
Direct association between Bax and ANT or Bax and VDAC have been proposed
 Role of Mitochondria in Apoptosis
Releases pro-apoptotic molecules into cytosol upon death stimuli
Apoptosome is formed (Cyto-c,Apaf-1, casp-9)
Opening of PTP can release procasp-2 or -9
Bcl-2 (tethering protein) can regulate activation of mitochondrial pool
Summary of the Players
Death Pathways 
Triggering stimuli
Caspases
Bcl-2 family
Mitochondria
Death by apoptosis vs necrosis
Oncologia
CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
A origem genética dos tumores	
Proto-oncogenes e oncogenes	
Factores de crescimento	
Receptores para factores de crescimento
Transdutores intracelulares de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo celular
Genes de Supressão tumoral	
Os carcinogénios como mutagénios	
Agentes virais na origem dos tumores	
Oncogenes virais	
Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes
Activação de proto-oncogenes	
Amplificação de proto-oncogene	
A "estatística" na origem dos tumores
Proto-oncogenes e Oncogenes
Proto-oncogenes
Genes normais que depois de alterados por mutação originam um fenótipo tumoral
Fazem parte do património genético de todos
Oncogenes
Gene resultante da alteração de um proto-oncogene, e que causa um fenótipo tumoral
Fazem parte do património genético das células transformadas
Receptores para factores de crescimento
A GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA
CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
A origem genética dos tumores	
Proto-oncogenes e oncogenes	
Factores de crescimento	
Receptores para factores de crescimento
Transdutores intracelulares de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo celular
Genes de Supressão tumoral	
Os carcinogénios como mutagénios	
Agentes virais na origem dos tumores	
Oncogenes virais	
Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes
Activação de proto-oncogenes	
Amplificação de proto-oncogene	
A "estatística" na origem dos tumores
ANOMALIAS GENÉTICAS EM HEMATO-ONCOLOGIA
Translocações cromossómicas em hemato-oncologia
Translocações envolvendo genes das Ig ou TCR
translocação t(8;14)(q24;q32) e o EBV
A t(14;18) - BCL2/IgH	
Translocações que originam genes hibridos
t(9;22) - bcr/abl	
t(15;17) - pml/rar	
Delecções cromossómicas em hemato-oncologia
Mutações pontuais em hemato-oncologia
mutações no gene p53	
UTILIDADE CLÍNICA DA GENÉTICA MOLECULAR EM HEMATO-ONCOLOGIA
Aprofundamento de conhecimentos	
Escolha de tratamentos específicos	
Monitorização da doença
Transdutores intracelulares de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo celular (ciclinas)
O ciclo celular é controlado por ciclinas (cdk), p53 e RB (entre outros factores)
Permite uma sincronia entre o crescimento, duplicação de DNA e divisão nuclear
Alterações nos genes das ciclinas podem originar fenótipo tumoral se:
Ocorrer alteração da expressão de uma ou mais ciclinas
se ocorrem mutações nas sequências codificantes dos genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o RB
Genes de supressão tumoral
Genes que suprimem o desenvolvimento de tumores
Mutações germinais associadas com predisposição tumoral
Fenótipo dominante, mas recessivo ao nível celular (a >parte)
O fenótipo depende da inactivação da cópia normal do gene (ex. Retinoblastoma-gene RB, um regulador do ciclo celular)
Fenótipo dominante (casos raros)
O p53 é um estimulador da apoptose que funciona como tetrâmero. Uma diminuição da concentração causada por uma mutação heterózigótica inibe a formação de tetrâmeros, causando um fenótipo dominante.
Os carcinogéneos como mutagéneos
Os mutagéneos são substâncias capazes de se interagirem com os ácidos nucleicos, modificnado-lhes propriedades
Se as alterações genéticas resultantes ocorrerem em proto-oncogenes, genes de factores de crescimento, ou genes de supressão tumoral, o genótipo resultante pode ser tumoral
Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes virais
Oncogenes virais
Activação e amplificação de proto-oncogenes
Translocações envolvendo os genes TCR e Ig
Linfoma de burkit 
t(8;14) - t(8;22) - t(8;2)
Origina a expressão do c-myc nos linfócitos B
Linfomas foliculares e difusos
Diagrama mostrando os cromossomas 14 e 18 normais, e os cromossomas resultantes da translocação t(14;18)(q32;q21), envolvendo os genes BCL-2 (18q21) e IgH (14q32). 
Genes hibridos resultantes de translocções
Bcr/abl
Os genes BCR e ABL normais, e as translocações que originam as proteínas p190 e p210 do gene quimera BCR-ABL. 
A proteína p210 é característica da CML, sendo a p190 a proteína BCR-ABL encontrada na maioria dos casos de ALL
pml/rar
A localização cromossómica e estrutura normal dos genes PML e RARa, e a translocação t(15;17)(q22;21) que origina o gene quimera PML-RARA.