A FORQUILHA DE REPLICAÇÃO

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A FORQUILHA DE REPLICAÇÃO (outra previsão do model de Watson – Crick da replicação do DNA)
* O zíper de replicação, ou forquilha, seria encontrado na mol de DNA durante a replicação;
* forquilha – local no qual a dupla hélice é desenrolada p/ produzir 2 filamentos únicos q servem como molde para a cópia;
Como isso foi descoberto? 
* Incorporaram o nucleotídeo timina marcado com um isótopo radioativo de H, chamado de trício (timidina triacida) no DNA de células bacterianas.
obs: Ele adicionou essa substância ao meio de cultura das bactérias, imaginando que ela seria absorvida pelas células e, no caso delas estarem duplicando o seu cromossomo, ela seria incorporada às novas moléculas de DNA.
* na teoria cada cel-filha sintetizada deveria ter um filamento radioativo (“quente”) e outro não radioativo (“frio”)
* após intervalos variados e nums variados de ciclos de replicação de em um meio “quente”:
1- lisou a bactéria;
obs: a lise é o processo de ruptura ou dissolução da membrana plasmática ou da parede bacteriana, que leva à morte da célula e à liberação de seu conteúdo. 
2- permitiu q os conteúdos da cel ficassem em um pedaço de papel de filtro e o pôs em um microscópio;
3 – cobriu o filtro com uma emulsão fotográfica e a expôs no escuro por 2 meses; (procedimento chamado de auto-radiografia)
 esse procedimento permitiu q Cairns desenvolvesse uma imagem da localização de 3H no material cel;
 à medida q há o decaimento de 3H, há emissão de partículas beta;
 a emulsão fotográfica detecta uma reação quim q ocorre sempre q uma partícula beta atinge a emulsão;
 a emulsão pode ser revelada como uma fotografia, e assim a trilha de emissão de partículas beta aparece como pontos pretos ou grãos.
Resultados:
*após 1 ciclo de replicação em timidina, apareceu um anel de pontos na autoradiografia ( 1 filamento radioativo recém-formado em uma mol circulante de DNA) provando q o cromossomo bacteriano é circular)
* no segundo ciclo de replicação as FORQUILHAS FORAM VISTAS!
*pôde-se ver um circulo com uma curva espessa de pontos passando por dentro do circulo de DNA (estrutura teta)
* curva espessa seria o filamento recém-sintetizado, dessa vez consistindo em 2 filamentos radioativos;
* a curva vai se deslocando por todo o cromossomo, formando de 2 cadeias, 4 cadeias. Esse ponto é a forquilha de replicação!
DNA POLIMERASES
Como as bases são trazidas para a dupla-hélice molde, formando outra cadeia?
 * a DNA polimerase adiciona desoxirribonucleotídeos à ponta 3´ de uma cadeia crescente de nucleotídeos, usando como molde um único filamento de DNA q foi exposto pela deselicoidização localizada da dupla hélice. 
* Os substratos p/a DNA polimerase são as formas trifosfato de desoxirribonucleotídeos, dATP, dGTP , dCTP , dTTP.
 Existem hj 5 DNA polimerases em E.coli. A primeira enzima q Kornberg purificou é a pol I.
Atividades da pol I parecem estar localizadas em partes diferentes da mol e são:
1 – atividade polimerase, q catalisa o cresc da cadeia no sentido 5´para 3´;
2- atividade de exonuclease 3´para 5, q remove os pareamentos errados de bases;
3- atividade de exonuclease de 5´para 3´, q degrada a dupla hélice de DNA.
obs1: 
*As exonucleases possuem atividade de clivar ligações internas entre os nucleotídeos (rompimento de ligaçõesfosfodiéster)
 * as polimerases são enzimas q possuem a propriedade de adicionar nucleotídeos;
obs2: apesar de ter papel na replic do DNA, a pol I não era muito possível p/ a maioria das sínteses por ser lenta (~20 nucleotídeos/ seg) e muito abundante (~400 mols/cel) e tbm porq ela se dissocia do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 nucleotídeos)
* a pol III, catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação.
VISÃO GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA
*A medida q a DDNA pol III avança, a dupla hélice é continuamente desenrolada na frente da enzima p/ expor mais os filamentos únicos de DNA q atuarão como moldes.
 * a pol III atua na forquilha de replicação (zona onde a dupla hélice está se desenrolando);
 como a DNA polimerase sempre add nucleotídeos na ponta 3´ crescente, apenas 1 dos 2 filamentos de polaridade inversa pode servir como molde para a replicação no sentido da forquilha de replicação (p/ esse fil, a síntese pode ocorrer de modo contínuo no sentido da forquilha e o novo fil sintetizado é chamado FILAMENTO CONTÍNUO (leading))
 a síntese do outro filamento:
*também ocorre nas pontas crescentes 3´, mas essa síntese está no sentido “errado” (direção 5´-3´) está distante da forquilha de replicação.
*Mas a natureza requer q a síntese de ambos os filamentos ocorra na região da forquilha de replicação!!
* Por esse motivo a síntese q se move afastando-se da forquilha de replicação não pode cont por muito tempo, sendo em segmentos curtos: a polimerase sintetiza um seg e então se move pra a ponta 5´do seg, onde a forquilha crescente expôs um novo molde, e começa novamente o processo.
* Esses trechos curtos (1000 a 2000 nucleotídeos) de DNA recém-sintetizado são chamados de FRAGMENTOS DE OKAZAKI!
obs1:
*A DNA polimerase pode ampliar uma cadeira, mas não pode COMEÇAR uma cadeia!
* A síntese tanto do filamento leading quanto dos fragmentos de okazaki deve ser iniciada por um PRIMER;
 Primer:
* é uma cadeia curta de nucleotídeos q se liga ao filamento-molde p/ formar um seg de ác. Nucleico dúplice.
* sintetizado pelo primossomo ( um grupo de proteínas, do qual um componente central é uma enzima chamada primase, um tipo de RNA polimerase);
* a primase sintetiza um trecho curto (8 a 12 nucleotídeos) de RNA complementar a uma região específica do cromossomo.
* no filamento leading basta um primer;
* no filamento descontínuo (lagging), cada frag de Okazaki precisa do seu próprio primer. 
*A cadeia de RNA q compõe o primer é então ampliada como uma cadeira de DNA pela pol III.
obs2:
* A pol I remove os primers de RNA e preenche os espaços resultantes com DNA.
* A DNA ligase junta a ponta 3´do DNA preenchedor do espaço à ponta 5´do fragmento de okazaki posterior;
* o novo filamento formando é chamado de FILAMENTO DESCONTÍNUO (lagging);
A precisão da replicação *-*
- A carac da replic do DNA é sua precisão, também chamada de fidelidade(menos de 1 erro por 10 elevado a 10 nucleotídeos!);
- o motivo da precisão da replic do DNA é q tanto a pol I quanto a pol III possuem atividade exonuclease 3´p/ 5´, q serve a uma função de “revisão”.
- como a primase não tem uma função de revisão, o primer de RNA mais provavelmente contém erros do q o dna.
- p/ manter a a alta fidelidade de replicação, os primers de RNA nas pontas dos fragmentos de okazaki devem ser removidos e substituídos por DNA! (feita pela DNA pol I)
- antes da síntese de DNA o primer de RNA é degradado pela atividade 5´-3´de exonuclease de pol I.
ATENÇÃO: se diz DNA POL I e DNA POL III, mas escrevi só pol mesmo por ser menor!
O REPLISSOMO! (como a replicação é veloz e precisa ao mesmo tempo)
* a DNA polimerase é parte de um grande complexo “nucleoproteico” (replissomo) q coordena as atividade na forquilha de replicação;
componentes que interagem no replissomos de E. coli:
holoenzima polimerase III – complexo que consiste em 2 cernes catalíticos e muitas proteínas acessórias.
1 dos cernes lida com a síntese do fil contínuo, o outro lida com a síntese do fil descontínuo;
* algumas das prot acessórias formam uma conexão q faz 1 ponte entre 2 cernes catalíticos, coordenando assim a síntese dos filamentos contínuo e descontínuo.
- o fil desc faz uma alça de modo q o replissomo possa coordenar a síntese de ambos os filamentos e mover-se na direção da forquilha de replicação;
grampo B (beta) – prot acessória importante q circunda o DNA como uma rosca (donut) e mantém o pol III ligada á molécula de DNA. 
obs: assim a pol III é transformada de uma enzima q pode add apenas 10 nucleotídeos antes de sair do molde (chamada de enzima distribuitiva) em uma enzima q fica na forquilha em movimento e adiciona dezenas de milhares de nucleotídeos (enzimaprocessiva).
topoisomerase e helicase- desenrolam e abrem a dupla hélice na preparação para a replicação do DNA ;
* Em suma, pela ação de prot acessórias, a síntese de ambos os filamentos, contínuo e descontínuo é rápida e altamente coordenada.
obs: a primase, enzima q sintetiza o primer de RNA, não toca a proteína grampo. Portanto a primase atua comoa uma enzima distribuitiva (ajuda apenas alguns ribonucleotídeos antes de se dissociar do molde). Esse modo de ação faz sentido porq o primer só precisa ser longo o suficiente p/ formanr um ponto inicial dúplice adequado para a dna pol III.
DESELICOIDIZANDO A DUPLA HÉLICE ( como o DNA pode ser deselicoidizado tão rápido e tbm não helicoidizar atrás da forquilha fazendo um emaranhado?)
* o replissomo contém 2 classes de proteínas q fazem isso:
helicases – abrem a hélice rompendo pontes de H q mantêm os 2 filamentos da dupla hélice juntos; Como a proteína grampo, ela ajusta-se como uma rosca ao redor do DNA,
proteínas de ligação unifilamentares (SSB) - estabiliza o DNA desenrolado, se ligando ao DNA unifilamentar e impedem a reestruturação do dúplice;
obs: O DNA circular pode ser torcido e helicoidizado. O desenrolamento da forquilha de replicação pelas helicases causa torções extras em outras regiões, e hélices chamadas super-hélices formam-se para liberar a tensão da torção extra!
* ambos os giros e super-hélices devem ser removidos p/ permitir que a replicação continue. Essa super-helicoidização pode ser criada ou relaxada por enzimas chamadas topoisomerases;
topoisomerases – relaxam o DNA super-helicoidizado quebrando um único filamento de DNA ou ambos os filamentos, o q permite q o DNA gire p/ uma molécula relaxada. A topoisomerase termina reunindo os filamentos da molécula de DNA agora relaxada.
REPLISSOMO: máquina molécula que faz a síntese de DNA. A máquina inclui duas unidades de DNA polimerase p/ fazer a síntese em cada filamento e coordernar a atividade de prot acessórias necessárias p/ o priming, deselicoidização da dupla hélice e estabilização dos filamentos isolados!
Montagem do replissomo: início da replicação
* começa em locais precisos no cromossomos, chamados de origens e ocorre apenas em certas épocas da vida da célula;
* em E.colo a replicação começa em uma origem fixa chamada de oriC e então continua em ambos os sentidos até as forquilhas se juntarem.
Como acontece:
1- a proteína DnaA se liga a uma sequência específica de 13 pares de bases (pb) (chamada de “DnaA boxe”) q é repetida 5 vezes em oriC;
2 – assim a origem é deselicoidizada em um grupo de nucleotídeos A e T (porq os pares AT são mantidos juntos por apenas 2 pontes de H, enquanto o GC é mantido por 3, sendo mais fácil dissociar a dupla hélice em trechos AT);
3 – depois de começar a deselicoidização, as prot DnaA ligam-se a regiões unifilamentares recém- deselicoidizadas;
4- com DnaA revestido a origem, as 2 helicases (prot DnaB) agora se ligam e deslizam na direção 5´-3´, para começar a abrir a hélice na forquilha de replicação!
5 – a primase e a holoenzima DNA pol III agora são recrutadas para a forquilha de replicação por interações proteína-proteína;
6 – começa a síntese do DNA!
obs: o DnaA NÃO faz parte da maquinaria de replicação (embora seja necessário p/ a montagem do replissomo).
A tarefa do DnaA é levar o replissomos p/ o lugar correto no cromossomo circular, p/ o início da replicação.
 
REPLICAÇÃO EM ORGANISMOS EUCARIÓTICOS!
* A replicação do DNA, tanto em procariontes quanto em eucariontes, usa um mecanismo semiconservativo e emprega a síntese de filamentos de replicação contínua e descontínua;
* o replissomo eucariótico é muito similar ao procariótico, porém quanto mais complexo o organismo mais componentes o replissomo tem.
Replissomo Eucariótico
* existem 13 componentes do replissomo e 27 nos replissomos de leveduras e mamíferos ;
*a maior complexidade do molde eucariótico faz o replissomo possuir mais componentes;
* ao contrário do cromossomo bacteriano, o eucariótico existe no núcleo como cromatina;
*a unidade básica da cromatina é o nucleossomo = DNA enrolado ao redor de proteínas histonas;
* o replissomo não tem só q copiar os filamentos parentais, mas tbm desmontar os nucleossomos nos filamentos parentais e os reunir nas moléculas-filhas;
como se desmonta os nucleossomos?
1- distribui-se aleatoriamente as histonas antigas (dos nucleossomos existentes) para as moléculas-filhas e leva-se novas histonas em associação a uma proteína chamada fator 1 de montagem de cromatina (CAF-1) para o replissomo;
2 – CAF-1 liga-se a histonas e as direciona para a forquilha de replicação, onde podem ser montadas junto com o DNA recém-sintetizado;
3- CAF-1 e sua carga de histonas chegam na forquilha de replicação ligando-se à versão eucariótica do grampo B (beta), chamado antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
* Resumindo, o replissomo eucariótico faz todas as funções do replissomo procariótico; em adição, ele pode desmontar e remontar os complexos proteína-DNA chamados nucleossomos.
REPLICAÇÃO DO DNA E O CICLO CELULAR DE LEVEDURA
* A síntese de DNA ocorre na fase S do ciclo celular eucariótico
Como o início da síntese de DNA é limitada a esse único estágio?.
* Em leveduras:
1- são necessárias 3 proteínas p/ começar a montagem do replissomo;
2- A origem do complexo de reconhecimento (ORC) primeiro liga-se a sequências nas origens de leveduras, como a proteína DnaA faz em E.coli;
3 - A presença de ORC na origem serve p/ recrutar 2 outras proteínas, Cdc6 e Cdt1;
4 - Ambas as prot eínas mais ORC então recrutam a helicase replicativa, chamada de complexo MCM, e outros componentes do replissomo;
obs* a replicação é ligada ao ciclo celular pela disponibilidade de Cdc6 e Cdt1.
 * em levedura, essas prot são sintetizadas durante o final da mitose e intervalo 1 (G1) e são destruídas por proteólise após a síntese ter começado. Desse modo o replissomo poder ser montado apenas ANTES da fase S;
 quando começa a replicação, novos replissomos não podem formar-se nas origens, pois Cdc6 e Cdt1 são degradados durante a fase S e não estão mais disponíveis!
ORIGENS DE REPLICAÇÃO EM EUCARIONTES SUPERIORES
* A origem de replicação de levedura, como a origem em eucariontes, contém uma sequ~encia conservada de DNA q é reconhecida pela ORC e outras proteínas necessárioas para a montagem do replissomo;
* Já as origens de eucariontes superiores são difíceis de isolar e estudar porq são longas e complexas, e não contêm uma sequência conservada de DNA.
TELÔMEROS E TELOMERASE: término da replicação!
* A replicação da mol linear de DNA em um cromossomo eucariótico ocorre em ambas as direções a partir de várias origens de replicação;
*esse processo replica a maioria do DNA cromossômico, mas há um problema em replicar as 2 pontas das mols lineares de DNA, as regiões chamadas de telômeros;
* a síntese contrínua do filamento leading pode ocorrer até a ponta do molde, mas a síntese do filamento descontínuo (lagging) requer primers à frente do processo;
* quando o último primer é removido, resta uma ponta unifilamentar em uma molécula-filha de DNA;
* se o cromossomo-filho com essa mol de DNA fosse replicado novamente, o filamento faltando sequências na ponta seria uma molécula bifilamentar encurtada após a replicação;
* a cada ciclo subsequente de replicação, o telômero continuaria a se encurtar, até q informações codificantes essenciais fossem perdidas;
Como evitar essa perda??
*um componente de um sistema especializado para evitar isso, lida com a adição de múltiplas cópias de uma sequencia simples não-codificante ao DNA das pontas dos cromossomos;
*hoje sabemos q praticamente todos os eucariontes têm curtas repetições em tandem em suas pontas de cromossomos; entretanto, a sequência não é exatamente a mesma.
ex: Os cromossomos humanos terminam em cerca de 10 kb de repetições em tandem da sequência TTAGGG.
Como essas repetições impedem a perda de DNA dos telômeros após cada rodada de replicaçãodo DNA?
* as repetições são adicionadas às pontas do cromossomo por uma enzima, a telomerase;
* a telomerase adiciona repetições curtas ás pontas 3´das moléculas de DNA;
* curiosamente a telomerase leva uma pekena mol de RNA, parte da qual atua como um molde de polimerização da unidade repetida telomérica;
* em todos os vertebrados a sequência de RNA 3´-AAUCCC-5´atua como um molde p/ a unidade repetida 5´-TTAGGG-3´
processo:
1- a RNA telomerase se helicoidiza ao prolongamento 3´do DNA, q é então ampliado com o uso de 2 componentes da telomerase: o pekeno RNA (como molde) e a proteína (como atividade de polimerase);
2 – após a add de alguns nucleotídeos ao prolongamento 3´, a RNA polimerase se move ao longo do DNA de modo a ponta 3´posa ser mais estendida por sua atividade de polimerase;
3- a ponta 3´continua a ser ampliada pelo mov repetido da RNA polimerase;
4 – a primase e a DNA polimerase então usam o prolongamento 3´ como molde p/ preencher o final do outro filamento de DNA.