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* * Métodos de estudo das células Células in vivo 3 * * Questionário: Quais os três Domínios e os seis Reinos da Árvore da Vida ? Desenhe a trajetória da luz no microscópio óptico indicando os componentes deste. Objetivos: Vivenciar o mundo das células e entender sua escala espacial e temporal. Conhecer o poder de amplificação e o funcionamento básico do microscópio óptico. Ambientar-se ao uso do microscópio óptico (aula prática). Descrever o que você observou nesta aula. Célula in vivo 3 * * Objetivos: Conhecer os principais métodos de estudo das células. Perceber que diferentes métodos são elaborados para observar a natureza em suas distintas escalas espaço-temporais. Questionário: O que é Ciência? O que é Tecnologia? O que é Biologia? Quais os dois modos de se aplicar o método científico? Descreva seis métodos de estudo em biologia celular. Escolha três métodos que abordem o aspecto morfológico e três que abordem o aspecto fisiológico, sendo que dois métodos acessem o nível das moléculas, dois o nível das organelas e os outros dois o nível das células. Métodos de estudo das células 3 * * 1 * * Célula in vivo * * AULA 03 - Pontos principais da parte 1: Escala da célula. A maioria das células é menor que o limite de resolução do olho humano, que é de 0,2mm. Para se enxergar objetos menores que 0,2mm usam-se lupas estereoscópicas e microscópios. Os dois tipos mais comuns de microscópios são: Microscópio óptico : utiliza os comprimentos de onda da faixa da luz visível do espectro eletromagnético para ampliar a imagem do objeto ´(escala celular). Microscópio eletrônico: utiliza o comprimento de onda do elétron para ampliar a imagem do objeto (escala subcelular). Tamanho relativo das células e seus componentes: Palma da mão 200mm = 20 cm = 0,2m Largura do dedo 20mm = 2cm Pedacinho da digital 2mm Porção da epiderme 0,2mm = 200mm Célula da epiderme 20mm Mitocôndria 2mm Polissomos 0,2mm = 200nm Ribossomo 20nm Domínio de uma proteína 2nm Átomos 0,2nm = 2A * * Limite de resolução = 0,2 mm * * Resolução e comprimento de onda Resolução : Comprimento de onda Abertura numérica Índice de refração do meio Limite de resolução do microscópio óptico: Aproximadamente 0,15 milímetros = 1,5mm (2 minutos de arco) Semelhante à resolução do olho humano (5mm entre os elementos visuais da retina) * * * As dimensões das células e de seus componentes * * * * * * * * caminhão (procariotos e organelas) Esta sala de aula gato (macromoléculas) bolinha de gude (moléculas simples) átomos navio (célula eucariótica) FUP * * cordilheiras (órgãos e sistemas) continente (organismo multicelular) paisagem local (tecidos) navio (célula eucariótica) * * 2 * * AULA 03 - Pontos principais da parte 2: Microscopia e aula prática. A maioria das células é menor que o limite de resolução do olho humano, que é de 0,2mm. Para se enxergar objetos menores que 0,2mm usam-se lupas estereoscópicas e microscópios. Os microscópios surgem no século XV (1650) e esta tecnologia progride com o tempo. Os dois tipos mais comuns de microscópios são: Microscópio óptico : utiliza os comprimentos de onda da faixa da luz visível do espectro eletromagnético para ampliar a imagem do objeto. Microscópio eletrônico: utiliza o comprimento de onda do elétron para ampliar a imagem do objeto. Microscópio eletrônico de transmissão, onde os elétrons são transmitidos através do material. Microscópio eletrônico de varredura, onde os elétrons “varrem” (escaneiam) o material. Componentes principais do microscópio óptico : Sistema de iluminação Lente condensadora da luz e diafragma Charriot ou platina (anteparo para apoio da lâmina com o material) Lentes Objetivas Parafuso micrométrico (ajuste fino do foco) Parafuso macrométrico (ajuste grosso do foco) Tubo do microscópio Lente ocular Os componentes principais do microscópio eletrônico : de transmissão de varredura Canhão de elétrons Canhão de elétrons Lente condensadora Lente condensadora Objeto Bobina de varredura Lente objetiva Lente objetiva Lente objetiva Objeto Lente projetora Detector Tela fosforescente Computador Monitor A partir de suas observações descreva as imagens que lhe sugerem algum motivo para estes serezinhos microscópicos estarem vivos. * * Microscópio primitivo porta-espécimen lente parafuso regulador do foco parafuso regulador da altura do material * * Microscópio óptico Lente ocular Parafuso macrométrico (ajuste grosso do foco) Parafuso micrométrico (ajuste fino do foco) Lentes Objetivas Charriot ou platina anteparo para apoio da lâmina com o material Lente condensadora da luz e diafragma Sistema de iluminação Tubo do microscópio Estrutura básica * * Composição do Microscópio óptico * * 4 Planos de Campo: foco da imagem. 4 Planos de Abertura: foco da iluminação. Planos conjugados no Microscópio óptico * * Microscópio Eletrônico de Transmissão Microscópio Eletrônico de Varredura * * * * * * * * * * * * * * * * 3 * * Métodos de estudo das células * * AULA 03 - Pontos principais da parte 3: Ciência e método científico. Epistemologia é o ramo da filosofia que estuda a natureza do conhecimento. Existem quatro espécies de conhecimento: a sensação conhece as coisas sensíveis; a opinião, conhece as coisas conjecturais; a ciência, conhece as coisas cognoscíveis; a razão, conhece as coisas inteligíveis. Ciência é: a identificação, a descrição, a investigação experimental, e a explanação teórica de um fenômeno. O método científico é uma espiral de conhecimento que se origina com perguntas; onde se formulam hipóteses; realizam-se observações comparativas e/ou experimentações de manipulação; onde se tecem conclusões; documenta-se e/ou expõe-se as descobertas e invenções; de onde se originam novas perguntas... Tecnologia é o conjunto de conhecimentos e princípios científicos que se aplicam a uma atividade. Os métodos de pesquisa podem utilizar a observação comparativa ou a manipulação experimental, (in vitro /in situ), (in vivo /pos-mortem) cada qual adequada à uma faixa da escala espacial e da escala temporal. As escalas espaciais mais estudadas na biologia celular são: a escala molecular e a escala celular. As escalas temporais mais estudadas na biologia celular são: o metabolismo, o ciclo celular e a evolução. Principais metodologias de pesquisa em biologia celular. Observação comparativa. Imageamento e Microscopia. Cultura de células e de tecidos. Fracionamento celular e molecular. Marcadores celulares e moleculares. Técnicas moleculares. Pesquise em casa sobre algumas metodologias de pesquisa nas seis categorias listadas acima. Tipos de métodos científicos: Método dedutivo (Descartes, Spinoza, Leibniz): O método dedutivo parte do geral para chegar ao particular. Método indutivo (Bacon, Hobbes, Locke, Hume): O método indutivo parte do particular para chegar ao geral. Método hipotético-dedutivo (Karl Popper): baseado no falseamento de hipóteses e não na sua confirmação. Pois o salto indutivo de "alguns" para "todos" exigiria que a observação de fatos isolados atingisse o infinito. Método dialético (Platão, Hegel, Marx, Engels): a lógica e a história da humanidade seguem uma trajetória dialética, nas quais as contradições se transcendem, originando novas contradições que passam a requerer solução. Método fenomenológico (Edmund Husserl): o mundo é criado pela consciência, e portanto, não é uma única realidade. * * 540 a.C. Pitágoras de Samos. Existem quatro espécies de conhecimento: a sensação conhece as coisas sensíveis; a opinião, conhece as coisas conjecturais; a ciência, conhece as coisas cognoscíveis; a razão, conhece as coisas inteligíveis. Eis porque é preciso que o pensamento se eleve das coisas sensíveis às coisas conjecturais, das coisas conjecturais às coisas cognoscíveis, das coisas cognoscíveis às coisas inteligíveis; e aquele que quer conhecer a verdade sobre esses objetos, deve reunir num conjunto harmonioso todos esses meios e os objetos do conhecimento. A sabedoria não tem por objetivo um ser qualquer determinado, mas absolutamente todos os seres, e é mister que ela se inicie, não pela busca dos princípios de um ser individual, mas sim pelos princípios comuns a todos os seres. A Crença ou opinião (doxa) é um ponto de vista subjetivo. O Conhecimento (epistéme) é a crença verdadeira e justificada. Tipos de episteme * * Quem? Como? Quando? Para quê? Por quê? Onde? Quanto? O que é Ciência ? É a identificação, a descrição, a investigação experimental e a explanação teórica de um fenômeno O que? Qual? Para quem? Será? * * Método empírico Perguntas: definição do problema Hipótese Observações Teste de hipóteses realização de experimentos Novos experimentos análise dos dados As observações e/ou os experimentos suportam a hipótese ? Não Sim Falhas nos experimentos ? Documentação e exposição dos resultados Elaboração das conclusões * * O que é Tecnologia? Conjunto de conhecimentos e princípios científicos que se aplicam a um ramo de atividade. A tecnologia se desenvolve e evolui. 1900 Microscope 1680 Microscope Model G Microscope Eclipse E200 Microscope Eclipse E800 Microscope 1650 1900 1950 1990 * * Método comparativo Método experimental In vivo In vitro * * Resolução Espacial x Temporal Molécula Modelagem Microscopia Óptica Corantes ópticos Registro unitário Patch clamp EMT Biologia molecular, biofísica e bioquímica Microscopia Eletrônica 2-deoxiglucose PET Lesões Microlesões Ressonância magnética funcional EMT = estimulação magnética transcraniana Eletroencefalografia Potencial sensoria evocado Sinapse Dendrito Neurônio Camada Coluna Área (mapa) Cérebro Sociedade População milessegundos segundos minutos horas dias anos meses Psicofísica Registro multiunitário * * engenharia genética. Escala Molecular Biologia molecular Biofísica Bioquímica. * * Escala Celular Microscopia (eletrônica e óptica) e eletrofisiologia (Patch clamp e registro unitário). * * Imageamento e Microscopia Marcadores celulares e moleculares Cultura de células e de tecidos Técnicas moleculares Fracionamento celular e molecular Microscopia óptica Microscopia eletrônica Difração de raios x Manipulação do meio de cultivo Células híbridas Linhagens celulares Ultracentrifugação Extratos celulares Eletroforese Cromatrografia Seqüenciamento de proteinas Imunocitoquímica Espectroscopia Citoquímica Autoradiografia Marcadores fluorescentes Dissociação de células mecânica química anticorpos fluorescência DNA recombinante Seqüenciamento de ácidos nucléicos PCR Hibridização de ácidos nucléicos Clonagem Terapia gênica DNA fingerprint Microarranjo de DNA Microdissecção Diálise Micro-injeções Corantes, Genes Fármacos Campo escuro Contraste de fase Contraste Interferencial Luz polarizada Fluorescência Confocal Multi-fóton Imageamento óptico Tomografia Ressonância magnética Transmissão Varredura Força atômica Pinça óptica Eletrofisiologia Registro unitário Registro multiunitario Patch clamp (também in vivo) Microbalística Carbocianinas genes in vivo – in vitro – in situ – pos mortem Rastreadores neuronais Observação comparativa Comportamento Modelagem Morfofisiologia Eletroencefalografia Desenvolvimento Principais abordagens de estudo: * * 4 * * AULA 03 - Pontos principais da parte 4: Métodos em biologia celular Principais metodologias de pesquisa em biologia celular. Observação comparativa. Imageamento e Microscopia. Cultura de células e de tecidos. Fracionamento celular e molecular. Marcadores celulares e moleculares. Técnicas moleculares. Pesquise em casa sobre algumas metodologias de pesquisa nas seis categorias listadas acima. * * Imageamento e Microscopia Comparação Marcadores celulares * * Carbocianinas: rastreadores fluorescentes lipossolúveis Anel benzênico DiI = Perclorato de 1´,1-dioctadecil-,3,3,3´, 3´-tetrametilindocarbocianina Neurônio * * * * * * 250mm * * * * Cultura de células e de tecidos Marcadores moleculares * * Co-culturas e Culturas organotípicas Culturas de células Fusão celular Material para cultura de células e tecidos Cultura de células e tecidos Manipulação do meio de cultura * * Micro-injeções e eletrofisiologia * * Anticorpos secundários conjugados Anticorpos monoclonais * * ELISA * * Fracionamento celular e molecular * * Microdissecção Fracionamento por atividade enzimática Dissociação Fracionamento por fluorescência (FACs) * * Ultracentrifugação * * Gel de filtração Afinidade Carga Cromatografia * * Eletroforese Westren blot (proteínas) Southern e northern blot (DNA e RNA) * * Espectroscopia * * Técnicas moleculares * * DNA recombinante * * PCR * * Transfecção In molecular biology, transformation is the genetic alteration of a cell resulting from the uptake and expression of foreign genetic material (DNA). Separate terms are used for genetic alterations resulting from introduction of DNA by viruses ("transduction") or by cell-cell contact between bacteria ("conjugation"). Transformation of animal cells is usually called transfection. * * Transgênicos * * Clonagem Células tronco * * * * Método dedutivo (Descartes, Spinoza, Leibniz). O método dedutivo parte do geral para chegar ao particular. Parte de princípios reconhecidos como verdadeiros e indiscutíveis e possibilita chegar a conclusões pelo uso da lógica. O protótipo do raciocínio dedutivo é o silogismo: uma construção lógica que, a partir de premissas, retira uma conclusão lógica: Todo homem é mortal. (premissa maior). Pedro é homem. (premissa menor). Logo, Pedro é mortal. (conclusão) Método indutivo (Bacon, Hobbes, Locke, Hume). O método indutivo parte do particular para chegar ao geral. A generalização parte da observação de casos concretos confirmadores dessa realidade. O raciocínio indutivo parte da observação de fatos ou fenômenos cujas causas se deseja conhecer. Comparando-os, descobre-se as relações existentes entre eles, procedendo-se a generalização baseada nas relações descobertas: João é mortal. Benedito é mortal. Zózimo é mortal. João, Benedito,... e Zózimo são homens. Logo, (todos) os homens são mortais. Método hipotético-dedutivo (Karl Popper). O método hipotético-dedutivo foi definido por a partir de criticas à indução, pois o salto indutivo de "alguns" para "todos" exigiria que a observação de fatos isolados atingisse o infinito. Método dialético (Platão, Hegel, Marx, Engels). Para Hegel, a lógica e a história da humanidade seguem uma trajetória dialética, nas quais as contradições se transcendem, originando novas contradições que passam a requerer solução. Trata-se de uma concepção de natureza idealista, admitindo a hegemonia das idéias sobre a matéria. Estabelece que os fatos sociais não podem ser entendidos quando considerados isoladamente, abstraídos de suas influências políticas, econômicas, culturais etc. Para Karl Marx e Friedrich Engels, a dialética é de natureza materialista, pois admitem a hegemonia da matéria sobre às idéias. Fundamenta em três princípios: a) A unidade dos opostos. Os objetos e fenômenos apresentam aspectos contraditórios, fonte do desenvolvimento da realidade. b) Quantidade e qualidade. Os objetos e fenômenos possuem quantidade e qualidade, características estas inter-relacionadas. c) Negação da negação. A segunda negação conduz a um desenvolvimento e não a um retorno ao que era antes. Método fenomenológico (Edmund Husserl) O método fenomenológico ressalta a idéia de que o mundo é criado pela consciência. Não há uma única realidade, mas tantas quantas forem suas interpretações e comunicações. * * A definição do método científico de Popper difere da versão de Bacon de empirismo por sua ênfase na eliminação em vez da ênfase na verificação. Sir Francis Bacon (1561-1626) * * O método científico consiste dos seguintes aspectos: Observação - Uma observação pode ser simples, isto é, feita a olho nu, ou pode exigir a utilização de instrumentos apropriados. Descrição - O experimento precisa ser replicável (capaz de ser reproduzido). Previsão - As hipóteses precisam ser válidas para observações feitas no passado, no presente e no futuro. Controle - Experiência controlada é aquela que é realizada com técnicas que permitem descartar as variáveis passíveis de mascarar o resultado. Falseabilidade - Toda hipótese deve ser refutável. Mesmo que haja um consenso sobre uma hipótese ou teoria, é necessário que se mantenha a possibilidade de se refutá-la. Se novas observações refutam uma teoria, ela deve ser abandonada e novas hipóteses levantadas que expliquem todas as observações. Explicação das Causas - Na maioria das áreas da Ciência é necessário que haja causalidade. Nessas condições os seguintes requerimentos são vistos como importantes no entendimento científico: Identificação das causas Correlação dos eventos - As causas precisam se correlacionar com as observações. Ordem dos eventos - As causas precisam preceder no tempo os efeitos observados. O método científico é composto dos seguintes elementos: Caracterização - Quantificações, observações e medidas. Hipóteses - Explicações hipotéticas das observações e medidas. Previsões - Deduções lógicas das hipóteses. Experimentos - Testes dos três elementos acima. * * * * * * * *
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