Coloraçoes Histologicas

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Hematoxilina e eosina 
Os cortes histológicos na maioria dos casos são corados para permitir sua observação ao microscópio.
Para esta finalidade foram desenvolvidos ao longo do tempo inúmeras soluções de corantes e de misturas corantes. As misturas mais práticas e mais utilizadas óbviamente são as que melhor distinguem os diversos componentes das células e da matriz extracelular.
Uma das técnicas mais utilizadas é a que reúne dois corantes chamados hematoxilina e eosina e a mistura é denominada abreviadamente HE ou H&E. Os cortes são corados inicialmente com hematoxilina e em seguida com eosina.
A hematoxilina é extraída de uma planta. Sua solução cora em azul arroxeado vários componentes das células e tecidos. Juntamente com outros corantes, como por exemplo o azul de toluidina, azul de metileno faz parte de um grupo de corantes que se comportam como cátions e tem caráter básico. São também denominados corantes básicos (a hematoxilina a rigor não tem caráter básico mas comporta-se como tal).
De modo geral, os componentes dos cortes que contêm muitos grupos ácidos tem afinidade por estes corantes e estes componentes são denominados estruturas basófilas. 
Exemplos de estruturas basófilas: 
- os núcleos têm grupamentos ácidos nos seus ácidos nucléicos e por isso são basófilos e se coram em roxo pela hematoxilina.
- o ergastoplasma (correspondente no microscópio eletrônico ao retículo endoplasmático granuloso) contém muito ácido ribonucléico.
- a matriz extracelular da cartilagem possui moléculas com muitos grupamentos sulfato.
Estas três estruturas são exemplos de estruturas basófilas que se coram pela hematoxilina e por corantes básicos.
[O texto continua na coluna da direita]
	
	
	
	 
	
	
	
Outro importante grupo de corantes é aquele constituido por corantes de caráter ácido - corantes ácidos.
Estruturas dos cortes que se coram pela eosina e por outros corantes que se comportam como a eosina e o orange G, são chamadas de acidófilas ou eosinófilas. 
As proteínas, de modo geral, se coram preferentemente pelos corantes ácidos - eosina e por corantes semelhantes à eosina.
Exemplos de estruturas acidófilas:
- o citoplasma fundamental (citosol) e as mitocôndrias. Por esta razão, o citoplasma de um grande número de células se cora em rosa pela eosina.
- as fibras colágenas do tecido conjuntivo. Por esta razão a matriz extracelular da maioria dos tecidos, que é muito rica em colágeno, se cora em rosa pela eosina.
Esta classificação de corantes ácidos e básicos não se aplica a todos corantes e misturas corantes. Além disto, a coloração por H&E é genérica e não distingue separadamente os diversos componentes das células conhecidos como organelas. Mais adiante veremos que cada um destes componentes necessita de colorações especiais para poder ser observado.
A imagem é de um corte corado por H&E. A porção direita da imagem tem um feixe de células musculares lisas. Estas células são fusiformes. Nesta figura o eixo maior das células musculares está quase vertical. A porção esquerda da imagem contem tecido conjuntivo, cujas células estão dispostas em diferentes arranjos.
Os núcleos têm grupamentos ácidos nos seus ácidos nucléicos e por isso são basófilos e se coram em roxo pela hematoxilina. Veja os núcleos das células musculares.
Repare que os núcleos das células do tecido conjuntivo se coram muito mais que as do tecido muscular e são mais escuros. Seus núcleos são chamados núcleos de cromatina 
densa
. Os núcleos que se coram menos, como estes das células musculares, são chamados núcleos de cromatina frouxa. 
Nas células musculares lisas e na maioria dos outros tipos célulares o citoplasma se cora em cor de rosa ou alaranjado, por ter sido corado preferentemente pela eosina. Estruturas que se coram pela eosina e por outros corantes ácidos são chamadas de acidófilas ou eosinófilas. 
Quase toda região corada em rosa no lado direito é citoplasma das células musculares .
	
	
	
	
	
	
	
A porção esquerda da imagem, formada por tecido conjuntivo, também se cora bastante por eosina e é, portanto, eosinófila ou acidófila. Este tecido tem uma grande quantidade de fibras colágenas, que são as estruturas alongadas e tortuosas coradas pela eosina. Veja algumas das fibras colágenas. As fibras colágenas são constituidas pela proteína colágeno e por outras proteínas. Embora as fibras se corem de maneira semelhante ao citoplasma, elas fazem parte da matriz extracelular.
Algumas sutilezas da coloração por H&E
Na figura superior: o citoplasma das células musculares lisas assim como as fibras colágenas têm uma bonita coloração cor de rosa. O citoplasma das células musculares e as fibras colágenas parecem bastante "lisos", sem muita textura. Tanto um como outro são acidófilos, corando-se bem pela eosina.
É interessante agora comparar a imagem superior com o citoplasma das principais células do fígado, os hepatócitos que aparecem na figura inferior.
Como se comparam todas estas estruturas?
Compare a coloração das fibras colágenas, citoplasma dos hepatócitos e citoplasma das células musculares lisas?
Todas as três são acidófilas, corando-se por eosina, porém:
A coloração (a cor) nos três casos é a mesma? 
A textura é a mesma? Todas são "lisas"?
As fibras colágenas e o citoplasma das células musculares lisas são róseas e sua textura é lisa, homogênea.
O citoplasma dos hepatócitos também é acidófilo, mas tem um grande número de pequenas manchas arroxeadas, coradas por hematoxilina e, portanto, basófilas. Como consequência, todo o citoplasma dos hepatócitos tende mais a um arroxeado do que a um cor de rosa. Por causa das manchas o citoplasma dos hepatócitos não é tão "liso".
	
	
	
	
	
	
Aumento: grande. Coloração: H&E.
	
Mais sutilezas da coloração por H&E
A imagem ao lado é de neurônios. São as células com citoplasma bem corado, núcleo de cromatina frouxa (núcleo "claro") frequentemente com grandes nucléolos. 
O citoplasma destes neurônios também se cora pela eosina sendo portanto acidófilo. Além disso, há no citoplasma de suas células grandes manchas arroxeadas, basófilas. Coloque e retire o cursor de sobre a imagem várias vezes para ver algumas destas manchas.
Repare que mesmo nos três neurônios enfileirados em que as manchas não ficam iluminadas com o cursor também há manchas, bem evidentes. 
A que se deve a presença de estruturas basófilas no citoplasma?
Estruturas basófilas têm natureza ácida e estando no citoplasma, correspondem a ácido ribonucléico - RNA, que existe em grande quantidade no citoplasma de células que sintetizam muitas proteínas, como é o caso dos hepatócitos e neurônios. 
As manchas arroxeadas, basófilas, no citoplasma destas células e dos hepatócitos da figura da página anterior correspondem à organela chamada ergastoplasma, que possue grande quantidade de ribosomos formados por RNA ribossomal.
	
	
	
	
	
	
	Ainda mais sutilezas da coloração por H&E
Um exemplo ainda mais evidente de basofilia citoplasmática relacionada ao ergastoplasma é o das células exócrinas do pâncreas. Estas células secretam suco pancreático, que é constituido de grande quantidade de proteínas.
Estas células se reunem em pequenos grupos arredondados chamados ácinos (isto será melhor estudado no módulo de Epitélio glandular). Cada célula tem a forma de uma pequena pirâmide, que em cortes aparece triangular - passe o cursor sobre a imagem para ver o contorno de duas células.
As células exócrinas do pâncreas possuem duas regiões de citoplasma bem distintas, separadas pelo núcleo. Duas células estão destacadas para melhor observá-las. Passe o cursor sobre a imagem.
Uma destas regiões (destaque em azul) é obviamente basófila, arroxeada, e corresponde ao ergastoplasma muito desenvolvido nestas células que são grandes produtoras de proteínas. 
A outra região (destaque em laranja) contém uma grande quantidade de grãos de secreção, ricos em proteínas - as enzimas produzidas pela célula. Esta regiãoé ácidófila.
	
	
	
	
	
	
Ainda mais sutilezas da coloração por H&E
A imagem é de um pâncreas onde se observam em aumento pequeno as células secretoras exócrinas analisadas no quadro anterior. Estas células têm uma forte basofilia em uma região do citoplasma evidenciada pela forte coloração pela hematoxilina. Isto é devido à grande quantidade de RNA no citoplasma, necessário para a intensa atividade de síntese protéica destas células. Por esta razão a coloração de um corte de pâncreas corado por H&E é bastante azulada.
Há no pâncreas uma outra população de células com atividade de síntese protéica muito menor. São as células que se reúnem em pequenos grupos esféricos, chamados Ilhotas de Langerhans. Suas células produzem vários hormônios importantes, como por exemplo a insulina - passe o cursor para ver a ilhota.
As células das ilhotas tem muito menos ergastoplasma e por esta razão seu citoplasma exibe muito menos basofilia que as células exócrinas que as envolvem. Veja como as células das ilhotas têm uma coloração muito mais clara que as células que estão em volta.
	
	
	
	
	
	
	
Coloração da matriz extracelular
O material que fica entre as células -chamado matriz extracelular- também é corado pelas colorações histológicas habituais.
A composição química da matriz extracelular varia nos diversos tecidos e regiões do organismo. Se a matriz for constituída principalmente por proteínas, provavelmente será corada pela eosina e terá característica de acidofilia. 
Isto foi observado no início desta série sobre coloração, onde as fibras colágenas estavam coradas por eosina - clique aqui para rever a página. 
A imagem ao lado é de um corte de cartilagem hialina. As células cartilaginosas são também chamadas condrócitos. Entre os condrócitos ou entre grupos de condrócitos existe matriz extracelular. 
Repare que em vez de ser acidófila (cor de rosa, corada pela eosina) como no caso do colágeno, a matriz da cartilagem se cora em roxo pela hematoxilina e é, portanto, basófila - veja a matriz extra-celular da cartilagem. 
Isto acontece porque a matriz da cartilagem não tem muito colágeno, mas tem moléculas com muitos grupamentos ácidos.
Em torno deste pequeno pedaço de cartilagem há matriz extracelular rica em colágeno o qual, como o colágeno de outros locais do organismo, se cora em vermelho ou rosa pela eosina e é acidófilo - veja a matriz extracelular em torno da cartilagem.
	
	
	
	
Corantes tricrômicos
Dentre as inúmeras soluções corantes que foram desenvolvidas para coloração de preparados histológicos, destacam-se os tricrômicos. 
Como o nome já indica, são constituídos de três corantes. Um dos mais conhecidos é o tricrômico de Mallory. 
O aspecto morfológico de alguns tecidos pode ser muito semelhante ao de outros tecidos e nem sempre é fácil distingui-los ao microscópio em cortes corados por H&E. É o caso do tecido muscular liso e do tecido conjuntivo propriamente dito mostrados no início desta série sobre H&E - reveja os dois tecidos.
Uma das grandes vantagens deste e de alguns outros tricrômicos é permitir uma diferenciação melhor entre tecidos, especialmente entre o tecido conjuntivo e o tecido muscular.
Na imagem ao lado -um corte transversal da parede da vesícula biliar- o tricrômico de Mallory permite diferenciar o tecido muscular liso em marrom claro e as fibras colágenas do tecido conjuntivo em azul facilitando o reconhecimento de ambos.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Corantes tricrômicos
Corantes tricrômicos podem ser muito úteis para evidenciar melhor certas estruturas celulares, como é o caso dos grãos de secreção apontados por setas na imagem.
	
	
	
Corantes para finalidades específicas
O conteúdo lipídico dos órgãos e tecidos é geralmente perdido durante a confecção de preparados histológicos rotineiros. Isto se deve ao uso de solventes de lípides durante os procedimentos.
Uma das maneiras de evidenciar lípides é fazer cortes de tecidos congelados (corte por congelação ou por criomicrotomia), nos quais os lípides não são tratados com estes solventes e permanecem nos cortes. 
Sua coloração pode ser feita com corantes solúveis em lípides, que evidenciam os depósitos de lípides nas células. Neste caso foi usado um corante amarelo que se dissolveu nos lípides do tecido.
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
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http://www.icb.usp.br/mol/1basico40.html
http://www.icb.usp.br/mol/1basico40.html
Técnicas para finalidades específicas - Impregnação metálica
As colorações rotineiras não evidenciam a maioria das organelas de modo que para observá-las foram desenvolvidas várias técnicas.
Em algumas dessas técnicas, como a que está mostrada na imagem, os fragmentos de órgãos são tratados por várias soluções contendo sais de metais como ouro, prata ou zinco. Estes metais tem afinidade por estruturas das células e da matriz extracelular formando precipitados escuros, de cor marrom ou negra, que são visíveis por microscopia.
Estas técnicas são denominadas Técnicas de impregnação metálica e são também muito usadas para a observação de células do tecido nervoso. Não são técnicas de coloração, porque não ocorre um processo de tingimento. A cor é devida ao depósito de metais sobre uma estrutura. 
A imagem superior é de um epidídimo em aumento pequeno. A imagem inferior é de um epidídimo em aumento médio e mostra três secções do tubo que constitue este órgão. O tubo é formado por um epitélio constituido por uma camada de células cúbicas, cujos limites infelizmente não são visíveis neste preparado. Vários núcleos foram ressaltados para permitir reconhecer a posição das células.
Na técnica que foi aqui usada, houve precipitação de metais sobre o aparelho de Golgi. Este é visto como uma pequena rede no citoplasma destas células. A rede se torna visível devido ao precipitado de metais sobre os componentes desta organela. Cada imagem de aparelho de Golgi corresponde a uma célula.
	
	
	
	Corte de epidídimo em aumento pequeno. Este órgão é formado de um tubo enovelado.Quando o tubo é seccionado observam-se muitas imagens diferentes deste mesmo túbulo. (Para recordar o efeito do seccionamento de um tubo enovelado clique em : 1 e 2).
	
	Corte de epidídimo em aumento médio. Observe quadrantes de tres secções do túbulo do epidídimo.
	
	Aumento :grande Impregnação metálica: técnica de Aoyama.
Corantes para finalidades específicas
Há várias técnicas para corar mitocôndrias. A imagem ao lado é de túbulos renais em que há um intenso transporte ativo de ions e muitas mitocôndrias para fornecer energia para este transporte. 
Nestas células as mitocôndrias são longas e se dispõem paralelamente. Algumas mitocôndrias estão destacadas em laranja. 
	
	
	
Coloração:Hematoxilina fosfotúngstica
Corantes para tecido nervoso
A imagem mostra uma região do sistema nervoso central (uma das camadas da substância cinzenta do cérebro). Há vários tipos de células: corpos celulares de neurônios, células da neuroglia, células de vasos sanguíneos.
Infelizmente este preparado não mostra a riqueza de prolongamentos que é a grande característica das células do sistema nervoso. Estes prolongamentos são de dois tipos: alguns permitem a conexão entre neurônios e outros o suporte dos neurônios pelas células da neuroglia.
Somente quando foram introduzidas as técnicas de impregnação metálica foi possível visualizar os prolongamentos e iniciar o grande desenvolvimento científico da estrutura e função deste sistema.
Pela impregnação metálica, são precipitados metais (principalmente ouro ou prata) sobre componentes do tecido nervoso revelando prolongamentos celulares (e portanto as associações entre neurônios e as vias neuronais), assim como tipos específicos de células da neuroglia.
Coloque o cursor sobre a imagem para observar uma região semelhantedo cérebro, porém submetida a uma técnica de impregnação metálica.
	
	
	
H&E / impregnação metálica
Pigmentos 
Dentre as poucas estruturas que não necessitam ser coradas para serem observadas ao microscópio estão os depósitos de pigmentos e de outras substâncias coloridas.
Exemplos de substâncias coloridas: 
partículas de carvão aspiradas e alojadas dentro de células fagocitárias do pulmão - os macrófagos alveolares.
hemoglobina depositada na matriz extracelular (após uma hemorragia) ou no interior de células fagocitárias.
outros pigmentos, dentre os quais o mais comum é o pigmento melânico (melanina). Este existe principalmente na epiderme e no olho sob forma de pequenos grânulos de cor castanha, como os que podem ser vistos na imagem ao lado que é um corte de pele.
	
	
	Coloração: H&E.
DNA 
Muitos métodos foram desenvolvidos para analisar a estrutura química de estruturas presentes em cortes histológicos. O conjunto destes métodos é denominado Citoquímica ou Histoquímica.
Estes métodos são desenvolvidos em cortes obtidos de maneira rotineira ou obtidos por microtomia de congelação.
Na imagem está mostrado o resultado do tratamento de um corte pela técnica de Feulgen. Esta, após tratar os cortes por hidrólise ácida, evidencia o DNA por meio de uma solução especial de corante. 
Esta técnica é muito precisa e permite medir (por fotometria) a concentração e quantidade de DNA nuclear. Repare que somente o DNA é destacado.
	
	
	Coloração: Feulgen 
Carboidratos
Para demonstrar glicídios foi desenvolvida a técnica histoquímica do ácido periódico-Schiff (periodic acid-Schiff), abreviadamente PAS.
Estruturas ricas em açúcares assumem uma coloração magenta (violeta/avermelhada) após serem submetidas ao PAS.
A imagem ao lado é de um corte de fígado que quando submetido à técnica do PAS mostra a riqueza de depósitos de glicogênio no citoplasma dos hepatócitos. Os núcleos dos hepatócitos foram corados por hematoxilina. Para facilitar o exame desta imagem, os núcleos de vários hepatócitos foram ressaltados em cor laranja.
A próxima página também tem um exemplo significativo de uso desta técnica
	
	
	 Coloração: PAS +
Carboidratos 
As membranas basais são camadas de macromoléculas ricas em glicídios que servem de suporte para muitos tipos de células, principalmente epiteliais. 
A grande quantidade de glicídios que as membranas basais possuem permite que as membranas basais sejam visualisadas pela técnica de PAS.
Isto pode ser bem visto na imagem, que é de túbulos renais envolvidos cada um por uma distinta membrana basal de cor magenta/avermelhada. 
Ao passar o cursor sobre a imagem algumas membranas basais ficam destacadas.
	
	
	
Cálcio
Além das substâncias mostradas nos quadros anteriores, várias outras podem ser demonstradas por procedimentos citoquímicos, como proteínas em geral, enzimas, elementos químicos.
A imagem mostra um corte de osso em uma região de ossificação. Neste corte foi aplicada uma técnica para demonstrar íons cálcio. Pode-se ver os locais do osso em que já houve a precipitação de cálcio para a formação de osso - são os locais em que há uma coloração negra. Os locais corados somente em laranja (pelo corante safranina) são regiões de osso não-calcificado - veja locais calcificados.
Em grande parte devido a técnicas que demonstram componentes em cortes histológicos, houve um grande progresso das Ciências Biomédicas nos últimos 50 anos. Por exemplo, é possível atualmente evidenciar por métodos imunoquímicos e de Biologia Molecular, a presença de proteínas específicas em um corte (por imunocitoquímica) e a presença de sequências específicas de RNA ou DNA (por hibridização in situ).
	
	
	
	
	Técnica: von Kossa + 
	
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