Breve histórico de vacinas atenuadas

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Estima-se que cerca de 80% dos pacientes com DMD poderiam se beneficiar de estratégias de exon-skipping que passassem por mutações em regiões não essenciais do gene e restaurassem parcialmente a expressão de distrofina.
Mostrado na Fig. 1A representa a estratégia segundo a qual CRISPR / cas9 mediada por NHEJ pode criar deleções genómicas internos para ignorar o cod de terminao prematuro no ex 23 responsável pelo fenótipo distrófica de ratinhos mdx, potencialmente permitindo a reconstituição da grelha de leitura aberta DMD. Em princípio, esta abordagem poderia ser aplicada a muitas mutações dentro do gene, incluindo grandes deleções, duplicações e pseudoexons. Uma vantagem desta abordagem é que não requer uma correcção precisa da mutação causadora da doença. Em vez disso, deleções imprecisas que impedem a união de exões mutantes são suficientes para restaurar a expressão da proteína distrofina.
Em ratinhos mdx-DEx23, os níveis de creatina cinase do soro (uma medida da permeabilidade da membrana muscular) e pega-força ambos os testes mostraram restauração da função do músculo (Fig. S4, B e C). Ratinhos mdx de controlo sem tratamento (-) andmdx ratinhos com Myoediting (+) foram testados para potenciais efeitos fora do alvo de Myoediting com sgRNA-R3 (fig S5.). Dez potenciais locais fora do alvo do genoma (OT-01 toOT-10) foram preditos pela ferramenta de desenho CRISPR.
Apenas o local alvo Dmd R3 de ratinhos mdx de Moedeiro apresentou bandas de clivagem no ensaio T7 de endonuclease I (T7E1), e não foram detectados efeitos fora do alvo nos 10 locais potenciais fora do alvo (figura S5). Para aplicar Myoediting aos tecidos musculares pós-natais, usamos AAV9, que exibe tropismo no músculo cardíaco e esquelético, para fornecer Cas9 e sgRNAs aos músculos de camundongos. Os ARN de guia AAV foram gerados por clonagem de sgRNA-mdx e sgRNA-R3 em vector AAV-sgRNA contendo um promotor humanU6 e proteína fluorescente verde (GFP) (Fig. 1B). Gera-se AAV-Cas9 utilizando um vector AAV-Cas9 único (miniCMV-Cas9-short-PolyA), que utiliza uma sequência promotora / potenciadora "mini" -CMV para conduzir a expressão do Streptococcus pyogenes Cas9 humanizado (SpCas9). Diferentes modos de distribuição de AAV9 e variações no tempo de expressão foram sistematicamente comparados para identificar o método óptimo para Dmd Myoediting em ratinhos mdx pós-natal: (i) intramuscular (IM) em P12, (ii) retro orbital (RO) em P18 e (Iii) intraperitoneal (IP) em P1 (ver materiais suplementares) ilustrado na Fig. 1C.
Após a injecção IM de ratinhos P12 com AAVs, os tecidos musculares foram analisados ​​por imuno-tintura para expressão da distrofina 3 semanas mais tarde (Figura 1D e figura S6A). A GFP nativa identificou a expressão de genes mediada por AAV em miofibras. O músculo esquelético dos ratinhos injectados com IM-AAV apresentou um padrão de mosaico de fibras positivas à distrofina (Fig. 1D). A percentagem de miofibras positivas para distrofina foi calculada como uma fracção das fibras estimadas totais. No rato mdx ilustrado na Fig. 1D, 7,7 ± 3,1% das miofibras no músculo tibial anterior (TA) expressaram distrofina 3 semanas após a injeção IM-AAV (todos os erros relatados são SD). O resgate aumentou para uma estimativa de 25,5 ± 0,9% das miofibras por 6 semanas após a injecção IM-AAV (ratinhos threemale mdx por grupo) (figura S6A). Hematoxilina e eosina (H & E) coloração de músculo mostrou que histopathologic marcadores de distrofia muscular, como as miofibras necróticas, foram diminuídos no músculo TA 6 semanas após a entrega de AAV. A invasão de células inflamatórias e os núcleos de miofibra centralizados foram mínimos, em marcado contraste com o controle não injetado mdx TA (Figura S6B).