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CITOESQUELETO: Microtúbulos, Filamentos de Actina e Filamentos intermediários Profa. Sandra Moura Aspectos Gerais Proteínas citosólicas que formam o citoesqueleto� divisão celular, trânsito intracelular, resistência mecânica e organização espacial, movimentação celular Filamentos intermediários, Filamentos de Actina e Microtúbulos Fibras semelhantes a cabos: 10 nmFormado pela proteína tubulina: cilindros ocos� 25 nm microfilamentos� polímeros helicoidais dupla fita de proteína actina� 5-9 nm Família heterogênia de proteínas� força mecânica e resistênciaCentro organizador de microtúbulos: centrossomo� determinam a posição das organelas e transporte intracelular Maior concentração no córtex celular� forma da superfície e movimentação celular Filamentos IntermediáriosMicrotúbulos Filamentos de Actina Aspectos Gerais FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS MICROTÚBULOS REDE MICROTRABECULAR ACTINA FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS � Constituído por heterodímeros de α e β tubulina � Estas proteínas se polimerizam para formar o microtúbulo � Parede constituída por 13 subunidades (protofilamentos paralelos) Rigidez, forma celular; regula movimentos intracelulares de organelas e vesículas; proporciona a movimentação de cílios e flagelos Qual a função dos Microtúbulos? � Monômero de α-tubulina: ligado ao GTP� não pode ser hidrolisado � Monômero de β-tubulina� pode se ligar ao GDP ou GTP GTP GTP/GDP ββββ-tubulina αααα-tubulina ligações laterais entre a mesma subunidade: α-α; β-β � Parede constituída por 13 subunidades (protofilamentos paralelos) forte energia de ligação entre as subunidades α-β Extremidade + � região mais dinâmica: crescimento e dissociação ocorre mais rápido � Localizadas no citoplasma e prolongamentos celulares (cílios e flagelos) Microtúbulos de células da retina. 80.000x Cílios do epitélio respiratório. N: núcleo, M: precursor de muco. HE Microtúbulos precursor de muco. HE Microscopia confocal: células embrionárias- anti-tubulina (verde) Microtúbulos MICROTÚBULOS: responsável pela formação do fuso mitótico (cortes longitudinal e transversal) Microtúbulo Cabeça globular: domínio motor E x t r e m i d a d e ( − − − − ) E x tre m id a d e (+ ) Microtúbulos Microtúbulos: direcionam o transporte vesicular intracitoplasmático: Cinesinas x Dineínas DINEÍNA CINESINA domínio motor E x t r e m i d a d e Cadeias leves e intermediárias Cauda Cadeia leve E x tre m id a d e MICROTÚBULOS: via de transporte intracelular Microtúbulos � Movimento bidirecional regulado pela Cinesina e Dineína Formação de Polímeros: Microtúbulos � Microtúbulos em crescimento� subunidade de GTP na extremidade (capa de GTP): proteção hidrólise de GTP>adição de microtúbulos� encurtamentomicrotúbulos� encurtamento inserção de subunidades com GTP suficientes no microtúbulo em encurtamento� formação de nova capa de GTP � crescimento � Hidrólise do GTP após a polimerização� modificação da conformação � encurtamento Adição de subunidades de tubulina com GTP a extremidade do protofilamento� crescimento Formação de Polímeros: Microtúbulos subunidades ββββ ligadas ao GTP Proteínas que se ligam lateralmente aos microtúbulos são denominadas de Proteínas de Associação a Microtúbulos (MAPs) Diferentes Proteínas se Ligam aos Microtúbulos e Controlam a Polimerização � Catastrofinas ligam-se a extremidade� alavancam os filamentos � MAPs� ligam-se a extremidade� crescimento dos microtúbulos Proteína catanina (não MAP)� hidrolisa o ATP � rápida despolimerização dos microfilamentos � Proteína estatmina se liga a dois heterodímeros de tubulina� evita a adição na extremidade do microtúbulo Subunidades de tubulina não-polimerizadas são seqüestradas! Por que Não Há Polimerização Espontânea das Subunidades de Tubulina? � � [tubulina] disponível para polimerização � Polimerização da tubulina� reação energeticamente favorável� enquanto houver subunidades livres haverá formação dos microtúbulos � � da disponibilidade de tubulina� � crescimento do microtúbulo� a taxa de hidrólise do� � da disponibilidade de tubulina� � crescimento do microtúbulo� a taxa de hidrólise do GTP permanece constante Cílios e Flagelos � Prolongamentos móveis � Estrutura semelhante entre cílios e flagelos � Região central: microtúbulos (axonema)� 2 microtúbulos centrais + 9 duplas de microtúbulos Microtúbulos Corte transversal de um cílio microtúbulos centrais + 9 duplas de microtúbulos � Quando ativados: braços de dineína se ligam ao microtúbulo adjacente promovendo deslizamento (necessidade de ATP) flexão proteínas de ligação Movimentação Ciliar Movimentação Flagelar Cílios e Flagelos - Microtúbulos Movimento flagelar diferenciado. A: protozoários; B: espermatozóide Deslizamento de Microtúbulos Dobramento de Microtúbulos � Cílios� movimentação de fluidos e partículas Cílios e Flagelos - Microtúbulos Cílios ao ME varredura Microtúbulos CÍLIOS em corte transversal: axonema constituído de microtúbulos ( 9+2 ) envolvido por membrana; braços de dineína. � Inseridos em corpúsculos basais Cílios e Flagelos - Microtúbulos ME célula epitelial ciliada. Corpúsculo basal: origina o cílio. 59.000x. Cílios seccionados transversalmente: padrão 9+2 microtúbulos. 80.000x Centríolos Microtúbulos � Cilíndricos, compostos especialmente por microtúbulos curtos e especializados � Cada centríolo� 9 conjuntos de 3 microtúbulos (9 tríades) � Células que não estão em divisão� único par de centríolos (próximo ao núcleo)� Células que não estão em divisão� único par de centríolos (próximo ao núcleo) � Momentos antes da mitose� se duplica (2 pares) � Centros organizadores de microtúbulos (MTOC)� ricos em γ-tubulina Nucleação dos microtúbulos ocorre por um complexo protéico� γ-tubulina Como as Células Regulam o Tamanho do Citoesqueleto? � Matriz centrossomal fibrosa� contém mais de 50 cópias de γ-tubulina (γ-TuRC): molde para nucleação de microtúbulos com 13 protofilamentos Microtúbulos Centrossomo� centro organizador do citoesqueleto: nucleação do crescimento de microtúbulos� arranjo dirigido centro � periferia celular � Configuração estelar dos microtúbulos Filamentos de ActinaMicrotúbulos Filamentos IntermediáriosFilamentos Intermediários Filamentos de Actina (microfilamento)Actina � Subunidades associam-se em oposição: cabeça� cauda� formação de filamentos com polaridade estrutural Formada por cadeia polipeptídica globular simples� monômeros � Subunidades de actina� sítio de ligação para ATP ou ADP � Filamento de actina� formado por 2 protofilamentos paralelos enrolados em hélice Nucleotídeo: ATP ou ADP extremidade −−−− extremidade + Filamentos de Actina Filamentos de Actina (microfilamento)Actina � Presente no citoplasma de todas as células em diferentes formas: � Musc. estriado: associado a filamentos grossos (miosina)� estruturalmente estável miofilamentos miosina actina � Córtex celular: delgada rede na superfície interna da membrana plasmática da maioria das células � migração celular � Cinta de actina e miosina formada no final da mitose� divisão celular Marcação com anti-actina Marcação com anti-miosina � Há 3 tipos de actina: α (muscular); β e γ (não musculares) � Formam feixes com 3 tipos de associações em células não musculares: 1) Feixes contráteis: formação de sulcos de clivagem (anéis contráteis) durante divisão mitótica� geralmente associados a miosina � Associação com Miosina V: movimentação de vesículas intracelulares e organelas � Associaçãocom Miosina II: formação e retração de pseudópodes Filamentos de Actina (microfilamento) 2) Redes Semelhante a Géis: base estrutural do córtex celular� rigidez 3) Feixes paralelos de filamento de actina� formação do eixo central das microvilosidades � Maior densidade de filamentos de actina no córtex celular Nucleação de filamentos de actina ocorre freqüentemente na membrana plasmática� geralmente regulada por sinais externos Como Ocorre a Nucleação dos Filamentos de Actina? � Nucleação é catalisada� complexo de proteínas: 2 proteínas relacionadas a actina (ARPs) � Função análoga a γ-TuRC: Complexo ARP (ou ARP2/3) induz nucleação e crescimento do filamento de actina a partir da extremidade − para extremidade +filamento de actina a partir da extremidade − para extremidade + � ARP2 e ARP3� posicionadas por moléculas acessórias em posição similar a extremidade + dos filamentos de actina� organização a partir do complexo ARP outras proteínas complexo ARP monômeros de actina filamentos de actina nucleado extremidade (−) extremidade (+) Como Ocorre a Nucleação dos Filamentos de Actina? � A nucleação de novos filamentos ocorre com maior eficiência pela ligação do complexo ARP com a cadeia lateral de um filamento pré-existente � Crescimento da ramificação em ângulo de 70º� formação de teia de actina ME: filamentos purificados de actina e complexos ARP� formação de filamentos de actina ramificados � Maioria das células não-musculares� 50% actina solúvel e 50% actina filamentosa Proteínas especiais se ligam aos monômeros de actina desfavorecendo a polimerização� timosina Por que os Monômeros de Actina não se Associam Espontaneamente na Célula? � Monômeros associados a timosina� estado de repouso� não se associam a extremidade + ou − �não hidrolisam/modificam ATP Como ocorre o desbloqueio da timosina para iniciar a polimerização? � Ligação da proteína profilina ao monômero de actina� alteração conformacional da actina� � afinidade pela timosina � A ativação de uma pequena quantidade de profilina resulta na rápida polimerização da actina � Pode ser estabilizado na extremidade + � proteína de capeamento� inativação da extremidade� � taxa de crescimento/despolimerização Filamento de actina que cessa o crescimento e não é estabilizado� rápida despolimerização � Maior parte dos filamentos de actina� capeamento na extremidade + � proteínas CapZ � Capeamento na extremidade − � pode ser realizado pela manutenção do complexo ARP responsável pela nucleação� capeamento na extremidade − é pouco freqüente Como ocorre a Estabilização/Desestabilização dos Filamentos de Actina na Célula? proteína capeadora proteína capeadora Proteínas de Ligação Auxiliam o Arranjo dos Filamentos de Actina Filamentos de Actina estão organizados na célula em forma de feixes e redes/teias (semelhante a gel) Fimbrina: 2 domínios de ligação com actina muito próximos� empacotamento compacto de feixes de actina� filopódios α-actinina: 2 domínios de ligação com actina distantes� fibras de estresse: responsável pela ligação frouxa de feixes contráteis (miosina II) αααα-actina (dímero) fimbrina (monômero) Proteínas de feixes: ligam filamentos de actina em arranjos paralelos Proteínas de rede/teia: ligam filamentos de actina em ângulos abertos� trama frouxa fibras de estresse córtex celular filopódio fibras de estresse córtex celular filopódio feixe contrátil rede com estrutura em gel feixe paralelo compacto Proteínas de Ligação Auxiliam o Arranjo dos Filamentos de Actina Géis de actina tridimensionais são formados por proteínas com dois domínios curvos e longos de ligação aos filamentos de actina � Filamina� formação de gel frouxo e viscoso unindo 2 filamentos de actina � Necessários para célula formar lamelipódios� auxilia movimentação sobre superfícies sólidas Filamina liga-se de forma flexível aos filamentos de actina� formação de gel resistente ligação filamina- actina ligação filamina- actina filamento de actina A Célula Pode Quebrar Longos Filamentos em Filamentos Menores Proteínas da superfamília gelsolina estão envolvidas na quebra da actina � Gelsolina� ativada pelo � [citosólica de Ca2+] � Liga-se a lateral do filamento de actina� abertura entre as subunidades � Insinua um dos domínios na abertura� quebra do filamento � Após a quebra� permanece ligada a extremidade + � atua como proteína capeadora � Fragmentos de filamentos de actina podem nuclear o crescimento de novos filamentos Filamentos de ActinaMicrotúbulos Filamentos IntermediáriosFilamentos Intermediários � Outros filamentos de tamanho intermediário (8-10 nm) � Constituídos por diversas proteínas Filamentos Intermediários � Filamentos intermediários e suas proteínas associadas: auxiliam a manutenção da estrutura tridimensional da célula Filamentos Intermediários Filamentos Intermediários � Função: resistência física às células e tecidos� formam o arcabouço tridimensional deformável e ancoram o núcleo; conexão entre a membrana celular e o citoesqueleto Filamentos intermediários de queratina associado a desmossomos força tensora em células compostas por filamentos intermediários células permanecem intactas e unidas células se rompem células sem filamentos intermediários Formados por moléculas alongadas com domínio central estendido de α hélice� estrutura supertorcida paralela a outro monômero � Um par de dímeros são associados de forma antiparalela� arranjo em tetrâmero � Empacotamento lateral de tetrâmeros formando estrutura com 8 protofilamentos paralelos� 32 α hélices enroladas� flexível e muito resistente � Mecanismos de associação e dissociação são pouco compreendidos� parecem estruturas muito dinâmicas Filamentos Intermediários região de αααα hélice do monômero dímero supertorcido estrutura encadeada de um tetrâmero feito a partir de dois dímeros supertorcidos dois tetrâmeros associados 32 tetrâmeros enrolados em um filamento semelhante a um cabo FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS Citoplasmático Nuclear Queratina Proteínas Semelhantes a Vimentina Neurofilamentos Lâminas Nucleares Cerca de 20 tipos em células epiteliais Axônios de neurônios de vertebrados Desmina, Proteínas Ácida Glial Fibrilar Filamentos Intermediários neurofilamento (axônio) filamentos da glia axônio: grande número de neurofilamentos Astrócitos (axônio) glia Junções de adesão: DesmossomoJunções de adesão: Desmossomo � Membranas celulares dispostas de forma reta, paralela � Células epiteliais=> filamentos intermediários (muito resistentes) de queratina se inserem na placa de ancoragem Junções Intercelulares- Filamentos Intermediários Desmossomos: célula da epiderme em região de interdigitação com filamentos intermediários (10nm) de queratina (tonofilamentos). Junções de adesão: Desmossomo ou Mácula de AdesãoJunções de adesão: Desmossomo ou Mácula de Adesão A Junções Intercelulares- Filamentos Intermediários � Desmossomos promovem firme adesão entre as células � Células não-epiteliais=> filamentos intermediários ancorados nos desmossomos não são constituídos por queratina (desmina ou vimentina) A) TONOFILAMENTOS (10nm): queratina - inseridos em desmossomas. B) Hemi-desmossomos unindo a célula epitelial à membrana basal. B � Hemidesmossomo=> localizados entre algumas células epiteliais e sua lâmina basal � Estrutura de meio desmossomo: prendem a célula epitelial a lâmina basal � Nos desmossomos as placas de ancoragem contém principalmente caderinas ao passo que nos hemidesmossomos há integrinas Como os Filamentos Intermediários são Mantidos Associados? Auto-associação entre filamentos adjacentes� ligaçãopor múltiplos contatos laterais � Participação de proteínas acessórias: � Filagrina� forma feixes de filamentos de queratina em células epidérmicas em diferenciação� resistência da camada externa da pele � Plectina� formação de feixes de filamentos intermediários; liga filamentos intermediários a� microtúbulos, feixes de filamentos de actina e a filamentos de proteína motora miosina II � Auxilia a ligação a feixes de filamentos intermediários a proteínas adesivas da MP� Auxilia a ligação a feixes de filamentos intermediários a proteínas adesivas da MP � Ligação da plectina (verde) conectando diferentes filamentos intermediários (azul) entre si, com microtúbulos (vermelho) e filamentos de miosinamiosina. Amarelo: partículas de ouro ligadas ao Ac anti-plectina Filamentos Intermediários Epidermólise bolhosa� doença genética causada por queratina defeituosa na camada basal de células epidérmicas � Formação de bolhas em resposta a estresse mecânico � Ruptura da camada basal de células epidérmicas � problema de ancoragem da lâmina basal pelos filamentos de queratina (hemidesmossomos) Inibidores da Polimerização da Tubulina Alteração do Citoesqueleto por Fármacos "Se você quer transformar o mundo, mexa primeiro em seu interior." ( Dalai Lama ) � ALBERTS, B., JOHNSON A., WALTER P. 2004. Biologia Molecular da Célula. 4º Edição. Editora Artmed, Porto Alegre. 1462p. Referências Indicadas � ALBERTS, B., BRAY, D., HOPKIN, K., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. 2006. Fundamentos da Biologia Celular. 2º Edição. Editora Artmed, Porto Alegre. 866p. Edição. Editora Artmed, Porto Alegre. 1462p. � JUNQUEIRA, L.C.U. & CARNEIRO, J. Histologia Básica. 10a edição. Ed. Guanabara Koogan. 2004. 488 p.
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