RENATO GRANADO PADILHA

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RENATO GRANADO PADILHA
DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA DE ANÁLISE MULTIPARAMÉTRICA DE CITOTOXICIDADE EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS E AVALIAÇÃO DE POTENCIAL ANTITUMORAL DE COMPOSTOS METÁLICOS CONTRA CÂNCER DE MAMA 
Projeto apresentado ao Programa de Pós-Graduação Stricto-Sensu em Biotecnologia do Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO) como requisito para ingresso no curso de Doutorado em Biotecnologia.
Linha de Pesquisa: Biotecnologia Industrial.
Orientadores: Celso Barbosa de Sant’Anna Filho e Emile Barrias 
Laboratório de Pesquisa: Laboratório de Microscopia Aplicada à Ciências da Vida (Lamav)
Duque de Caxias - RJ
2017
1 INTRODUÇÃO	
1.1 Citotoxicidade e Análise Multiparamétrica de Alto Conteúdo
	O principal pré-requisito para a introdução de novos fármacos no mercado é a avaliação de segurança do mesmo em relação ao organismo que será tratado (VINKEN, 2017). Essas análises são iniciadas através da avaliação do índice de citotoxicidade (IC50), que é representado pela concentração do fármaco capaz de causar lise ou morte de 50% da população celular (ROGERO et al, 2002). Além disso, testes de citotoxicidade têm sido utilizados em propostas de métodos alternativos ao uso de animais, aumentando o número de ensaios sem animais em todo o mundo (VINKEN, 2017).
	Com o propósito de padronizar as análises de citotoxicidade in vitro, a ISO 10993-5 foi criada. A parte 5 da referida norma tem como tema principal os testes de citotoxicidade in vitro, considerando a larga gama de materiais que têm surgido com as mais diversas propostas. Nessa ISO, são listadas três categorias de testes: teste de extrato, teste de contato direto e teste de contato indireto. A escolha de um ou mais desses testes determinará os detalhes de preparo das amostras, a preparação das células a serem utilizadas e a forma que as células são expostas às amostras. Além disso, essa parte da ISO permite agrupar os métodos e os parâmetros avaliados na determinação da citotoxicidade em categorias como avaliação do dano celular por meios morfológicos; medições de danos celulares; medições do crescimento celular; medições de aspectos específicos do metabolismo celular (ISO, 2009). 
	Dentre os métodos clássicos utilizados atualmente para análise de citotoxicidade estão os ensaios colorimétricos de liberação de lactato desidrogenase (LDH), MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], MTS [3-(4,5-imethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium]. Esses ensaios de viabilidade celular têm sido utilizados para avaliar a toxicidade de drogas e outros compostos, no entanto, apresentam limitações e são pouco sensíveis (LI et al., 2007).  
	Outros ensaios de viabilidade mais modernos têm sido realizados utilizando dois corantes diferentes: um para corar células vivas (com capacidade de internalizar o corante) e outro para corar as células mortas (um corante que não seja capaz de atravessar uma membrana plasmática integra). Para esse tipo de técnica, são necessárias análises celulares quantitativas em citômetro de fluxo, fluorímetro ou ao microscópio de fluorescência, o que torna o método mais demorado, dependendo do número de compostos e concentrações avaliados e em quantos tipos celulares o estudo será realizado (BRAYDEN et al., 2015). Com o uso de análise celular de alto conteúdo, do inglês, “High Content Analysis” (HCA) este tipo de ensaio se torna mais rápido. HCA é um sistema de análise utilizado para avaliação de conteúdo celular baseado em imagens desenvolvido para integrar a microscopia de fluorescência automatizada para análise do conteúdo celular com o estudo quantitativo multiparamétrico de sistemas biológicos complexos, como células e organismos inteiros (ZANELLA et al., 2010). É possível, então, obter simultaneamente centenas de medições biologicamente relevantes a partir de imagens adquiridas com o auxílio do HCA, o que permite avaliar ao mesmo tempo proteínas, organelas, estruturas celulares ou células inteiras (USAJ et al., 2016). 
O método HCA tem sido utilizado para avaliar de modo rápido e multiparamétrico as alterações celulares causadas pela adição de uma droga, um patógeno ou mutação genética (USAJ et al., 2016). Assim, ensaios citotóxicos com HCA, além de serem muito mais rápidos do que os testes convencionais, também são capazes de fornecer informações adicionais relevantes sobre apoptose, necrose, autofagia, potencial mitocondrial e de membrana, acúmulo de material nos lisossomos, estresse oxidativo, entre outros (ANGUISSOLA et al., 2014). Além disso, diversos tipos celulares podem ser avaliados por HCA, sendo possível obter resultados para estimar, por exemplo,  hepatotoxicidade e neurotoxicidade (JAN et al., 2008). Devido a estas características, o métodos de HCA tem sido utilizado com sucesso na indústria farmacêutica para avaliação de novas drogas, otimização de candidatos a drogas, validação de alvos de drogas, assim como, a investigação de toxicidade de novos compostos (ZANELLA et al., 2010). A técnica tem sido eficiente também para a avaliação de citotoxicidade de pequenas moléculas, produtos biotecnológicos, nanopartículas, polímeros e potenciadores de absorção intestinal (BRAYDEN et al., 2015).
1.2 Câncer de Mama
O câncer é uma doença caracterizada pela presenta de uma célula ou grupo de células que apresenta crescimento descontrolado e em muitos casos possui capacidade para invadir tecidos e realizar metástase (NAZEEMA & SUGANNYA, 2014). Em 2012, a estimativa de novos casos de câncer foi de 14,1 milhões e 8,2 milhões casos de mortes em todo o mundo (STEWART & WILD, 2014). O câncer é atualmente tratado por quimioterapia, radioterapia ou por meio de cirurgias (VLASHI & PAJONK, 2015). Os quimioterápicos disponíveis atualmente para o tratamento de câncer afetam também as células saudáveis, especialmente de medula óssea, tecidos epiteliais, sistema retículo-endotelial e gônadas (NAZEEMA & SUGANNYA, 2014). Além disso, muitas terapias antitumorais têm uso bastante limitado devido ao desenvolvimento de resistência que ocorre por muitos fatores, incluindo alterações na molécula alvo da droga, ativação de vias pro-sobrevivência, e a ineficaz indução de morte celular (SEGUIN et al., 2014). 
O câncer da mama é uma das principais doenças malignas que afetam as mulheres
em todo o mundo. Em 2012, cerca de 1,7 milhões de pessoas foram diagnosticadas com esta doença e cerca de 522.000 mortes foram relatadas no mesmo ano (Ferlay et al, 2015). O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres também no Brasil, depois do de pele não melanoma, sendo responsável por 25% dos casos novos a cada ano, aproximadamente. O câncer de mama também acomete homens, porém é raro, representando apenas 1% do total de casos da doença. Esse tipo de carcinoma ainda é raramente diagnosticado em pacientes com menos de 35 anos, no entanto, acima desta idade sua incidência cresce progressivamente, especialmente após os 50 anos. Pesquisas evidenciam aumento da sua incidência tanto nos países desenvolvidos quanto nos países em desenvolvimento. Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), em 2016, foram estimados 57.960 novos casos da doença, tendo como casos fatais 181 homens e 14.206 mulheres, em 2013 (INCA, 2016). Cerca de 70% do carcinoma da mama expressa o receptor de α-estrogênio (ER+). O ER desempenha um papel importante na tumorigênese do câncer da mama, uma vez que leva a uma superexpressão de ciclina D1, Myc, Bcl-2 e VEGF (factor de crescimento endotelial vascular), e ativaçãode vias de sinalização de PI3 / AKT / mTOR incluindo a inativação de PTEN e indução da sinalização NFkB. Estas desempenham um papel significativo no ciclo celular, na sobrevivência e estímulo da angiogênese (Eeckhoute et al, 2006). Para a maioria dos pacientes ER+, a terapia endócrina é a primeira escolha para o tratamento. Atualmente,três classes de terapias endócrinas são amplamente utilizadas:a) modificadores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), como o tamoxifeno, que bloqueia a atividade transcricional de ER; b) ligação direta a receptores seletivos de receptor de estrogênio (SERDs), tais como Fulvestrant e; c) inibidores de aromatase (AIs) tais como lentrozol, Anastrozol e exemestano que inibem a enzima aromatase responsável pela produção de estrogênio (Ali et al, 2016). No entanto, o tamoxifeno foi a primeira escolha para a terapia adjuvante desde a sua 1970, particularmente para mulheres pré-menopáusicas. Porém, cerca de 20-30% dos tumores são resistentes ao tamoxifeno ou tornam-se resistentes ao quimioterápico durante o tratamento (Ali et al, 2016b). Atualmente, estudos clínicos têm sido feitos com o intuito de utilizar conjuntamente compostos endócrinos (caso do tamoxifeno)  com outros compostos que atuem nos receptores tirosino-cinase (RTK), no eixo PI3K-mTOR-Akt ou que atuem em proteínas do ciclo celular como histonas desacetilases (Hurtado et al, 2008). A utilização de inibidores de histonas deacetilases já foi, inclusive, aprovada pelo “Food and Drug Administration” dos Estados Unidos (FDA) para o tratamento de um tipo raro de linfoma (Jin et al, 2015).
1.3 Compostos Metálicos
Os compostos metálicos, também conhecidos como metalocomplexos, são importantes protótipos para o desenvolvimento de novas drogas (FERNANDES et al., 2010). Alguns metalocomplexos agem como nucleases e peptidases sintéticas, possuindo grande importância para manipulação de DNA e o desenvolvimento de novas drogas de efeito terapêutico (PARRILHA et al., 2008). Esses compostos metálicos possuem uma significativa importância no desenvolvimento farmacológico, devido às diversas aplicações em diferentes áreas. Além disso, se apresentam em grande variedade e possuem peculiaridades químicas, como a reativação do centro metálico em moléculas alvo (NAVARRO ET AL., 2010).
Compostos metálicos com núcleo de ferro têm-se mostrado altamente eficientes contra células cancerosas leucêmica demonstrando também uma baixa toxicidade às células normais do organismo (HORN JR. et al., 2013). Complexos de cobre (II) contendo grupo nafitil também tem sido descritos como indutores de morte por apoptose em  células leucêmicas visto que este grupamento interage com receptores específicos que disparam vias extrinsicas deste mecanismo de morte celular programada (Fernandes et al, 2015). Outros complexos metálicos que tem apresentado um grande interesse na área científica são os complexos vaseados em núcleos de platina ou rutênio.  O desenvolvimento complexos utilizando o metal Ru(II) tem atraído especial atenção e têm sido extensivamente estudados nos últimos 20 anos e em alguns casos, estes complexos apresentam maior atividade antitumoral  com uma toxicidade inferior à observada quando comparada com  compostos de platina (Dutta et al, 2008) que são os metalo complexos de maior utilização em áreas médicas (Wang et al, 2005). Visto que alguns metalocomplexos já apresentaram inúmeras atividades biológicas, é interessante que novos compostos metálicos sejam desenvolvidos e que os já existentes tenha seu uso coordenado com moléculas já conhecidamente ativas, visando diferentes tratamentos clínicos. 
1.3 Justificativa
	Ensaios de toxicidade in vitro são um importante passo na avaliação da biocompatibilidade de uma substância ou material e para ser considerado bioseguro já que o material em questão não pode prejudicar as funções celulares (ARAÚJO et al., 2008). A avaliação da citotoxicidade e do potencial antitumoral de metalocomplexos por HCA pode tornar os ensaios mais rápidos e informativos uma vez que este tipo de técnica é baseado na automatizada obtenção e análise de imagens minimizando interferências operacionais (ZANELLA et al., 2010). A técnica permite uma avaliação de múltiplos parâmetros simultaneamente, o que reduz o tempo e os custos da pesquisa (SIQUEIRA-NETO et al., 2012). 
	Visto que a alta incidência de câncer de mama ER+ e a resistência a tratamentos anti-tumorais como tamoxofeno (ZHOU et al., 2015; SAMUEL et al., 2016) novas alternativas de tratamentos anti-tumorais têm sido alvo das pesquisas científicas. Neste contexto, os compostos metálicos, associados ou não a compostos já disponíveis no mercado ou a compostos que inibam viam já descritas como sendo importantes para o desenvolvimento desta enfermidade podem ser eficientes no tratamento de câncer in vivo e in vitro.
	Em relação a métodos convencionais de avaliação da citotoxicidade, o HCA possui as vantagens de ser uma técnica mais sensível e rápida, o que permite uma confiável avaliação da toxicidade e efeito antitumoral de um amplo espectro de compostos que venha a ser testados (LI et al., 2007; BRAYDEN et al., 2015).  
	Portanto, o presente estudo tem grande potencial de contribuição para a pesquisa científica já que pretende promover o desenvolvimento de um protocolo validado de análise multiparamétrica de alto conteúdo e, ao mesmo tempo, utilizar metalocomplexos coordenados ou não como potenciais fármacos antitumorais contra o câncer de mama ER+. 
2 OBJETIVO
2.1 Objetivo Geral
Definir protocolo validado para análise multiparamétrica de citotoxicidade em células de mamíferos e avaliar o potencial antitumoral de complexos metálicos coordenados ou não com inibidores de histonas deacetilases e com uma das drogas de escolha (tamoxifeno) contra câncer de mama.
2.2 Objetivos Específicos
- -Avaliar o efeito antiproliferativo de compostos metálicos coordenados ou não em células tumorais e não tumorais. 
- Avaliar o efeito do tratamento com compostos metálicos nas características nucleares (tamanho e intensidade de fluorescência) e na ocorrência de micronúcleos em células tumorais e não tumorais. 
- Avaliar o efeito ultraestrutural de compostos metálicos na viabilidade de células saudáveis e tumorais. 
- Avaliar em células tumorais e não tumorais o tipo de morte celular 
- Análise multiparamétrica da citotoxicidade induzida por compostos metálicos em células tumorais e não tumorais através de: quantificação e avaliação do potencial mitocondrial, avaliação da permeabilidade membranar, , avaliação de alterações na produção de espécies reativas de oxigênio, avaliação da área celular e na polimerização do citoesqueleto.
3 METAS
- Desenvolver uma metodologia para avaliação multiparamétrica de alto conteúdo mais sensível, rápida e detalhada do que as atualmente aplicadas visando à melhoria da proteção à saúde;
- Utilizar compostos metálicos e novos inibidores de histonas deacetilases como potenciais fármacos com efeitos antitumorais contra o câncer de mama em testes primários in vitro.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Cutivo Celular: No presente trabalho serão utilizadas duas linhagens celulares, a linhagem MCF7 ATCC HTB-22 (epitélio mamário diferenciado tumoral, com expressão de receeptores de estrogênio) e a linhagem MCF 10A ATCC ® CRL-10317 (epitélio mamário não tumoral). Ambas as linhagens serão mantidas em meio DMEM com alta concentração de glicose (Dubbecco’s Modified Eagle’s Medium – Gibco Thermo), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (Gibco Thermo) e 1% de L- glutamina(Sigma Aldrich). As culturas serãomantidas a 37°C com 5% de CO 2 . A cada 72 horas os meios de cultura serão substituídos por meios novos e, após confluência, as culturas serão tratadas com solução tripsina/EDTA (Merck) para obtenção de subculturas dessas células. Para experimentos de HCA as linhagens serão Experimentos iniciais foram realizados para obter a curva de plaqueamento, ou seja, plaqueadas em placas de 96 poços negras, estéreis de fundo transparente (Costar). Para experimentos de fluorescência, as células serão plaqueadas em lamínulas de vidro de 13 mm de diâmetro (Marienfeld Superior) em placas de 24 poços (TPP). Para os experimentos de análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão, as células serão plaqueadas em garrafas plásticas de 75 cm3 ou placas de Petri (TPP).
4.2 Compostos Utilizados: Serão utilizados no presente trabalho os seguintescompostos: a) compostos metalocomplexos FeHPSO4, ZnBe, Fe7HCBMPa, B10109, A11312 e B2310 sintetizados e cedidos pelo Dr. Adolfo Horn Jr. e colaboradores do Laboratório de Ciências Químicas -UENF; b) compostos complexos metálicos com núcleo de rutênio e platina sintetizados e cedidos pela Dra. Maribel Navarro e colaboradores na UFJF; c) inibidores de histonas deacetilases sintetizados e cedidos pelo grupo do Dr. Franz Bracher no Ludwig-Maximilians-University- Munich; d) citrato de tamoxifeno, comercialmente disponibilizado pelo laboratório Sandoz; e) compostos metálicos coordenados com inibidores de histonas deacetilases ou com tamoxifeno através de colaboração com o grupo da Dra. Maribel Navarro e do Dr. Adolfo Horn Jr. Todos os compostos serão diluídos em DMSO (dimetil sulfóxido de sódio, Merck) para obtenção da solução estoque. A concentração final de DMSO no meio nunca excederá 0,01% (v/v). O controle foi feito com uso da maior concentração de DMSO sem a adição dos compostos. Os compostos eram mantidos estocados a -22ºC.
4.3 Avaliação da atividade anti-proliferativa dos compostos por microscopia óptica automatizada: Para avaliar o efeito dos compostos, células MCF7 e MCF10A serão plaqueadas em placas de 96 poços na presença do marcador nuclear Hoeschst 33342 (Trihydrochloride, Trihydrate, 100 mg – ThermoFisher), na concentração de 1uL por 5mL e dos compostos citados no item 4.2 em meio RPMI 1640 Media (Sigma-Aldrich) e 5% de SFB. O Hoeschst 33342 se liga as bases adenina e timina do DNA, logo o núcleo da célula se torna fluorescente. permitindo a obtenção de imagens dos núcleos celulares estimando o número de células presentes em cada imageamento. O meio contendo as diferentes concentrações dos compostos serão trocados a cada 24 horas. Para determinação o IC50, a cada 24h, serão obtidas imagens no microscópio óptico de fluorescência automatizado (In Cell -  GE Healthcare Life Sciences), utilizando a objetiva de 10x ampliação (N.A=0.63) que posteriormente serão analisados no software InCell Analyser 2000 (módulo de análise de núcleo). 
4.4. Análise da citoxicidade e detecção de micronúcleos in vitro: O limiar de citoxicidade dos compostos será avaliado sobre culturas de células de MCF7 e MCF10A com concentrações crescentes de cada composto, seguido pela análise da viabilidade por PI (Iodeto de proprídio - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) e Hoescht 33342 (Trihydrochloride, Trihydrate, 100 mg – ThermoFisher). Para estes ensaios, o marcador Hoescht 33342 será incubado durante o plaqueamento e PI (Iodeto de proprídio - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), será incubado após 48h de experimento (5µl por poço – durante 15 minutos no escuro). Visto que o PI é um corante impermeável em mebranas plasmáticas íntegras, este composto é capaz de marcar somente células não viáveis. As imagens deste ensaio serão obtidas no microscópio óptico de fluorescência automatizado (In Cell -  GE Healthcare Life Sciences), para posterior análise no software InCell Analyser 2000. Este mesmo experimento também permitirá a análise de micronúcleos (através da marcação com Hoescht) utilizando o módulo "micronúcleos" no software Incell Analyzer. A análise de citotoxicidade também será executada através do ensaio de MTT (Teste de citotoxicidade pelo método direto) que é um dos testes- chave da ISO. Após 48h de tratamento, será adicionado a solução MTT (5mg/ml em PBS). Durante 4 h as células foram incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Posteriormente, será adicionado 150ul por poço de solvente MTT (1:1 de DMSO em isopropanol), a placa coberta com papel alumínio será levada para o agitador orbital por 15 minutos e a leitura será realizada na absorbância de 590nm com filtro de referência de x = 620 nm, espectrofotômetro TECAM (Infinite® 200 PRO series). Os controles foram realizados pela adição do veículo de cada droga, no caso DMSO.
	A avaliação da viabilidade celular também pode ser dada por avaliaçao da atividade mitocondrial que pode ser observada pelo potencial mitocondrial e pela produção de radicais livres de oxigênio. O potencial de membrana pode ser avaliado através da utilização do kit JC1 (ThermoFisher), que tem capacidade de marcar de modo diferencial (verde e vermelho) mitocondrias ativas e inativas. Já a produção de radicais livres será avaliada através da utilização do kit de detecção de Ros (Thermo Fisher). Essas marcação pode ser imageada e analizada com a utilização do equipamento InCell e do software InCell Analyzer. Dada a já conhecida relação entre modificações na dinâmica do citoesqueleto de actina com o aumento da produção de ROS pela mitocondria (o que leva a morte celular), investigaremos modificações nestes microfilamentos através da utilização de um marcador de polímeros de actina (faloidina) ligado a um marcador fluorescente, de modo que estes eventos possam ser imageados utilizando o microscópio Incell Analyzer e a área das células será analizada pelo software InCell Analyzer. Para avaliaç~es de modificações do citoesqueleto as amostras serão observadas em microscópio confocal ou de super resolução. 
4.5 Avaliação dos Possíveis Tipos de Morte Celular gerados pelo tratamento: Para observar e diferenciar os tipos de morte celular geradas pelo tratamento com os compostos, as células tratadas serão incubadas com o Kit ClickiT Tunel Alexa Fluor 488nm (ThermoFisher) de acordo com o fornecedor. Este kit será capaz de, após imageamento e análise no software Incell, estimar o número de células em apoptose e necrose após o tratamento com os compostos. Para análise do evento de morte por autofagia será utilizado o kit LC3B para autofagia (ThermoFisher) e o número de céluas nesta condição também será estimado através de análise no software Incell Analyzer. 
4.6 Avaliação de modificações ultraestruturais por microscopia eletrônica de transmissão 
Com o objetivo de avaliar a ultraestrutura de células tratadas com diferentes compostos As amostras serão fixadas em solução contendo glutaraldeído 2.5% (SigmaAldrich) em tampão cacodilato de sódio 0.1 M (pH 7.2) e formaldeído nascente 4% (Electron Microscopy Science - EMS), pH 7.4. O material será lavado em cacodilato de sódio 0.1M pH 7.2, pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, ferrocianeto de potássio 1,25% e cloreto de cálcio 5mM no mesmo tampão. Logo após, o material será desidratado com séries crescentes de acetona (30% a 100%) seguida de infiltração em resina epóxi, na proporção de 2 partes de acetona para 1 de resina; 1:1 acetona/resina, 1:2 acetona/resina, resina pura seguido de polimerização, microtomia, contrastação e observação em Microscópio Eletrônico de Transmissão FEI SPIRIT (120Kv).
5 PRODUTOS ESPERADOS
	
O presente estudo tem como produtos esperados uma tese de doutorado, um relatório técnico, e pelo menos um artigo científico publicado em revista indexada.
6 CRONOGRAMA
	ATIVIDADES
	Período de Execução (trimestres) 1° ano
	Período de Execução (trimestres) 2° ano
	
	1°
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6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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