Biotécnicas aplicadas a reprodução animal Cap. 12-13

Prévia do material em texto

seleção.Essa metodologiaé denominada
"seleçãoassistidapormarcadores"(doinglês
MarkerAssistedSelection- MAS) etambém
permitea seleçãoparacaracterísticaslimi-
tadaspelosexo.Um exemploclássicoéase-
leçãodetourosvisandoo melhoramentoda
produçãoleiteira,característicaque,eviden-
temente,sóvaiserexpressanaprolefe~ini-
na.Marcadorestambémpossibilitamo mo-
nitoramentodecaracteresemprocessosde
introgressão(introduçãodegenesespecífi-
cosnumaraçaou população).
Comojáfoi referidoanteriormente,aefi-
ciênciada seleçãoassistidapor marcadores
dependedaproximidadenocromossomoen-
treopolimorfismoeacaracterísticainvestiga-
da.Nessesentido,osmapasdeligaçãosãode
extremaimportânciae têmsidopublicados
paraasprincipaisespéciesdeanimaisdomés-
ticos(verhttp://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/
bovrnap/livestock.pl).Embovinos,essesma-
pasjápermitiramaidentificaçãodelocosrela-
cionadosàproduçãodeleite;emovinos,para
fecundidadeeemsuínosparaidentificaçãode
fatoresdecrescimento,gorduraeresistência
adoenças.Inicialmenteessesmapasenfren-
taramlimitaçõesdevidoasuabaixadensidade.
Atérecentementeamédiadeintervaloentre
marcadoresexcedia5cM emsuínose 10cM
embovinose ovinos.Contudo,embovinos
ummapadealtaresoluçãojáestádisponível,
tendoemmédiaumintervalode2,5cM oque
aumentaaeficiênciaparadetecçãodeQTLs.
Alguns Marcadores em Aplicação
nas DiferentesEspécies
Associadosa Doenças
BLAD
BLAD(Kehr1i,1990)éasiglaeminglês
dedeficiênciadeadesãodeleucócitosem
bovinos(Bovineleukocyteadhesiondeficien-
cy).Éumadoençaqueafetaprincipalmente
certaslinhagensdegadoholandês(Ivanhoe)
e quepossuiumequivalenteemhumanos
denominadoDeficiênciadeAdesãodeLeu-
274
cócitosemHumanos.É causadaporuma
mutaçãoquealteraumreceptordeproteí-
nasdosleucócitosdemodoaimpedi-Iosde
seancorarnossítiosdeinfecçãoe conse-
qüentementedecombatê-Ia.Emconseqüên-
cia,osanimaisafetadosnãoconseguemres-
ponderadequadamentea infecçõesquese
tornampersistentesourecorrentes.O diag-
nósticodosheterozigotoséfeitoporPCR-
RFLP (GarciaetaI.,1996)
DUMPS
A Uridinamonofostatosintetase(UMFS)
éaenzimaresponsávelpelaconversãodoacido
oróticoparauridinamonofosfato(UMF), que
éumcomponenteessencialdosnucleotídeos
pirirnidínicos.Estaenzimatemduasfunções
conhecidas:fosforibosiltransferase(OFRTase)
e orotidina monofostatodescarboxilase
(OMFDCAse), correspondendoaosdoisúl-
timospassosdasíntesedaspirimidinas.Con-
siderandoqueas pirimidinassão compo-
nentesvitaisdosácidosnucléicos,adeficiên-
ciadeUMFS temconseqüênciasseveras.Essa
deficiência,embovinos,é responsávelpor
umadoençacompadrãodeherançaautossô-
rnicarecessivaquecausamortalidadeembrio-
nária.(Robinsonetal.,1983).A detecçãodos
portadorespode ser feitapor PCR-RFLP
(PolietaI., 1996).
PSSemSuínos
A síndromedo Stressdesuínos(Porcine
StressSyndrome)ou HipertermiaMalignaé
umadesordemhereditáriaautossôrnicareces-
sivacompenetrânciaincompleta(Eikelenbamm
& Minkena,1974).Osanimaisafetadosapre-
sentam,sobcondiçõesdeestresseouexposição
aalgunsagentesquímicos(halotano,hidrocar-
banofluorinadoesuxametônio),umquadroca-
racterizadoporrigidezmuscular,dispnéia,hi-
pertermiaemorteprematura.
No iníciodadécadade70,foi introduzido
umtesteparadetectarportadoresdogeneda
PSS quesebaseavanaexposiçãodosanimais
aohalotano(Nelsonetal.,1974).Osanimais
susceptíveisapresentavamossintomasdescri-
tosacimaeoexamedeviaserinterrompidoaos
primeirossinaisderigidezmuscularsobpena
delevaros animaisàmorte.Posteriormente,
descobriu-sequeo genedaPSS fazpartedo
grupode ligrçãodo cromossomo6, muito
próximodosgenesdaPHI (FosfoexoseIsome-
rase),PGD (FosfogliconatoDesidrogenase),
P02(Pós-albumina2)edosgenesH eS,envol-
vidosnadeterminaçãodeantígenoseritroci-
tários(V6geli,1989).OsgenesdaPHI, PGD
e P02apresentavamdesequihôriode ligação
como genedaPSS emdiversaspopulações,
o quepermitiaa discriminaçãodosheterozi-
gotoscomumaeficiênciadeaté95%(Gahne
& Juneja,1985).Maisrecentementeestabele-
ceu-seumtestebaseadoemPCR-RFLP (USA
PatentNumber:05358649*)que,deummodo
rápidoeeconômico,conseguedetectaroshe-
terozigotoscom100%deprecisão.
"Overogene"emEqüinos
O geneletalemoverosbrancos(doinglês
LethalWhiteOvero- LWO) éherdadodefor-
maautossômicae,quandoemheterozigose,
normalmenteproduzumpadrãodepelagem
bastanteatrativoparaoscriadoresdenominado
"overo"(Scneider& Leipold,1978).Quando
ogeneapresenta-seemhomozigose,ospotros
apresentamalteraçõesnotratogastrintestinal
quefatalmenteoslevamà morte.Atémuito
recentementenãoexistiammétodosprecisos
dediagnósticodeportadores.Entretanto,a
partirdalocalizaçãodogenefoidesenvolvido
um testebaseadonumPCR ateioespecífico
(ASPCR) quepermiteaperfeitadiscrimina-
çãodosanimaisportadores.Dessaforma,é
possívelorientaros cruzamentosdemodoa
evitara homozigosidadedogeneou mesmo
eliminá-Iodealgumaslinhagens.
SClD
A imunodeficiênciaseveracombinada
(SCID - SevereCombinedImmunodeficien-
* http:jjwww.nalusda.govjbicjBiatech_Patentsj1994patentsjO5358649.html
cy) é umadoençaqueafetaprincipalmente
cavalosárabes.Temherançaautossômicare-
cessivae deve-sea umadeleçãode 5 pares
debasesnogenequecodificaaunidadecata-
líticada proteínaquinaseDNA-dependente
(McGuire& Poppie,1973).Osestudosindi-
camquecercade 18- 25%dapopulaçãode
cavalosárabesé portadorado gene(Poppie
& Mcguire,1997;Bernoco& Bailey,1998).
Umaconseqüênciaóbviaeraograndeprejuí-
zo, considerando-sequeos potrosafetados
morremnoprimeiroanodevida,nãoobstante
asdespesascomtratamento.Em 1997,uma
companhiadenominadaVetGen (http://
www.vetgen.comj)anunciouacomercializa-
çãodeumtesteparaadetecçãodeportadores.
A partirdeentão,hápossibilidadedeorientar
oscruzamentosevitando-osentreanimaishe-
terozigotose,conseqüentemente,permitindoa
eliminaçãopotencialdaocorrênciadeafetados.
Marcadores Associados a
Características Produtivas
Kappacaseína
Doisalelossãocomumenteobservadosno
locodaKappacaseínanasraçasdebovinos
leiteiros:A eB. Há indicativosdequeosani-
maisportadoresdoateioB produzemumleite
comcaracterísticasindustriaisemaisadequa-
dasaofabricodequeijodoqueosanimaiscom
o ateioA (Schaar,1984;Schaaretal.,1985).
Dentrodeumafamíliadetourosdaraçaholan-
desadosEstadosUnidos,osfIlhosquerecebe-
ramoaleloBapresentaramumaPTAparaleite
185kgmaisaltadoqueosfIlhosquerecebe-
ramo ateioA (Funk,1992).Existemgrandes
diferençasraciaisnasfreqüênciasdosalelosde
Kappacaserna.A freqüênciado ateioB varia
de3%noHolandêsaté74%no Jersey.
BetalactoGlobulina
Doisalelossãocomumenteobservados
nolocodabetalactoglobulinacaseínanas
raçasdebovinosleiteiros:A e B. Observa-
275
çõesdentrodefamíliasdetourosholandeses
nosEstadosUnidosdemonstramquefIlhos
querecebemo aleloA têmmaioresPTAs para
leite(+160kg)eproteína(+ 6kg),entre-
tantotêmumamenorproduçãodegordura
comparadoa filhosquerecebemo aleloB
(Funk,1992).
o GeneBooroola
O geneBooroola(FecB =FecundityBoo-
roola)éorigináriodeumalinhagemdeMe-
rinoAustralianodaqualherdouo nome.É
um geneprincipaldeherançasimplesque
afetaataxaovulatóriadeovinose,conseqüen-
temente,onúmerodecordeirosnascidospor
parto.A detecçãodasportadoraséfeitaatra-
vésda mensuraçãodas taxasovulatórias.
Fêmeascomtaxas< 3sãoconsideradas++,
< 5sãoF+ e > 5 sãoconsideradashomozi-
gotas(FF). Em funçãodisso,adetecçãode
portadoresécaraedemorada,principalmente
paraadiscriminaçãodemachosportadores,
ondesefaznecessárioumtestedeprogênie.
Deummodogeral,pode-seafIrmarquecada
cópiadogenelevaaonascimentodeumcor-
deiroadicional.No MerinoBooroola,asfê-
measquenãopossuemnenhumacópiado
geneproduzemnormalmenteapenasum
cordeiro/parto,as heterozigotasdois e as
homozigotastrês(Piperetal., 1984).
Porsetratardeumúnicogenecomgrande
efeitonareprodução,háinteressedesuaintro-
duçãoemoutrasraçasemesmoespécies.Em
1996,aAgResearchdaNovaZelândia,anun-
ciouadescobertadeumtestemolecularpara
adetecçãodogene.Essetesteéaplicadopor
umaempresadenominadaGenomnz.
Manejo de RecursosGenéticose a
Conservaçãode Espéciese Raças
A domesticaçãoe posteriorcriaçãodeanimaisdomésticosforameventosqueala-
vancaramodesenvolvimentosócio-econômi-
codahumanidadeesuaimportânciaperma-
276
necemuitograndeatéhoje.Estimativasdão
contadequeatualmenteosanimaisdomés-
ticossãoresponsáveis,diretaouindiretamen-
te,pelosuprimentodecercade30%deto-
dasasnecessidadeshumanasno tocantea
alimentaçãoeagricultura.A FAO defineco-
rno recursogenéticoanimal"aquelasespé-
ciesanimaisque sãoutilizadas,ou podem
serutilizadasparaaproduçãodealimentos
ouparaaagriculturaeaspopulaçõesqueas
compõem.Essaspodemserclassificadasco-
mopopulaçõesselvagens,populaçõeslocais,
raçasdefinidas,linhagensselecionadase
qualquermaterialgenéticoconservado".
Observa-sequeo termo"recursogenético"
contemplapraticamentetodaagamadeva-
riaçãogenéticapossível.
Existemraçase espéciesadaptadasaos
maisvariadosecossistemas,desdeeqüinos
adaptadosàsplaníciesalagadasdoPantanal
atéIaquesadaptadosao climainóspitodas
montanhasdo Himalaia.Cadapopulação,
adaptadaa um diferenteambiente,temum
grandepotencialestratégicoesuamanuten-
ção e preservaçãosão fundamentais,pois
umavezqueumaraça/espéciesejaextinta,
nãohaverámaispossibilidadesderecompô-
Ia.Estimativasindicamaexistênciadecerca
de3882 raçasde28 espéciesdeanimais
domésticos,cercade30%dasquaisestãoem
viasdeextinção(FAO,2001).
Freqüentementeobservam-secompara-
çõesentreaeficiênciaprodutivaderaçaslo-
caisadaptadasaambientesrestritivoseraças
modernascriadasemsistemasaltamentetec-
nificados.É previsívelqueseobserve,então,
umdesempenhomuitomodestodasprimeiras
quandocomparadascomasraçasespecializa-
das.Essetipodegeneralizaçãotemlevado,
muitasvezes,àintroduçãodesordenadadera-
çasmodernasaltamenteespecializadase a
substituiçãoe mesmoextinçãodasraçaslo-
caisadaptadassempreocupaçãocomaperda
derecursosgenéticos.
Enquantoasraçasnativasenfrentamris-
codeextinção,asraçasmodernastêmen-
frentadoumproblemanãomenospreocu-
pante:areduçãodavariabilidadegenética.
A utilizaçãomaciçadebiotecnologiastais
comoainseminaçãoartificialetransferên-
ciadeembriões,queporumladopermiti-
ramgrandesavançoszootécnicos,'porou-
trotemlevadoa \fmaperigosareduçãono
repertóriodosgenesdealgumasraçaspelo
usoindiscriminadodepoucosreprodutores
considerados"excepcionais".Comoembo-
vinos,apecuáriadeleiteéa maiorconsu-
midoradetecnologiasdeponta.Esseseg-
mentoéo queprimeiroestáexperimentan-
doosproblemasdecorrentesdaconsangüi-
nidade,conseqüênciadareduçãodosesto-
quesgenéticos.Sãorelatadassituaçõesocor-
ridasemalgunspaísesdaEuropaemque,
numdeterminadomomento,25%detodas
asinseminaçõesrealizadashaviamsidoefe-
tuadascomo sêmendeumúnicotouro.
Namedidaemquetornamososanimais
easplantasmaishomogêneospelaredução
davariabilidadegenética,estamoslimitan-
doasoportunidadesdeseleçãoparacaracte-
rísticasquepossamviraserimportantesno
futuro.Muitasdasespéciesdeplantaseani-
maisdomésticosaindanãoforamcaracteri-
zadaseestudadaspelaciênciamoderna,en-
tretantopodemfornecermateriaisquetraba-
lhadospelastécnicasmolecularespoderão
aumentaraprodutividadenofuturo.A pre-
servaçãoderaçaslocaisaltamenteadapta-
daséumaestratégiavitalparagarantirosu-
cessodosprogramasdeseleçãoemlongo
prazo.Alémdisso,éimportanteconsiderar
queascaracterísticasrelacionadasaadapta-
çãoemambientesespecíficossãomuitomais
difíceisdemediremodificarqueaschama-
dascaracterísticasprodutivas.A manuten-
çãodadiversidadeéfundamentalparaman-
terumareservadegenesquepossamseruti-
lizadossemprequehouveranecessidadede
melhoramentoderaçasexistentesoudesen-
volvimentode novasraças,quersejapara
atenderanovasdemandasdomercado,quer
sejaparasuperardesafiosimpostospeloam-
biente,taiscomoalteraçõesclimáticasou o
surgimentodenovasdoenças.
Considerações Finais
A utilizaçãode marcadoresgenéticosé
umaferramentacomimensopotencial,quer
sejaparapesquisabásicaouparacaracteriza-
çãodepopulaçõesepreservaçãoderecursos
genéticos,quersejaparatécnicasaplicadas
aomelhoramentoesanidadeanimal.Adicio-
nalmente,o aprofundamentodosconheci-
mentosdaorganizaçãogenéticanasespécies
deanimaisdomésticoseselvagenspodeforne-
cersubsídiosfundamentaisparaoaprimora-
mentodacompreensãodabiologiaanimale,
porextensão,dossereshumanos.Astecnolo-
giasgeradaspelaspesquisasgenômicasterão
umimpactodifícildesermensuradoemprati-
camentetodososcamposrelacionadosàpro-
duçãoanimal,dasanidadea reprodução,re-
volucionandodessaformaaclínicaveterinária
eos sistemasdeprodução.
ReferênciasBibliográficas
ARRANZ,T.T.,BAYON,Y.,SANPRIMITIVO,F.
Comparisonofproteinmarkersandmicrosa-
tellitesindifferentiationofcaulepopulations.
Anim.Genet.,v.27,n.5,pAI5-419,1996.
BERNOCO,D., BAILEY,E. Frequencyof the
SCIOgeneamongArabianhorsesintheUSA.
AnimalGenetics,v.29,n.l, pAI-42, 1998.
COMINGS,D.E., GADE,R.,MACMURRAY,
T.P.,etai.Geneticvariantsofthehumanobe-
sity(OE)gene:Associationwithbodymass
indexinyoungwomen,psychiatricsymptoms,
andinteractionwiththedopamineD-2recep-
tor(DRD2)gene.MolecularPsychiatry,v.l,
nA, p.325-335,1996.
COMINGS,D.E.Polygenicinheritanceandmi-
cro/minisatellites.MolecularPsychiatry,v.3,
n.l, p.21-31,1998.
277
DAVIS,G.P.Geneticparametersfortropicalbeef
cattleinnorthernAustralia- areview.Austra-
lianfournalofAgriculturalResearch,v.44,
n.2,p.179-198,1993.
ElKELENBOOM,G.,MINKENA,D. Prediction
ofrale,soft,exudativemusclewithanonlethal
testforhalothane-inducedporcinemalignant
hyperthermiasyndrome.TijdschriftVoar
Diergeneeskunde,v.99,n.8,p.421-426,1974.
FAO.In:DAD-IS 2.DomesticAnimalDiversity
InformationSystem.Roma,Italia:Foodand
AgricultureOrganizationof theUnitedNa-
tions,2001.Disponívelem<http://dadJao.
Q[g>.Acessoem:2Aug.2001
FUNK, D. In: GeneticsTechnologiesin the
1990s.CollegePark,MD: UniversityofMa-
ryland,1992.Disponívelem<http://www.
inform.umd.edu/EdRes/Topic/AgrEnv/ndd/
genetics/GENETICTECHNOLOGIES IN
THE 1990S.html>.Acessoem:2Aug.2001
GAHNE,B.,JUNEJA,RK. Predictionoftheha-
lothane(HAL)genotypesofpigsbydeducing
HAL, PHI, PO2,pgdhaplotypesofparents
andoffspring-resultseramalarge-scaleprac-
ticeinswedishbreeds.AnimalBloodGroups
andBiochemicalGenetics,v.16,n.4,p.265-
283,1985.
GARCIA,J.E, GURGEL,ASA., VISINTIN, J.
A, etai.UtilizaçãodemarcadoresdeDNA
paraodiagnósticogenômicodeanimaisdo-
mésticos:1.Detecçãodemutaçãopontual
causadoradaDeficiênciadeAdesãodeLeu-
cócitosBovinos(BLAD)emgadoHolandês
noBrasil.BrazilianfoumalofVeterinaryRe-
searchandAnimalScience,v.33,n.3,p.133-
135,1996.
GILLHAM,N.w.OrganelIegenesandgenomes,
NewYork: OxfordUniversityPress,1994.
424p.
GRODZICKER,T, WILLIAMS, J., SHARP,P.,
etaI.Physicalmappingof temperature-sen-
sitivemutationsofadenoviruses.ColdSpring
Harb.Symp.Quant.Biol,v.39Pt 1,p.439-
446,1975.
HINES,H.C.Bloodgroupsandbiochemicalpo-
lymorphisms.[n.FRIES,R, RUVINSKY,A.
Thegeneticsofcattle.Wallingford:CABIn-
ternational,1999.Cap.5.p.77-121.
278
HUNTER,RL., MARI<ERT,C.L.Histochemical
demonstrationofenzimesseparatedbyzone
gelelectrophoresisin starchgels. Science,
v.125,p.1294-1295,1957.
KAPPES,S.M.,KEELE, J.w.,STONE,RT.,et
aI.A second-generationlinkagemarof the
bovinegenome.GenomeResearch,v.7,n.3,
p.235-249,1997.
KFJ-IRLI, M.E., SCHMALSTIEG, EC., AN-
DERSON,D.C.,etaI.Moleculardefinition
of thebovinegranulocytopathysyndrome-
identificationof deficiencyof theMAC-l
(CDIIB/CDI8) glycoprotein.American
fournalofVeterinaryResearch,v.51,n.ll,
p.1826-1836,1990.
KOOTS,K.R, GIBSON,}.P.,SMITH, C.,etaI.
Analysesofpublishedgeneticparameteres-
timatesforbeefproductiontraits.1.heritabi-
lity.AnimalBreedingAbstracts,v.62,n.5,
p.309-338,1994.
MCGUlRE, TC., POPPIE, M.}.Hypogamma-
globulinemiaandthymichypoplasiainhorses
- primarycombinedimmunodeficiencydisor-
der.InfectionandImmunity,v.8,n.2,p.272-
277,1973.
MULLIS, K.B.,FALOONA,EA Specificsyn-
thesisofDNAinvitroviaapolymerasecataly-
zedchainreaction.MethodsinEnzymology,
v.155,p.335-350,1987.
NAKAMURA,Y.,LEPPERT,M.,O'CONNELL,
P.,etaI.Variablenumberof tandemrepeat
(VNTR)markersforhumangenemapping.
Science,v.235,n.4796,p.1616-1622,1987.NELSON,TE., fONES,E.w.,HENRICKSON,
RL., etaI.Porcinemalignanthypertermia.
Observationsontheoccurrenceofvale,soft,
exudativemusculatureamongsusceptible
pigs. Americanfournalof VeterinaryRe-
search,v.35,n.3,p.347-350,1974.
NICHOlAS,Ew.Veterinarygenetics,NewYork:
OxfordUniversityPress,1987.580p.
OLIVElRA,}.E C.Caracterizaçãodeperfisfisio-
lógicosemarcadoresmolecularesemfêmeas
Brangus-ibagecomdistintosgrausdeferti-
lidade.SantaMaria,2000.63p.TeseDou-
toradoemMedicinaVeterinária- Programade
Pós-graduaçãoemMedicinaVeterinária,Uni-
versidadeFederaldeSantaMaria,2000.
PIPER L.R, BINOON,B.M.,OAVlS,G.WThe
singlegeneinheritanceoftheprolifieityofthe
BoorolaMerino.In.lANO,RB.,ROBINSON,
O.WThegeneticsofreproductioninsheep.
London:Butterworths,1984.p.115-125.
POLI, MA, OEWEY,R, SEMORILE,L.,etai.
PCRscreeningforcarriersofbovineleukocyte
adhesiondefieiency(BLAD)anduridinemo-
nophosphatesynthase(OUMPS)inArgenti-
neHolsteincattle!.JournalOfVeterinaryMe-
dicineSeriesA-ZentralblattFurVeterinar-
medizinReiheA-PhysiologyPathologyCli-
nicalMedicine,v.43,n.3,p.163-168,1996.
POPPIE,M.J.,MCGUIRE, TC. Combinedim-
munodefieiencyin foalsofarabianbreeding
-evaluationofIDadeofinheritanceandesti-
mationofprevalenceofaffectedfoalsandcar-
riermaresandstallions.JournaloftheAme-
ricanVeterinaryMedicalAssociation,v.170,
n. 1,p.31-33,1977.
ROBINSON, J.L., ORABIK, M.R., OOM-
BROWSKI,O.E.,etaloConsequencesofump
synthasedeficiencyincattle.Proceedingsof
theNationalAcademyof Sciencesof the
UnitedStatesofAmerica-BiologicalScien-
ces,v.80,n.2,p.321-323,1983.
SCHAAR,J. Effectsofkappa-caseingenetic-va-
riantsandlactationnumberontherenneting
propertiesofindividualmilks.JoumalofDairy
Research,v.51,n.3,p.397-406,1984.
SCHAAR,J., HANSSON,E., PETTERSSON,
H. E.Effectsofgenetie-variantsofkappa-ca-
seioandbeta-lactoglobulinoncheese-ma-
king.Joumalof DairyResearch,v.52,n.3,
p.429-437,1985.
SCHNEIDER,J.E.,LEIPOLO,H.WRecessivele-
thalwhitein2foals.JournalofEquineMedi-
cineandSurgery,v.2,n.11,p.479-482,1978.
SCHROTH,G.P.,CHOU,p.J.,HO,P.S.Mapping
Z-ONA in thehumangenome- computer-
aidedmappingrevealsanonrandomdistribu-
tionofpotentialZ-ONAformingsequencesin
humangenes.JoumalofBiologicalChemis-
try,v.267,n.17,p.11846-11855,1992.
SMITHIES, O. Zoneelectrophoresisin starch
gels:groupvariationin theserumprateioof
normalhumanadults.BiochemicalJournal,
v.61,p.629-640,1955.
STRACHAN,R, REAO,AP.Humanmolecular
genetics,Oxford:BiosSeientific,1996.596p.
TAUTZ,O.Notesonthedefinitionandnomen-
datureoftandemlyrepetitiveONAsequences.
In. PENA,S.O.J., CHAKRABORTY,J.T.,
EPPLEN,J.T,etai.DNAfingerprinting:sta-
teof thescience.Switzerland:Birkhãuser
VerlagBasel,1993.p.21-28.
VOET,O.,VOET,J.G.Biochemistry,2ed.New
York: JohnWiley& SonsInc,1995.1361p.
VOGELI, P.PositionofthePHI andPO2loeiin
theHAL linkagegroupinpigs.GeneticsSe-
lectionEvolution,v.21,n.2,p.119-126,1989.
WALKLEY,J.RW, SMITH, C.Theuseofphy-
siologicaltraitsingeneticselectionforlitter
sizeinsheep.Journalof Reproductionand
Fertility,v.59,n.1,p.83-88,1980.
WALLACE,O.C.1994WilliamAllanAward
Address.MitochondrialONAvariationinhu-
mauevolution,degenerativedisease,and
aging.Am.J. Mum.Genet.,v.57,n.2,p.201-
223,1995.
WALLACE,O.C.,LOTT,M.T,BROWN,M.O.,
etai. In: CUTICCHIA, A J. Humangene
mapping1995:acompendium.Atlanta,GA,
USA:CenterforMolecularMedieine,Emory
University,1995.Disponívelem<h1i1TIL
www.gen.emory.edu/mitomap.html>.Aces-
soem:30Aug.2001
WATSON,J.O.;KRICK,EH.C.Molecularstruc-
tureofnudeicacid.Astructurefordeoxyribose
nudeieaeid.Naturev.171,p.737-738.1953.
WELSH,J.,MCCLELLANO,M. Fingerprinting
genomesusingPCR witharbitraryprimers.
NucleicAcids Res.,v.18,n. 24,p.7213-
7218,1990.
WILLIAMS, J.G.,KUBELIK,AR, LIVAK,K.J.,
et ai. ONA polymorphismsamplifiedby
arbitraryprimersareusefulas genetic
markers.NucleicAcidsRes.,v.18,n.22,
p.6531-6535,1990.
WYMAN,AR, WHITE,R Ahighlypolymorphic
locusinhumanONA Proc.Nad.Acad.Sci.
USA, v.77,n.11,p.6754-6758,1980.
279
Capítulo13
Clonagem Anim.al
# por TransferênciaNvclear
VilceuBordignon,LawrenceC Smith
Introdução
Clonesoucópiasidênticasdeindivíduos
podematualmenteserproduzidosgraçasà
evoluçãodatecnologiadetransferêncianu-
clearoureconstruçãoembrionária.A produ-
çãodeclonesé degrandeinteressenãosó
paramelhoramentogenético(produçãoani-
mal),mastambémparaabiotecnologia,para
abiomedicina,bemcomoparadiversasáreas
dapesquisafundamental(Colleau,1992;Di-
berardino,1997;Wilmut,1998;Trounson&
Pera,1998;Zawadaetal., 1998;Campbell,
1999;Gurdon & Colman,1999;Kikyo &
Wolffe,2000).
Mesmoqueindivíduosidênticospossam
serproduzidospelabipartiçãodeembriões
ouaindapelaseparaçãodosblastômerosde
embriõesnosestádiosiniciaisdodesenvolvi-
mento,o númerodeclonesobtidosémuito
restrito.Essalimitaçãopode,noentanto,ser
superadapelareconstruçãodeembriões,isto
é,pelatransferênciadenúcleosdecélulasdoa-
dorasparao interiordeoócitosenucleados.
Essesoócitoscontêmascondiçõesnecessárias
paraquenúcleosprovenientesdecélulasem-
brionárias(Willadsen,1986;Campbelletal.,
1996a),fetais(Cibellietal.,1998)ou,atémes-
mo,deanimaisadultos(Wilmutetal.,1997;
WakayamaetaI., 1998)possamreiniciaro
desenvolvimentoembrionárionoestádiode
zigotoedarorigemaindivíduosnormais,pos-
sibilitandoassimaproduçãodemuitascópias
deum mesmoanimal.
O principalobjetivodopresentecapítulo
édescreveralgunsaspectosimportantesrela-
cionadosàproduçãodeembriõesportrans-
ferêncianuclear.Maiorênfaseserádadaao
relatodaevoluçãodatecnologia,nadescri-
çãodosmateriaiseprocedimentosutilizados
paraa reconstruçãodosembriõesnaapre-
sentaçãodosprincipaisresultadosobtidose
nadiscussãodospossíveisfatoresqueinter-
feremnaeficiênciadestatecnologia.
Históricoe Evolução
A transferêncianuclearfoi inicialmente
propostaporSpemann(1938)comoinstru-
mentoparaoestudodaequivalêncianuclear,
istoé,paradeterminarseacromatinasofreria
algumtipodemodificaçãoduranteadiferen-
ciaçãocelular.Foinecessáriomaisdeum
quartodeséculoatéqueBriges& King (1952)
realizassemcomsucessoaprimeiratrans-
ferêncianuclearemanfíbios.Numerosose
aprofundadosestudosforamconduzidosuti-
lizandooanfíbiocomomodeloanimal(para
281
maisinformaçõesver Diberardino,1980;
Gurdon,1986;Diberardino,1997).Esses
estudospossibilitaram,já na décadade60,
a produçãode clonesapósa transferência
denúcleosprovenientesdecélulasintestinais
retiradasderãsnoestádiodelarva(Gurdon
& Uehlinger,1966).Mesmoqueosexperi-
mentoscomanfíbiostenhamcontribuídopara
o esclarecimentodemuitasquestõesfunda-
mentais,atéopresenteaindanãoexistemre-
latosdaclonagemdeanfíbiosadultos(Dibe-
rardino,1997).Apesardequeumaresposta
precisaparaestaquestãoaindapermaneça
desconhecida,épossívelqueosprocedimen-
tosutilizadossejamincapazesdereprogra-
marasmodificaçõesestruturaissofridaspela
cromatinaduranteoprocessodediferencia-
çãocelular(Kikyo& Wolffe,2000).As inte-
raçõesqueseproduzementreosnúcleosdoa-
doreseos citoplasmasreceptores,bemco-
mo os possíveismecanismosenvolvidosna
reprogramaçãodacromatinatransplantada,
serãomelhordiscutidosulteriormente.
Nos mamíferos,o primeirosucessocom
transferêncianuclearfoi obtidoemcamun-
dongosporIllmensee& Hoppe(1981).En-
tretanto,afaltaderepetibilidadedosresulta-
dosporoutrosgruposdepesquisa,associado
aosresultadosobtidosporMcgrath& Solter
(1984)mostrandoainibiçãonodesenvolvi-
mentodosembriõesreconstituídoscomnú-
cleosprovenientesdeembriõesapóso está-
dio de2 células,sugeriamquea clonagem
de mamíferosseriauma conquistapouco
provável.Considerandoqueo estádiode2
célulasnocamundongocoincidecomo iní-
ciodaatividadedetranscriçãoou ativação
do genoma embrionário (Flach et aI.,
1982),umaexplicaçãoplausívelparao in-
sucessofoi adequeestadiferenciaçãofun-
cionaldacromatinajáseriaumfatorlimitan-
teparaa clonagem.
Os primeirosresultadosanimadorespara
o sucessodaclonagememmamíferosforam
282
obtidosemovinosporWilladsen(1986),que
obteveonascimentodevárioscordeirosapósa transferênciadenúcleosoriundosdeem-
briõesnoestádiode8a 16células.Tendoem
vista,quenestaespécieo iníciodaatividade
transcripcionalembrionáriaocorrenoestádio
de8 células(TelfordetaI.,1990),osresulta-
dosdeWilladsenmostraramquea ativação
dogenofnaembrionáriopoderianãoseruma
limitaçãoparaa clonagemnos mamíferos,
conformesugeridopelosresultadosobtidos
nocamundongo.Outrosestudoscombovinos
(PratheretaI.,1987),coelhos(Stice& Robl,
1988)esuínos(Pratheretal.,1989)confir-
maramemoutrasespéciesosresultadosobti-
dosporWilladsen.
Outro avançodecisivoparaa clonagem
nosmamíferosfoi obtidopor Smith& Wil-
mut(1989),mostrandoquemesmonúcleos
provenientesdecélulasdobotãoembrionário
deembriõesnoestádiodeblastocistomanti-
nhamopotencialparareiniciarodesenvolvi-
mentoembrionárioepermitiro nascimento
deanimais.Essesresultadosabriramnovas
perspectivasparaa utilizaçãode linhagens
celularesorigináriasdobotãoembrionárioou
"stemcells"comodoadorasdenúcleo,oque
garantiriaumafonteilimitadadenúcleospara
a produçãodeclones.Foramos estudosde
CampbelletaI.,(1996a)quemostraramque
núcleosderivadosdelinhagenscelularesem-
brionáriasmantinhamopotencialparasupor-
tarodesenvolvimentoatermo.Devidoaolon-
gotempoemculturaeasignificantemudan-
çamorfológicadascélulas,essesresultados
sugeriamquemesmocélulascompletamen-
tediferenciadaspoderiamserusadaspara
a clonagemde animais.Essa hipótesefoi
confirmadaporWilmutetaI. (1997)quan-
dodonascimentodaovelhaDolly,produto
deumnúcleoorigináriodeumacéluladete-
cidomamárioretiradadeumanimaladulto.
Os avançosobtidos,principalmenteem
ovinos,bovinosecoelho,estimularamarea-
lizaçãode novastentativasparaclonagem
noscamundongos.Os primeirosresultados
vieramdosestudosdeCheongetalo(1993),
mostrandoo nascimentodeanimaisapóso
transplantedenúcleosprovenientesdeem-
briõesno estádiode 8 células.Mais tarde,
comalg\fl11asmodificaçõesnatécnica,que
incluiapassagemdosnúcleospordoiscito-
plasmas,ou seja,umatransferênciaparao
oócitoreceptoreapósalgumtempoumare-
transferênciaparaoutro oócito. Kwon &
Kono (1996)obtiveramo nascimentode6
clonesapósotransplantede8núcleos.Tsuno-
da& Kato (1998)mostraramemseguida,
quenãosóosnúcleosprovenientesdecélulas
dobotãoembrionário,mastambémdecélu-
Iasdotrofectodermamantinhamopotencial
parareiniciaresuportarodesenvolvimento.
Finalmente,WakayamaetaI. (1998)clona-
ramváriasgeraçõesdecamundongostrans-
plantandonúcleosorigináriosdascélulasdo
cumulusoophorus,asquaisjáseencontram
emestádiofinaldediferenciação.Essesre-
sultadosextraordinárioscomprovamque,
emboraadiferenciaçãocelularpossareduzir
o potencialdacromatinaparareiniciaresu-
portaro desenvolvimentoatermo,pelome-
nosemcertostiposdecélulaselanãocons-
tituiumempecilhoparaaclonagemdeindi-
víduosadultos.
Os resultadosrecentes,obtidoscom o
transplantedenúcleosprovenientesdecélu-
lasretiradasdeanimaisadultos,sugeremque
um númeroilimitadodecópiasdeanimais
deinteressecomercialoucientíficopodeser
obtido.Entretanto,muitasdúvidasaindane-
cessitamseresclarecidas,nãosó parades-
vendarosmecanismosnecessáriosparator-
naratecnologiamaiseficiente,mastambém,
paradeterminarospossíveisefeitossobreos
animaisgerados.Atençãoespecialnecessita
serdadaparaoesclarecimentodasaltastaxas
demortalidadeembrionária,fetaleperi-na-
tal,bemcomoparaascausasdaaltaincidên-
ciadeanomaliaseabaixaviabilidadedosani-
maisclonados.
Descriçãoda Tecnologiade
TransferênciaNuclear
Osprocedimentosnormalmenteutiliza-
dosparaaproduçãodeembriõesportransfe-
rêncianuclearsebaseiamnosdescritospor
Willadsen(1986)eestãorepresentadoses-
quematicamentenafigura13.1.Sobretudo
emcamundongos,algumasmodificações
podemserempregadastantoparaa enu-
cleaçãodosoócitosreceptoresquantopara
o transplantedosnúcleosdoadores.A pre-
paraçãodosoócitosreceptorescompreende
basicamenteamaturação,aenucleaçãoea
ativação.
Maturação
Os oócitosreceptoressãonormalmente
utilizadosnafasefinaldamaturaçãomeiótica,
quandoseencontramnoestádiodemetáfase
11 (M -11).A maturaçãoatéo estádiodeM -11
podeserfeitain vivoe osoócitosrecupera-
dosdosovidutosapósaovulaçãoourecupe-
radosdiretamentedosfolículosnosmomen-
tosqueantecedemà ovulação.A maturação
podetambémserfeitainvitro.Osoócitos,que
seencontramnoestádiodeprófaseI ouvesí-
culagerminativa,sãorecuperadosdefolículos
antraiseapósumperíododecultura,quevaria
deacordocomaespécie(ex.aproximadamen-
te20 a24 h nobovino;Sirardetal., 1989),
atingemo estádiodeM-II. A escolhadomé-
tododematuração(invivoou invitro)énor-
malmentefeitaemfunçãodaespécie.No caso
dosanimaisdelaboratórioamaturaçãoépre-
ferencialmentefeitain vivo,umavezquea
recuperaçãodosoócitoséfeitaapósosacrifí-
cio dosanimais.Alémdisso,os custospara
induzirasuperovulaçãodosanimaissãobai-
xos.Poroutrolado,nosbovinosamaturação
énamaioriadasvezesfeitain vitro.Embora
os primeirosestudosno bovinoutilizavam
Citoplasma receptor Célulasdoadorasdenúcleos
~
~
abatedouroAT\'
~
~=H~
~-~ I
'.'
/
f ~~v,... ~enUCleaçãOO~ ~ , --:: rv A) / desagr~gação t ~
~
dascelulas~
E
@
;::. " ..,~
. . ~""'N.
transferenc18
00
'~' ir Cj 1~1(~),( ) .
. '0
)X5'~ I ~
MIVIFIV/CIV
congelamento
Clones
Figura13.1, Representaçãoesquemáticada reconstruçãodeembriõesportransferêncianuclearembovinos(adapta-
da de Smith, 19921. Os oócitos receptoressão normalmenterecuperadosde ovários de animais abati-
dose maturadosinvitro(MIV) ouaindacolhidosde animaisvivosporaspiraçãotransvaginal(ATV), As
célulasdoadorasdenúcleospodemterorigemdeembriõesoude linhascelulares.Os embriõespodem
serproduzidosinvivooua partirdeoócitosmaturados,fecundadose cultivadosinvitro(MIM/FIV/ClVI.
As linhagenspodemserestabelecidosa partirdecélulasembrionárias,fetaisoudeanimaisadultos.Após
a reconstrução,os embriõessão cultivadosatéo estádiode mórulaou blastocistoe transferidospara
receptoras,ouaindautilizadosparareclonagem,estabelecimentode linhascelularesoucongelados.
oócitosmaturadosinvivo(Pratheretal.,1987;
Bondiolietal., 1990),como aprimoramento
dastécnicasdematuração,o métodoin vitro
passoua ser o maisusado(Barneset aI.,
1993a).Tantoo métodoin vivoquantoo in
vitroapresentamcertasvantagenselimitações
emrelaçãoaooutro.Umadasvantagensda
maturaçãoinvivoéadequeosoócitosadqui-
remummaiorpotencialparasuportaro de-
senvolvimentodo queos maturadosin vitro
(Bordignonetal., 1997).Poroutrolado,os
custosrelacionadoscomasuperovulaçãoea
colheitadosoócitosemanimaisdeprodução,
284
limitamaproduçãodeumgrandenúmerode
oócitosparafinsdeclonagem.
Enucleação
Emboramétodosfísicos(TsunodaetaI.,
1988;TathametaI.,1995)equímicos(FuI-
ka, Jr. & Moor, 1993)tenhamsidoestuda-
dos,oprocedimentomaiseficazparaaenu-
cleaçãodosoócitosreceptoresconsistenaas-
piraçãodeumaporçãodo citoplasmaonde
selocalizaacromatinacomoauxíliodeuma
micropipeta.Antesdaenucleação,osoócitos
devemserseparadosdascélulasdocumulus
e criteriosamenteselecionados.Paraa reti-
radadascélulasdo cumulus,osoócitossão
mergulhadosnumasoluçãodehialuronida-
se(naconcentraçãode1mg/m1)eemsegui-
dapassadosváriasvezesatravésdeumapi-
petafina(comdiâmetrointernoligeiramente
maioraotamanhodo oócito)ou colocados
numtuboeagitados(vortex)durante3 a 5
minutos.
Paraaseleção,alémdaqualidademorfo-
lógica,deve-selevaremcontaapresençado
primeirocorpúsculopolar,oqueindicaque
amaturaçãoatéo estádiodeM-II foi alcan-
çada.Alémdisso,oprimeirocorpúsculopo-
larpodeservirtambémcomopontoderefe-
rênciaparaalocalizaçãodacromatinaaser
removida.A enucleaçãodeveserfeitaempre-
sençadecitocalasina(tipoB: 5 a 10j.Lg/m1
ou tipoD: 1a 2 j.Lg/m1),um desestabiliza-
dor reversíveldosfilamentosdeactina,ne-
cessárioparadarmaiorelasticidadeaosoóci-
tosduranteamicrocirurgia.O procedimento
maisusadoconsisteemremoveraproxima-
damente30%dovolumedocitoplasmaadja-
centeao primeirocorpúsculopolar,o que
permiteum sucessodeenucleaçãode60 a
70%.Hajavistoqueacromatinaédifícilde
servisualizada,faz-senecessáriocorar os
oócitoscomumfluorocromoespecíficoparaDNA (Hoechst33342;Sigma;1a 10j.Lg/m1)
eemseguidaexporosoócitosàluzultra-vio-
letaparacertificarquea cromatinafoi efe-
tivamenteremovida.Emboraessametodolo-
giasejaamplamenteutilizada,algunsefeitos
prejudiciaissobreaviabilidadedosoócitosre-
ceptoressãoevidentes.Alémdaremoçãode
umvolumerelativamentegrandedecitoplas-
ma,oquesabidamenteinterferenaqualidade
dos embriõesproduzidos (Evsikovet aI.,
1990;WesthusinetaI.,1996;Zakhartchenko
etal.,1997),aexposiçãoàradiaçãoultravio-
letaafetaa integridadedosoócitos(Smith,
1993).Nabuscadeumprocedimentocapaz
deminimizarestesefeitos,foi possívelesta-
belecerumametodologiaquepermitiume-
lhoraraquantidadeequalidadedosembriões
produzidosapósa transferênciadenúcleos
deorigemembrionária(Bordignon& Smith,
1998).O procedimentoconsistenaenuclea-
çãodosoócitosapósaativação(estímulopa-
raqueosoócitossaiamdobloqueiodaM-11
ecompletemamaturaçãomeiótica)median-
tearemoçãodeumpequenovolumedecito-
plasmaadjacenteàextrusãodosegundocor-
púsculopolar.Como a enucleaçãoé feita
dentrode poucashorasapósa ativação,a
cromatinapermanecejustapostaaosegundo
corpúsculopolar, garantindoassimquea
grandemaioriadosoócitossejaefetivamente
enucleadacoma remoçãodeumapequena
fraçãodo citoplasma,abolindoassimo uso
defluorocromoseaexposiçãoàradiaçãoul-
travioleta.Alémdisso,essemétodopermite
umamaiorseleçãodosoócitosreceptores,
poissomentesãoutilizadososqueconseguem
completara maturaçãomeióticae expeliro
segundocorpúsculopolar.
Ativação
A ativaçãodosoócitosreceptoresconstitui
outraetapadecisivaparao sucessodatrans-
ferêncianuclear,hajavistoqueo momento
daativaçãopareceterumimportanteefeito
sobrearemodelagemdosnúcleostransplan-
tadose,conseqüentemente,sobreo desen-
volvimentodos embriõesreconstituídos.
Conformemencionadoanteriormente,os
oócitosreceptoressãonormalmenteutiliza-
dosnoestádiodeM-11damaturaçãomeióti-
ca.O bloqueiodameioseno estádiodeM-
11émantidoporumcomplexodeproteínas
denominadoMPF (fatorpromotordameio-
se).O MPF,atravésdeumprocessodefosfo-
rilação,ativaváriasoutrasproteínas,asquais
sãoresponsáveispelacondensaçãodacro-
matinaemanutençãodosoócitosnoestádio
de M-11(paramaisdetalhesverrevisãode
Norbury& Nurse,1992;Nurse,2000).Em
285
condiçõesfisiológicas,istoé,no casodafe-
cundação,o espermatozóide,aopenetrarno
óvuloinduzadegradaçãodoMPF, desenca-
deandoassimo fim dameiosee o iníciodo
desenvolvimentoembrionário(K1ine& K1ine,
1992;Swann& Ozil, 1994;ParringtonetaI.,
1996).Emborao mecanismopelo t'tualo
espermatozóidedesencadeiaaativaçãoain-
dasejamotivodecontrovérsias(Fissoreetal.,
1998),nãorestamdúvidasquea ativaçãoé
dependentedeoscilaçõesintracelularesdoíon
cálcio(Swann& Ozil, 1994;K1ine,1996).
Assimcomoo espermatozóide,osméto-
dosartificiaisutilizadosparaativaçãodos
oócitostambémsebaseiamnainduçãodeos-
cilaçõesdecálcio.Os procedimentoscomu-
menteusadosincluemaexposiçãodosoóci-
tosa: 1) soluçõescontendocálcio(Wareet
aI., 1989;Susko-Parrishet aI., 1994),2)
agentescapazesdeinduziraentradadocál-
cio extracelularou a liberaçãodasreservas
intra-celularesdecálcio(WareetaI., 1989;
Nagai,1987;Bos-Mikichetal., 1995).Para
oprimeirocaso,umdosprotocolosmaisusa-
dos é o descritopor Susko-Parrishet aI.
(1994),queconsistenaexposiçãodosoóci-
tosa umasoluçãocontendo5 ,uMdeiono-
micina(Sigma)porumperíodode4 minu-
tos.Paraosegundocaso,osdoisprocedimen-
tosmaisusadossãoa estimulaçãoelétrica
(Wareetal., 1989)e o etanola 7%por um
períododeexposiçãode5 minutos(Nagai,
1987).Umadaslimitaçõesdosmétodosar-
tificiaisé a baixaeficáciaparainduzira ati-
vaçãodosoócitosnãoenvelhecidos,istoé,
resultadossatisfatóriossomentesãoobtidos
quandoos oócitossãomantidosemcultura
porlongoperíodoapósterematingidooesta-
dodeM-II (WareetaI.,1989;Nagai,1987).
A razãodabaixaeficiênciaquandodautiliza-
çãodosoócitosnãoenvelhecidoséprovavel-
mentedevidoàincapacidadedosagentesarti-
ficiaisdeinduzirrepetidasoscilaçõesnosní-
veisdecálcio,comoocorreapósa fecunda-
286
ção.Assim,quandoumúnicoestímuloéapli-
cadoaosoócitosnãoenvelhecidos,adegra-
daçãodoMPF ocorreapenasdeumamaneira
transitória,masa atividadevoltaa seelevar
(Ozil, 1990;ConasetaI.,1993;Conasetal.,
1995).Jáparaocasodosoócitosenvelheci-
dos,devidoprovavelmenteà menorcapaci-
dadeparasíntesedasenzimasresponsáveis
pelaestabilizaçãodoMPF (WUetaI.,1997),
umaúnicaoscilaçãodecálcioésuficientepara
completaraativação.Poroutrolado,embora
sejamfacilmenteativados,osoócitosenvelhe-
cidospossuemmenorpotencialparasuportar
odesenvolvimentoembrionário(Chianetal.,
1992;Konoetal.,1994).Portanto,maisestu-
dosnecessitamserfeitosparao estabeleci-
mentodemétodosdeativaçãomaiseficazes.
Umadasalternativasencontradasparaevi-
tarqueaatividadedoMPF volteaaumentar
apóso tratamentodeativaçãofoi a deincu-
barosoócitosempresençadesubstânciasca-
pazesde inibir a fosforilação (6-DMAP,
6-Dimethylamino-purine;Susko-Parrishet
aI.,1994)ouasínteseprotéica(ciclohexami-
da;Yangetal.,1994).Nessecaso,osoócitos
sãoexpostosaumestímulodeativaçãoeem
seguidacultivadospor váriashorasempre-
sençadeumadassubstânciasinibidoras.Mes-
moqueoócitosativadoscomesteprotocolo
tenhampossibilitadoresultadosanimadores
na clonagem(Loi etal., 1998;Wenset al.,
1999),osefeitosdaincubaçãodosembriões
reconstituídosnapresençadessesagentesini-
bidoresnecessitamsermelhorestudados.Ou-
traalternativaquetemsidousadacomsucesso
paraativaçãodeoócitosemdiferentesespé-
ciesaquáticasenosanfíbioséautilizaçãodo
próprioespermatozóide.Nessecaso,acroma-
tinadoespermatozóideédestruídapormeio
detratamentosdeirradiaçãosemafetarsua
capacidadede penetrare ativaros oócitos
(Tompkins,1978;StreisingeretaI., 1981;
Chourrout,1982).Nossastentativasparaa
aplicaçãodestesprocedimentosemmamí-
ferosforamnoentantomenospromissoras
(Bordignon& Smith,1999).Emboraoses-
permatozóidesirradiadoscomultravioleta
consigampenetrareativarosoócitos,ocorre
umbloqueionodesenvolvimentoembrioná-
rio,possivelmenteemdecorrênciadaincom-
pletadestruiçãodacromatina.
PreparaçãodasCélulasDoadorasdeNúcleos
A preparaçãodascélulasdoadorasdenú-
cleosvariaemfunçãodotipodecélulautili-
zada.Atépoucotempo,somentecélulasde
origemembrionáriaeramutilizadascomsu-
cessona clonageme, mesmoassim,com
grandevariaçãoentreasdiferentesespécies.
No camundongo,porexemplo,ondesomente
núcleosprovenientesdeembriõesapósaspri-
meirasclivagenspermitiamodesenvolvimento
embrionário,osnúcleoseramseparadosjun-
tamentecom uma porção do citoplasma
celularcom o auxI1iode umamicropipeta
(Mcgrath& Solter,1984;Smithetal.,1988).
Contrariamenteaocamundongo,nasoutras
espéciescomobovinoseovinos,núcleospro-
venientesdeestádiosembrionáriosmaisavan-
çadospermitemumamelhortaxadedesen-
volvimentodosembriõesreconstituídos,pos-
sibilitandoassima utilizaçãodascélulasin-
teiras.Nos bovinos,embriõesno estádiode
mórulacompactanodia5ou6apósafecun-
daçãosãopreferencialmenteutilizados,pois
contêmum bomnúmerodecélulase man-
têmum bompotencialde desenvolvimento
(ZakhartchenkoetaI.,1995).
Parafacilitaro trabalhoe proporcionaro
máximodeaproveitamentodosnúcleosde
cadaembrião,érecomendadaacompletade-
sagregaçãodosblastômeros.Inicialmente,pro-
cede-searetiradadazonapelúcida,quepode
serconseguidapordigestãoenzimática(Pro-
nase;Sigma;naconcentraçãode3 mg/rnl),
comumasoluçãoácida(pH2,5)ouaindame-
canicamentecomo auxt1iode umamicro-
pipeta.Parafacilitaradesagregação,éacon-
selhávelmanterascélulasporumperíodode
15minutosemmeio(PBS)semcálcioemag-
nésio.A massadecélulaséemseguidaaspi-
radaporváriasvezescomumapipetadeca-
librepoucosuperioraodiâmetrodascélulasa
desagregar.Paraevitarqueascélulasserom-
pamduranteadesagregação,érecomendável
a adiçãode citocalasinaao meio.Quando
célulasemcultivosãoutilizadascomofonte
denúcleos,adesagregaçãoéfeitacomusode
tripsinanaconcentraçãode0,25%.Apósoiso-
lamento,ascélulassãoinjetadasnoespaçope-
rivitelinodetalformaquepermaneçamemm-
timocontatocomamembranaplasmáticados
oócitosreceptoresparafacilitara fusão.Reconstruçãodosembriões(fusãocélula
doadora/oócitoreceptor)
O métodomaisutilizadoparatransferir
umnúcleodentrodeumoócitocontinuasen-
dopelafusãoentreasmembranasplasmáticas
dacéluladoadoraedooócitoreceptor.Vários
agentes,taiscomoasdescargaselétricas(ele-
trofusão),vírusSendaiinativado,polietilieno-
glicoleliposomaspodeminduzirafusãoen-
treasmembranasplasmáticas.Dentreesses,
a eletrofusãoé preferencialmenteusadana
maioriadasespécies(Robletal.,1992).A ele-
trofusãodeveserfeitaemmeiodebaixacon-
dutânciaelétricaparaevitaraproduçãoedis-
persãodecalor.A soluçãodeManitol,com-
postade0,3M demanitol,0,1mMdeMgSO4
e0,05mM deCaCl2ouo meiodeZimmer-
man(Tabela13.1)sãoosmaisutilizados.A
Tobelo 13.1. Composição do meio de fusão celular Zimmermonn.
Componente
Sucrose
Mg(C1HNr4HP
Co(C1HN1
~HPO4
Glutotiono
BSA
Concentração
0,28M
0,50mM
0,10mM
1,00mM
0,10mM
0,01mgjml
287
eletrofusãocompreendenormalmenteum
pulsodecorrentealternadaeoutrodecorren-
tedireta.A correntealternadaserveparaali-
nharasmembranasaseremfundidaseJ;J1posi-
çãoparalelaaoseletrodos.Jáacorrentedire-
tainduzaformaçãodeporosnasmembranas
o quelevaa fusãoentreascélulas.
Osparâmetrosusadosparaaeletrofusão,
incluindoaduração,aintensidadeeonúme-
rodepulsos,podemvariaremfunçãodotipo
deequipamentoutilizado,do tipodecélula
aserfusionadoedaespécieutilizada.Embo-
raumaamplavariaçãonosparâmetrospossa
serencontradanaliteratura,acorrentealter-
nadaénormalmenteaplicadacomumafre-
qüênciade600a 1000kHz, umavoltagem
de5 a 6 V e umaduraçãode5 a 10J,Lseg.
No casodacorrentedireta,de 1a 3 pulsos
comintensidadede0,6a3,6kV/cmedura-
çãode30a250J,Lsegtêmsidousados(Robl
etaI.,1992).Em geral,osíndicesdefusão
sãomaiselevadosquandoaintensidadeelé-
tricaaplicadaestápróximadolimitesupor-
tadopelascélulassemqueocorraa liseda
membrana.Tendoemvistaqueexisteuma
diferençaemfunçãodosequipamentosuti-
lizados,o maisrecomendadoéquecadala-
boratórioajusteseusprópriosparâmetros.
O estreitocontatoentreacéluladoadoraeo
oócitoreceptoreo perfeitoalinhamentoem
posiçãoparalelaaoseletrodossãocondições
indispensáveisparaincrementaros índices
defusão(Figura13.2).
Outro métodode fusão que tem sido
empregadocomsucessoemcamundongos
(Mcgrath& Solter,1984;Smithetal.,1988)
ecoelhos(Stice& Robl,1988)éovírusSen-
daiinativado.A metodologiaconsisteemin-
jetarnoespaçoperivitelino,juntamentecom
acéluladoadora,umapequenafraçãodemeio
contendoovírusinativado.Umadiferençaem
relaçãoaeletrofusãoéadequeovírusinduz
afusãosemcausaraativaçãodosoócitosre-
ceptores,oquepodeserdeinteresseemalgu-
288
A Placa de Petri
A
B
Figura13.2.A- Representaçãoesquemáticada câmara
de fusãoutilizadaparaa reconstruçãode em-
briões.B-Etapasda fusãoentrea céluladoa-
dora e oócito receptor:(11Célula embrioná-
rianoespaçoperivitelinodo oócitoenucleado
antesda aplicação do pulsoelétrico.121Iní-
cio da fusãoentrea célulae o oócitoreceptor.
(3) Incorporação da célula doadora pora
dentrodo oócito receptor.(4)Oócito recons-
truídoapós o términoda fusâo.Todo proces-
so de fusão,desdeo pulsoelétricoatéa com-
pleta incorporaçãoda céluladoadora, leva
em tornode 20 a 30 minutos.
mas situaçõesexperimentais.Mais recente-
menteWakayamaetalo(1998)adequaram
umprocedimentoparaa injeçãodosnúcleos
doadoresdiretamentedentrodo citoplasma
receptor.Esseprocedimento,alémdepermi-
tir a reconstruçãodosembriõesseminterfe-
rirnociclocelulardosoócitosreceptores,evita
a transferênciadocitoplasmadacéluladoa-
doraparadentrodooócito,o quepodefaci-
litarasinteraçõesentreo núcleotransferido
eo citoplasmareceptorfavorecendoassima
reprogramaçãonuclear.
Fatores que interferem na Clonagem
por Transferência Nuclear
Conformemencionadopreviamente,até
poucotempo,atransferêncianucleareraba-
sicamenteefetuadautilizando-secomofonte
denúcleosembriõesnosestádiosdepré-im-
plantação.Entretanto,apóso nascimento
daovelhaDolly (WilmutetaL, 1997)mos-
trandoque núcleosorigináriosde células
retiradasdeanimaisadultosmantinhamato-
tipotencialidade,istoé,o potencialpararei-
niciaresuportaro desenvolvimentoatermo,
váriostiposdecélulassomáticasestãosendo
testadoscomofontedenúcleosparaclona-
gemdemamíferos.Atéo presente,já foram
utilizadoscomsucessonúcleosderivadosde
célulasdaglândulamamária,defibroblastos,
decélulasdocumulus,decélulasdagranulo-
sa,decélulasdooviduto,deleucócitose de
célulasmusculares(Wilmutetal., 1997;Ci-
bellietal.,1998;Wakayamaetal.,1998;Kato
etal.,1998;Wellsetal.,1999;Gallietal.,1999;
Shigaetal., 1999).O potencialdedesenvol-
vimentodeembriõesclonadosapartirdenú-
cleosdecélulasembrionáriasesomáticasestá
descritona tabela13.2.Apesarda grande
variaçãoencontradanosdiferentesestudosos
resultadosmostramquenúcleosprovenien-
tesde célulasembrionáriaspossuemmaior
potencialdedesenvolvimentodoqueosderi-
vadosdecélulasmaisdiferenciadas.Alémdis-
so,a taxademortalidadeembrionária,feta!e
peri-natalémaiornosembriõesreconstruídos
comnúcleosdecélulassomáticas.
A baixaeficiênciadeclonagemapartirde
célulassomáticasmostraque um grande
avançonecessitaserfeitoparagarantiradi-
fusãodestatecnologia.O melhorcaminho
parasechegaraesteobjetivopossivelmente
sejaatravésdadescobertadosmecanismos
envolvidosnadiferenciaçãocelularenoesta-
belecimentodemétodoscapazesderepro-
gramarestadiferenciação.Apesardosmeca-
nismosresponsáveispelareprogramaçãodos
núcleostransplantadosnãoestaremainda
bemesclarecidos,osoócitosreceptorespare-
cemcontertodasas condiçõesnecessárias
paraareprogramaçãonuclear.Destaforma,
definirasmelhorescondiçõesparamaximi-
zaraaçãodestesmecanismospresentesnos
oócitosreceptorespareceserumdoscami-
nhosparao incrementodosresultados.
Umadasalternativasquetemsidotesta-
daparapotencializaraaçãodosmecanismos
oocitárioséa reclonagem,ou seja,a passa-
gemdosnúcleospordoisoócitosreceptores.
O procedimentoconsisteem transferiros
núcleosparadentrodosoócitosreceptores,
cultivarosembriõesreconstituídoseretrans-
ferirosnúcleosparaumnovooócitorecep-
tor.Apesardeumnúmeroaindalimitadode
estudos,areclonagempareceincrementaros
resultadosnocamundongo(Tabela13.3).Já
embovinos,quandodautilizaçãodenúcleos
deorigemembrionária,ataxadedesenvolvi-
mentoatéo estádiodeblastocistoé similar
entrea clonagemea reclonagem(Bondioli
etaL, 1990;Stice& Keefer,1993;Ectorset
al.,1995;Takanoetal.,1997;Peura&Troun-
son,1998).A maiorvantagemnessecasoé,
noentanto,amultiplicaçãodonúmerodenú-
cleosparaclonagem,ondeapartirdeumem-
briãoseriapossívelproduzir390blastocistos
com2ciclosdereclonagem(Peura& Troun-
son,1998).Tambémnosbovinos,areclona-
gemdeembriõesreconstruídoscomcélulas
fetaisou deanimaisadultosnãoteveefeito
aparentesobreataxadeblastocistosenasci-
mentos(WellsetaL, 1999;Zakhartchenko
etaL, 1999c;Galli etaL, 1999).
Umadaspossíveisexplicaçõesparaadi-
ferençaentreasespécies,referenteàclona-
289
Tabela13.2. Potencialde desenvolvimentodeembriõesreconstruidosportransferêncianuclear.
Espécie Origemdosnúcleos %deblastacistos
tronsplantados Medio(N) Variação
Embriões
- 8 célulasa mórula
- botãoembrionário
Célulasembrionárias
emculfivo(stemcells)
Célulosgerminois
Célulasfetais
Célulasdeadultas
Embriões
- 8 o 32 célulos
. botãoembrionário
Célulasembrionárias
emculfivo(stemcells)
Célulasfetais
Células de adultos
Embriões
- 4 a32células
Célulasfetais
Embriões
-1a8cel.
Célulasfetais
Célulos de odultas
Embriões
- 8 a 64 células
- botãoembrionário
Célulosembrionários
emculfivo(stemcells)
Célulasgerminais
Célulasdeodultas
Embriões
-1célula
-2células
-4o8células
- botãoembrionário
Célulasembrionários
emculfivo(stemcells)23,7(2732) 15-24 5,7(812) 0-14 65-66-67
Célulasdeadultas 44,4(2136) 22-50 2,3(1705) 1-11 68-69-70
1-Protherel 01.,1987,2- Bondioliel 01.,1990, 3- Willodsenel 01.,1991,4- Westhusinel 01.,1992, 5- Yongel 01.,1993, 6-Chesné el 01.,1993,7- Bomesel01.,1993,
8- Heymonel 01.,1994,9- Sticeel 01.,1994,10- Zokhortchenkoel 01.,1995,11- Zokhortchenkoel 01.,1996,12- Ectorsel 01.,1995, 13- Le Bourhisel 01.,1998,14-
Bordignon8.Smith,1998,15-Keeferel01.,1994,16-Collos8.Bornes,1994,17-Moensel01.,1996,18-,19-5ims8.First,1994,20-Sticeelol.,1996,21-0beIliel
01.,1998, 22- Zokhortchenkoel 01.,1999, 23-, 24- Zokhortchenkoel 01.,1999, 25- Kolo el 01.,1998, 26- Wellselol., 1999, 27- Kubotoel 01.,2000, 28- GolIiel 01.,
1999,29- Shigo el 01.,1999,30- Willodsen,1986, 31- Smith8. Wilmut,1989, 32-Compbellel 01.,1994, 33- Uu el 01.,1997, 34- Loi el 01.,1998, 35-Compbell el 01.,
1996,36-Wellselol.,1997,37-Schniekeelol.,1997,38-Wilmutelol.,1997,39-Mccreothelol.,2000,40-Yong8.Yuqiong,1998,41-Yongelol.,1991,42-Boguisi
el 01.,1999, 43- Protherel 01.,1989, 44- Tooel 01.,1999,45- Kuhholzerel 01.,2000, 46- PpHheropeutics2000; Noscimenlode 5 leilões apóslronsferênciode núcleos
deonimiosodullos,47-Stice8.Robl,1988,48-Modlinski8.Smorog,1991,49-Collos8.Robl,1991,50-Yongelol.,1992,51-Duelol.,1995,52-Adenolelol.,1997,
53-Moensel01.,1996,54-Mitolipovel01.,1999,55-Mcgroth8.Solter,1984,56-Smithel01.,1988,57-Konoel01.,1991,58-Konoel01.,1991,59-Konoel01.,
1992,60-Cheongelol.,1993,61-Tsunodo8.Kolo,1997,62-0toeguielol.,1994,63-lIImensee8.Hoppe,1981,64-Tsunodo8.Kolo,1998,65-Tsunodo8.Kato,1993,
66- Wokoyomoel 01.,1999, 67- Rideoutel 01.,2000, 68- Wokoyomoel 01.,1998, 69- Koloel 01.,1999, 70- Wokoyomo8. Yonogimochi,1999.
Bovinos
Ovinos
Coprinos
Suínos
Coelhos
Camundongos
290
19,7(14~2)
4(1252)
9,2(4969)
15,2(939)
9,2(2551)
36,3(2529)
36,8(596)
18,2(909)
18,7(1048)
12,0(247)
27,0(354)
14,9(167)
2,5(316)
19,1(790)
20,0(83)
17,0(35)
3,0(726)
30,0(54)
94,3(70)
33,2(1403)
8,2(1425)
10,2(333)
12-31
3-7
4-15
1,6-31
5-30
18-67
20-57
13-20
14-32
1-7
6-51
94-95
15-87
0-71
0-16
% de nascimentos
Medio(N) Variação
20,8(1579)
14,6(41)
2,9(139)
2,6(38)
10(130)
11,9(260)
28,4(74)
11(9)
7,3(109)
12,8(187)
3(29)
30,3(165)
2,7(112)
5,6(114)
?(5)
3,4(407)
0(135)
36,6(257)
10,2(88)
10,6(47)
5-33
13-15
0-4
0-3
9-14
2-80
16-75
4-15
7-17
21-32
3-4
15-52
0-22
0-19
Referêncios
1014
15-16
17-18
19-20
21023
24o29
30o34
31
35-36
37o39
38
40-41
42
43
44-45
46
47o52
49
51
53
54
55-56
55o60
55a57-60o62
55-57-63-64
Tabela13.3. Efeitada reclonagemsobreo desenvolvimentode embriõesdecamundongo.
Origemdosnúcleos Procedimento %deblastocistos
transplantados
4a8células
gemportransferêncianuclear,possivelmente
estárelacionadacomo diferenteperíodode
tempoentreo fim da meiosee o inícioda
atividadetranscripcionalembrionária.Basea-
do ness~hipótese,enquantoembovinosos
núcleostransplantadospermanecemdentro
do oócitoreceptorpor algunsdiasantesdo
iníciodaatividadetranscripcionalembrioná-
ria,nocamundongoesseperíodoédeapenas
algumashoras.Nessesentido,areclonagem
possibilitaummaiorperíododecontatoen-
treonúcleotransplantadoeocitoplasmado
oócitoreceptorfacilitandoassimareprogra-
maçãonuclear.Outroprocedimentoquetem
proporcionadomelhoresresultadosno ca-
mundongo,cujoprincípiopodeseromesmo
dareclonagem,ouseja,ummaiorperíodode
contatoentrenúcleotransplantadoeoócito
receptor,consisteemtransplantarosnúcleosal-
gumashorasantesdaativaçãodosoócitosre-
ceptores(Tabela13.4).
Além do maiorcontatoentreo núcleo
transplantadoeo citoplasmareceptor,outra
condiçãoqueparecefavoreceraremodelagem
Células de adultos
Clonogem
Reclonagem
Clonagem
Reclonagem
nuclear,refere-seaoestádiocelulardosoóci-
tosreceptoresnomomentodatransferência
nuclear.Combasenessahipótese,aatividade
doMPF presentenosoócitosreceptoresquan-
dousadosnoestádiodemetáfaseinduzade-
gradaçãodamembrananucleardosnúcleos
transplantados,facilitandoassimaaçãodoci-
toplasmaparainduzira reprogramaçãonu-
clear(Fulka,Jr.etal.,1996).Váriasevidências
sugeremqueosoócitosreceptoresnoestádio
demetáfasefavorecemaremodelagemdacro-
matinatransplantadasecomparadosaosutili-
zadosnosestádiosdeinterfase.Estasevidên-
ciasincluem,entreoutras,amaiordesconden-
saçãodosnúcleostransplantados(Czolowska
etal.,1984;Szollosietal.,1988;Conas& Robl,
1991;Liuetal.,1995;Bordignonetal.,1999),
a melhorreprogramaçãodaatividadetrans-
cripcionaldosnúcleostransplantados(Bor-
suketaI.,1996;Smithetal.,1996;Szollosi
etaI.,1998),amodificaçãodecomponentes
damembrananuclear(PratheretaI.,1991)
enaremodelagemdaestruturadacromatina
transplantada(Bordignonetal., 1999).
% de nascimentos Referências
8,2
40,8
46,4
28,7
10,3
27,6
2,0
11,0
104
4-5
6-7
8
1-Mcgrath&Solter,1984,2-SmithetaI.,1988,3-CheongetaI.,1993,4-Tsunodo& Koto,1997,5-Kwon& Kono,1996,6-WakoyomoetaI.,1998,
7-Wakayama&Yonagimachi,1999,8'Katoet01.,1999.
Tabela13.4. Efeitodo momentoda ativaçõodosoócitosreceptoressobreo desenvolvimentode embriõesde camundongoreconstruidoscam
núclMsde célulassomáticas.
Momentodaativaçãodosoócitos
emrelaçãoà transferêncianuclear
Imediatamenteapós
De1 o 3 h após
De3a6hopós
% de blostocistos % deimplantaçãodos
embriõestransferidos
% de nascimentos
40
58
67
24
71
57
0,0
2,2
2,5
Fonte:WokoyamaetaI. (1998).
291
Mesmoqueosoócitosnoestádiodeme-
táfaseinduzamumamelhorreprogramação
nuclearépossívelqueomecanismoenvolvi-
donãosejaapenasdevidoàaçãodoMPF nll.
degradaçãodamembrananuclear.Estudos
realizadoscomanfíbios,por exemplo,mos-
traramquearemodelagemdacromatinados
espermatozóides,necessáriaparaaformação
dospró-núcleosmasculinos(PhilpottetaI.,
1991;Philpott& Leno,1992),bemcomoa
remodelagemdacromatinadecélulassomá-
ticas(Dimitrov& Wolffe,1996)sãodepen-
dentesdaaçãodeenzimaspresentesno ci-
toplasmados oócitos.Além disso,a ação
dessasenzimasémodeladapelaatividadede
quinasespresentesnosoócitosnoestádiode
metáfase(Lenoetal.,1996).Baseadonessas
informaçõespode-seespecularqueumme-
canismosemelhantetambémsejao respon-
sávelpela reprogramação nuclear nos
mamíferos.Nossosestudossobreoefeitodos
oócitosreceptoresnaremodelagemdaestru-
turadacromatinaapósa transferêncianu-
clearemcamundongossugeremque,além
doMPF, outrasquinasestambémestãoen-
volvidas(Bordignonetal.,2001).No entan-
to, aindarestadeterminarde quemaneira
essasquinasesestãoagindo,bemcomonos
efeitospotenciaissobreodesenvolvimentodos
embriõesproduzidospor transferêncianu-
clear.Apesardoaparenteefeitobenéficoso-
breareprogramaçãonuclear,autilizaçãodos
oócitosreceptoresno estádiode metáfase
podeterconseqüênciasnegativassobreacro-
matinatransplantada.Dessaforma,a coor~
denaçãodociclocelularentreascélulasdoa-
doraseosoócitosreceptoresrepresentaou-
tro aspectoimportanteparaa produçãode
embriõespor transferêncianuclear(Camp-
belletal.,1996b;Campbell,1999).
Os primeirosestudosa evidenciarema
importânciadoestádiodociclocelularsobre
asinteraçõesnúcleo-citoplasmáticasforam
realizadoscomafusãodecélulassomáticas
292
(Johnson & Rao, 1970;Rao & Johnson,
1970).Essesexperimentosmostraramque
as célulasemmetáfaseinduzema ruptura
da membrananucleare a condensaçãoda
cromatinadascélulasqueestãoemqualquer
outro estádiodo ciclo celular.Mais tarde,
outrosmostraramquearupturadamembra-
nanuclearpodelevaraumnovociclodere-
plicaçãodacromatinamesmonascélulasque
estãooujá tenhamcompletadoafasedere-
plicaçãodoDNA (Blow& Laskey,1988;Le-
no etaI., 1992).Assim,a altaatividadede
MPF presentenascélulasemmetáfasepode
levarà condensaçãoprecocee por conse-
qüênciaa fragmentaçãoou pulverizaçãoda
cromatinaouaindaàalteraçãodaploidiadas
células(Rao,1990).Estudoscomtransferên-
cianucleartambémmostraramconseqüên-
ciassimilaressobrea cromatinaquandoda
fusãodecélulasemfaseS comoócitosem
metáfase(Czolowskaetal.,1984;Czolowska
etaI.,1992;ConasetaI.,1992b;Pinto-Cor-
reiaetal.,1993;Campbelletal.,1993;Banes
etal.,1993b;Cheongetal.,1994;Pinto-Correia
etaI., 1995).Baseadonisso,a coordenaçãodociclocelularentreascélulasdoadorasde
núcleoeosoócitosreceptoresdeveconside-
rarigualmentedoisaspectosimportantes,ou
seja,o efeitosobrea reprogramaçãonuclear,
bemcomo,a preservaçãoda morfologiae
ploidiadacromatinatransplantada.Napráti-
ca,aconciliaçãodeambososaspectosédi-
fícildeserobtida,principalmentenocasodos
núcleosprovenientesdecélulasembrionárias.
Nessesentido,devidoacertasparticularidades
noqueserefereaociclodecrescimentoedi-
visãocelular,a utilizaçãodenúcleosprove-
nientesdecélulasembrionáriasousomáticas
parecemrequererprocedimentosdiferentes.
Mesmoqueo ciclodecrescimentoedivi-
sãocelular,tantoparaascélulasembrionáiias
quantoparaassomáticas,sejaigualmentedi-
vididoem4 fases,ou seja:faseM (mitose)
quecorrespondeaoperíododedivisão,fase
S (síntese)querepresentaoperíododedupli-
caçãodacromatinae asfasesG1e G2 que
correspondemaosperíodosdepausaeprepa-
raçãoparaasfasesSeM, respectivamente
(AlbertsetaI., 1994).A principaldiferença,
no entanto,équenascélulassomáticasas4
fasessãobemdistintaseamaioriadascélulas
encontram-sena faseG1, já ascélulasem-
brionáriaspassamrapidamentepelasfasesG
e a grandemaioriaencontra-sena faseS
(BarnesetaI.,1993b;CampbelletaI.,1994).
Alémdisso,contrariamenteàscélulassomáti-
cas,osprocedimentosjá testadosparaasin-
cronizaçãodociclodascélulasembrionárias,
apesardeproporcionarresultadossatisfató-
riosemcamundongos(OtaeguietaI.,1994;
Samaké& Smith, 1996a;Kwon & Kono,
1996;Tsunoda& Kato,1998),forampouco
eficazesemoutrasespécies(Tanakaet aI.,
1995;Samaké& Smith,1996b;Samaké&
Smith,1997;Samaké& Smith,1998;Liu et
al.,1997).Emfunçãodisto,amelhoralterna-
tivaencontradaparaevitarasincompatibilida-
deseaumentaraproduçãodeembriõesquan-
do da transferênciade núcleosde células
embrionáriasfoi a utilizaçãodeoócitospré-
ativados(Barnesetal.,1993b;Campbelletal.,
1994;Sticeetal.,1994;Bordignon& Smith,
1998;Loi etal.,1998;Yong& Yuqiang,1998).
DevidoàbaixaatividadedeMPF, osoócitos
receptorespré-ativadospermitemotransplan-
tedenúcleosemqualquerestádiodocicloce-
lularsemefeitosprejudiciaissobreacromatina
transplantada(Campbelletal., 1996b).
No casodascélulassomáticas,amanipu-
laçãodociclocelularéfacilmenteobtidapela
simplesprivaçãodenutrientesnomeiodecul-
tivooupelobloqueioqueocorrenaturalmente
quandoascélulasatingemumestádiodecon-
fluência.Nessascondições,agrandemaioria
dascélulaspermanecemnoestádiodeG1ou
aindaparamcompletamentedesedividire
permanecemnumestádioditoGO(Campbell,
1999).TantonoestádiodeG1quantonoGO
ascélulasaindanãoiniciaramafaseS,o que
permiteatransferênciadosnúcleosparaoóci-
tosemmetáfasesemconseqüênciasprejudi-
ciaissobrea cromatina.
Alémdefacilitarasinteraçõescomocito-
plasmareceptor,o estádiodociclodascélu-
lasdoadorastambémpodeinterferirnare-
programaçãodos núcleostransplantados.
Estudosrealizadoscomcélulasembrionárias
mostramqueo estádiodo ciclodosnúcleos
transplantadosafetaa taxade desenvolvi-
mentodosembriõesreconstruídos(Collaset
al.,1992a;Cheongetal.,1993;Otaeguietal.,
1994;Tsunoda& Kato,1997;Liuetal.,1997).
Além disso,o estádiodo ciclo dosnúcleos
transferidostambémafetao temponecessá-
rioparaaremodelagemdecomponenteses-
truturaisdacromatinatransplantada(Bordig-
nonetaI.,2001).
O estádiodociclodosnúcleostransplanta-
dospareceterumefeitoaindamaiorquando
da utilizaçãode célulasmaisdiferenciadas.
Certasevidênciassugeremqueareprograma-
çãonuclearéfacilitadaquandoosnúcleossão
transplantadosnoestádiodeGO (Campbell,
1999).Baseadonisto,antesdatransferência
nuclear,ascélulasdoadorasdenúcleostêm
sidocultivadasporváriosdiasemmeiocon-
tendobaixasconcentraçõesdesoro(Campbell
etal.,1996a;WilmutetaI.,1997;Katoetal.,
1998;Wellsetal.,1999;Zakhartchenkoetal.,
1999c).Apesardopossívelefeitobenéficodo
estádiodeGO,clonesjá foramproduzidosa
partirdecélulassomáticassemteremsidopri-
vadasdesoro(Cibellietal.,1998;Lanzaetal.,
2000).Nossosresultadosrecentescombovi-
nos,mostramquemesmocélulassomáticas
transfectadas,quenãoforamprivadasdesoro
e tambémnãoestavamnumestádiodecon-
fluênciano momentoda reconstruçãodos
embriões,resultaramno nascimentodeclo-
nestantocomautilizaçãodeoócitosrecepto-
resnoestádiodemetáfasequantoaquelespré-
ativados(Bordignonetal.,2000).Essesre-
293
sultadossugeremquediferentesfatorespo-
demestarenvolvidosnareprogramaçãonu-
clearapósa reconstruçãodosembriões.
Problemas de Viabilidade
Embrionária, Fetal e Neonatal
Apesardonascimentodeanimaisdevárias
espéciesa partirdeembriõesreconstruídos
comnúcleosprovenientesdecélulasemdife-
rentesestádiosdediferenciação,diversasano-
maliastêmsidoconstatadasduranteagesta-
çãoeapósonascimentodeanimaisclonados.
MortalidadeEmbrionária
Altastaxasde mortalidadeembrionária
têmsidoobservadasemestádiosiniciaisefi-
naisdagestação.Nasperdasemfaseinicial,
devidoà absorçãoembrionária,observa-se
apenaso retomoaoestroapósdiagnósticode
prenhes.Perdasmaistardiasestãoassociadas
comoaparecimentodecorrimentovaginalcom
sangueeapresençademembranasfetaise/ou
ofetoemdiferentesestádiosdeputrefação.Es-
tudosindicamquea causadasperdasestão
associadasaumdesenvolvimentoanormalda
placenta,possivelmentedevidoaocrescimen-
to inapropriadodamembranaalantóideem
decorrênciada faltadevascularizaçãonos
estádiosiniciaisdo desenvolvimento(Wells,
1999).Outrosestudostêmdescritoumcres-
cimentoretardadodamembranaalantóideou,
emalgunscasos,ainexistênciacompletadesse
tecidoextra-embrionárioquelevaà falhano
desenvolvimentodeplacentomas(Hill etaI.,
1999).Emboraascausasprimáriasdessede-
senvolvimentoanormalcontinuemdesconhe-
cidas,muitostêmresponsabilizadogenesque
sãomarcadosdeumaformadiferente,depen-
dendodesuaorigempaternaoumaterna(ge-
nes"imprinted").A perdaou modificações
nessasmarcasepi-genéticaspoderiamentão
sera causadasanomaliasencontradasnas
gestaçõesdeclones.Perdasfetaisemestádio
avançadosãoconseqüênciasdadisfunçãopla-
294
centáriaquelevaàformaçãodehidroalantói-
deeo aparecimentodeplacentomasmaiores
- eemmenorquantidade,aumentonaespessu-
ra docordãoumbilicale membranasplacen-
táriasedematosas(Kruip& DenDaas,1997).
Problemasde saúde neonatal
O aumentodepesoaonasceréumacarac-
terísticabastantecomumderuminantesoriun-
dosdadonagem(Wilsonetal., 1995),tanto
queo fenômenotemsidoreferidocomosín-
dromedobezerrograndeou LCS (doinglês
"largecalfsyndrome").Nãosesabeaindase
o LCS temsuaorigemnadonagem,poisele
ocorretambémemanimaisoriundosda fe-
cundaçãoinvitro,oquesugerequesejadevi-
do ao sistemade cultivooocitárioou em-
brionário.Problemasrespiratóriostêmsido
relatadosfreqüentementeembezerrosecor-
deirosclonadosoquesugerepossíveisproble-
masnaformaçãoefuncionamentodaglându-
Iaadrenal,baixosníveisdecortisolfetalein-
suficiênciadesurfactantespulmonares.Trata-
mentosdareceptoracomcorticóidesantesdo
parto,podeacelerara maturaçãopulmonar
do feto,associadocomumasuplementação
deoxigêniologoapósonascimento,podeau-
mentaras taxasde sobrevivêncianeonatal
(HilletaI.,1999).A administraçãodesurfac-
tantespulmonarestemtidoefeitosvariáveis
sugerindoquea hipertensãopulmonaré a
causaprimáriadasanomaliasrespiratórias
(observaçõespessoais).A apariçãodeinfec-
çõespulmonaresécomumemfetosclonados
quenecessitamdeterapiaantimicrobianalogo
apósnascimento.As infecçõesconstantese
dediversasordenssugeremqueanimaisdo-
nadospossuemumadeficiênciaimunológica,
conformeobservadoemalgunsanimaisque
apresentamcontagemdehemáciaseleucóci-
tosreduzidos(RenardetaI., 1999).Nossas
constataçõesembezerrosoriundosdedona-
gemapartirdecélulasfetaisevidenciaramco-
moprincipaisproblemas:1)anomaliasumbi-
licaiscominfecçãoeuracuspersistente;2)
poucatolerânciaaoestresseeàanestesia;3)
broncopneumonia;e4)emumcaso,morte
antesdonascimento.comsintomasdeedema
generalizadoeascite(anasarca).
Conclusões e Perspectivas
A transferêncianucleartemsidoutilizada
emdiversasáreasdepesquisaejácontribuiu
parao esclarecimentodediversasquestões
biológicasrelevantes,incluindoosresultados
recentescomaproduçãodeclonesa partir
decélulassomáticas,mostrandoquea cro-
matinanão é irreversivelmentemodificada
duranteadiferenciaçãocelular.Essesresul-
tadoslevaramfinalmenteàrespostadaques-
tãoqueinicialmenteincitoucientistasapro-
poremautilizaçãodestatecnologiahácerca
deum século.
A evoluçãodosconhecimentosacumula-
dosnodecorrerdasúltimasdécadaslevouesta
tecnologiaapontodepoderseraplicadaem
diversasáreasdebiotecnologiaanimalou
mesmoparaamedicinahumana.Dentreas
aplicaçõespodemosdestacaromelhoramen-
to animal,a produçãoou multiplicaçãode
animaistransgênicos,amultiplicaçãodeani-
maisdeespéciesemviadeextinçãoeprova-
velmente,numfuturopróximo,paraapro-
duçãodecélulasoutecidosparatratamentos
emhumanos.Entretanto,adifusãodautili-
zaçãodestatecnologia,sobretudoparaapli-
caçãoanimal,aindadependedaobtençãode
melhoresresultados.Esseobjetivosegura-
menteseráalcançadocomo esclarecimento
dosmecanismosquecontrolamaremodela-
gemfuncionaldosnúcleostransplantados.
Enquantoisto,atransferêncianuclearsegui-
rá contribuindoparao avançode diversas
áreasdapesquisafundamental.
ReferênciasBibliográficas
ADENOT,P.G.,SZOLLOSI,M.S.,CHESNE,P.,
etai Invivoagingofoocytesinfluencesthe
behaviorof nucleitransferredtoenucleated
rabbitoocytes.MoI. Reprod.Dev.,v.46,
p.325-336,1997.
ALBERTS,B.,BRAY.D.,LEWISJ.,etaLMolecu-
larbiologyofthecell.1994.NewYork:Gar-
landpublishingine.
BAGUISI,A.,BEHBOODI.E.,MELICAN.D.T.,
etai Productionofgoatsbysomaticcellnu-
cleartransfer.Nat.Bioteehnol.,v.17,p.456-
461,1999.
BARNES,E, ENDEBROCK,M.,LOONEY,C.,
etaI.Embryocloningincattle:theuseofin
vitro maturedoocytes.J. Reprod.Fertil.,v.97,
p.317-320,1993a.
BARNES,Elo,COLLAS,P.,POWELL,R, etaI.
Influenceofrecipientoocytecellcyclestageon
DNAsynthesis,nuclearenvelopebreakdown,
chromosomeconstitution,anddevelopmentin
nucleartransplantbovineembryos.MoI.Re-
prod.Dev.,v.36,p.33-41.1993b.
BLOW,J,J.,LASKEY,RA. A roleforthenuclear
envelopeincontrollingDNAreplicationwithin
thecellcycle.Nature,v.332,p.546-548.1988.
BONDIOLI, KR, WESTHUSIN,M.E.,LOO-
NEY,C.R Productionofidenticalbovineoffs-
pringbynucleartransfer.Theriogenology,
v.33,p.165-174.1990.
BORDIGNON,v.,CLARKE,H.J.,SMITH,loC.
Developmentallyregulatedlossandreappea-
ranceofimmunoreactivesomatichistoneH1
onchromatinofbovinemorula-stagenuclei
followingtransplantationintooocytes.Biol.
Reprod.,v.61,p.22-30.1999.
BORDIGNON,v.,CLARKE,H.J.,SMITH loC.
Factorscontrollingthelossofimmunoreactive
somatichistoneH1fromblastomerenuclei
inoocytecytoplasm:apotentialmarkerofnu-
clearreprogramming.Dev.Biol., v.233,
p.192-203.2001.
BORDIGNON,v.,KEYSTON,R, LAZARIS,A.,
etaI. Productiondesveauxtransgéniques
clonéspartransfertdenoyauxsomatiques
transfectésdansdesovocyteshôtesavantet
arfeSl'activation.Rene.UivoFor.Montmor.,
Québe,Canada(Abstract)2000.
BORDIGNON,v.,MORlN, N.,DUROCHER,
J.,etaI.GnRHimprovestherecoveryrateand
theinvitrodevelopmentalcompetenceof00-
cytesobtainedbytransvaginalfollicularaspi-
295
rationfromsuperstimulatedheifers.Therioge-
nology,vA8, p. 291-298,1997.
BORDIGNON, v., SMITH, Lc. Telophaseenu-
cleation:Ao improvedmethodtopreparereei!
pientcytoplastsforuseinbovinenucleartrans-
feroMoI. Reprod.Dev.,vA9, p.29-36,1998.
BORDIGNON, v.,SMITH, LC. Ultraviolet-irra-
diatedspermatozoaactivateoocytesbutarrest
preimplantationdevelopmentafterfertilization
andnucleartransplantationincaule.Hiol.Re-
prod.,v.61,p.1513-1520,1999.
BORSUK, E.,SZOLLOSI, M.S., BESOMEBES,
D.,etai. Fusionwithactivatedmouseoocytes
modulatesthetranscriptionalactivityofintro-
ducedsomaticcell nuclei. Exp. Cell Res.,
v.225,po93-101,1996.
BOS-MIKICH, A, SWANN, K., WHITTIN-
GHAM, D.G. Caleiumoscillationsandprotein
synthesisinhibition synergisticallyactivate
mouseoocytesoMoI. Reprod.Dev.,v.41,p.84-
90, 1995.
BRIGGS, R, KING, T.J.Transplantationofliving
nucleifromblastulacellsfito enucleatedfrog
eggs.Proc.Nad.Acad.Sei.USA,v.38,pA55-
467, 19520
CAMPBELL, KHoS., LOI, P.,OTAEGUI, P.J.,et
aL Cellcycleco-ordinationinembryocloning
by nucleartransfer.Rev.Reprod.,v.1,pAO-
46, 1996bo
CAMPBELL, KH.S. Nuclearequivalence,nuclear
transfer,andthecellcycle.Cloning,v.l, p.3-
15,19990
CAMPBELL, KH.S., LOI, P.,CAPPAI,P.etaLIm-
proveddevelopmenttoblastocystofovinenu-
cleartransferembryosreconstructedduringthe
presumptiveS-phaseofenucleatedactivated00-
cytes.Hiol.Reprod.,v.50,poI385-1393,1994.
CAMPBELL, KH.S., MCWHIR J., RITCHIE, W.
A, etaLSheepclonedbynucleartransferfrom
culturedcellline.Nature,v.380,p.64-66,1996a.
CAMPBELL, KH.S., RITCHIE, WA, WILMUT,
I. Nuclear-cytoplasmicinteractionsduringthe
fIrstcellcycleofnucleartransferreconstructed
bovineembryos:Implicationsfor deoxyribo-
nucleicaeidreplicationanddevelopment.Hiol.
Reprod.,vA9, p.933-942,1993.
CHEONG, H,T., TAKAHASHI, Yo,KANAGAWA,
H. Birthof mireaftertransplantationofearlycell-
296
cycle-stageembryonicnucleifito enucleated
oocytes.Hiol.Reprod.,vA8,p.958-963,1993.
CHEONG, HoT.,TAKAHASHI, Y., KANAGAWA,
H. Relationshipbetweennuclearremodeling
andsubsequentdevelopmentofmouseembryo-
nic nucleitransferredto enucleatedoocyteso
MoI. Reprod.Dev.,vo37,p.138-145,1994.
CHESNÉ, P.,HEYMAN, Y., PEYNOT, N., etai.
Nucleartransferincattle:birthofclonedcalves
and estimationof blastomeretotipotencyin
morulaeusedasasourceofnuclei[published
erratumappearsin C R Acad Sei III 1993
Jul,316(7):641].C. R. Acad. Sei. Life Sei.,
v.316,pA87-491, 1993.
CHIAN, R,Co,NAKAHARA, H., NIWA, K, etal.
Fertilizationand ear\ycleavagein vitro of
ageingbovineoocytesaftermaturationincul-
rufe.Theriogenology,v.37,p.665-672,1992.
CHOURROUT, D. Gynogenesiscausedbyultra-
violetirradiationof salmonidsperm.J. Exp.
Zool., v.23,p.175-181,19820
CIBELLI, J.8.,STICE, S.L, GOLUEKE, p.J.Clo-
nedtransgeniccalvesproducedfromnonquies-
centfeta!fIbroblasts.Seience,v.280,p.1256-
1258,1998.
COLLAS, P.,BALISE, JoJo,ROBL, JoMoInfluence
ofcellcyclestageofthedonornucleusondeve-
lopmentofnucleartransplantrabbitembryos.
Hiol. Reprod.,vA6, pA92-500,1992a.
COLLAS, P.,BARNES, Elo Nucleartransplan-
tationbymicroinjectionofinnercellmassand
granulosacellnuclei.MoI. Reprod.Dev.,v.38,
p.264-267,1994.
COLLAS, P.,CHANG, T.,LONG, C., etaLInac-
tivationofhistoneHl kinasebyCa2+in rabbit
oocytes.MoI. Reprod.Dev.,vAO,p.253-258,
1995.
COLLAS, P.,PINTO-CORREIA, C., DELEON,
FAP., etaL Effectof donorcellcyclestageon
chromatinandspindlemorphologyinnuclear
transplantrabbitembryos.Hiol.Reprod.,vA6,
p.501-511,1992bo
COLLAS, P.,ROBL, J.M. Relationshipbetween
nuclearremodelinganddevelopmentinnuclear
transplantrabbitembryos.Hiol.Reprod.,v.45,
pA55-465, 1991.
COLLAS, P., SULLIVAN, E.Jo, BARNES, Elo
HistoneH 1 kinaseactivityin bovineoocytes
'followingcalciumstimulation.MoI.Rep.Dev.,
v.34,p.224-231,1993.
COLLEAU,J.J. Combininguseofembryosexing
andcloningwithinmixedMOETsforselection
ondairycattle.Genet.SeI.Ev.,v.24,p.345-
361,1992.
CZOLOWSKA,R, MODLINSKI,JA., TARKO-
WSKI,AK Behaviourofthymocytenucleiin
non-activatedandactivatedmouseoocytes.J.
CellSci.,v.69,p.19-34,1984.
CZOLOWSKA,R, SZOLLOSI,D.,SZOLLOSI,
M.S.Changesinembryonic8-cellnucleitrans-
ferredbymeansofcellfusiontomouseeggs.
Int. J. Dev.BioI.,v.36,p.543-553,1992.
DIBERARDINO,MA. Geneticstabilityandmo-
dulationofmetazoannucleitransplantedinto
eggsandoocytes.Differentiation,v.17,p.17-
30,1980.
DIBERARDINO,MA. GenomicPotentialofDif-
ferentiatedCells,ColumbiaUniversityPress,
1997,NewYork,386p.
DIMITROY,S.,WOLFFE,AP. Remodelingso-
maticnucleiinXenopuslaeviseggextracts:
molecularmechanismsfortheselectiverelease
ofhistonesH1andH1(O)fromchromatinand
theacquisitionoftranscriptionalcompetence.
EMBO J., v.15,p.5897-5906,1996.
DU,E,GILES,J.R, FOOTE,RH., etaI.Nuclear
transferofputativerabbitembryonicstemcells
leadstonormalblastocystdevelopment.J. Re-
pradoFertil.,v.1O4,p.219-223,1995.
ECTORS,EJ., DELVAL,A, SMITH, LC. etal
Viabilityofclonedbovineembryosafteroneor
twocyclesofnucleartransferandinvitrocul-rufe.Theriogenology,vA4,p.925-933,1995.
EVSIKOV, S.v., MOROZOVA, LM., SO-
LOMKO, AP. Theroleof thenudeocyto-
plasmicfatiaindevelopmentregulationofthe
earlymouseembryo.Development,v.1O9,
p.323-328,1990.
FISSORE,RA, GORDO,AC., WU,H.Activa-
tiDoofdevelopmentinmammals:istherearole
foraspermcytosolicfactor.Theriogenology,
vA9,pA3-52,1998.
FLACH,G.,JOHNSON,M.H.,BRAUDE,P.R,
etai.Thetransitionfrommaternaltoembryo-
niccontraiinthe2-cellmouseembryo.EMBO
J., v.l, p.681-686,1982.
FULKA,J.R, FIRST,N.L, MOOR,RM. Nuclear
transplantationinmammals:remodellingoftrans-
plantednucleiundertheinfluenceofmaturation
promotingfactor.BioEssays,v.18,p.835-840,
1996.
FULKA,J.R, MOOR,RM. Noninvasivechemical
enucleationofmouseoocytes.MoI.Rep.Dev.,
v.34,pA27-430,1993.
GALLI, C., DUCHI, R, MOOR, RM., etai.
Mammalianleukocytescontainallthegenetic
informationnecessaryforthedevelopmentof
anewindividual.Cloning,v.1,p.161-170,1999.
GURDON,J.B.Nucleartransplantationineggs
andoocytes.J. CellSci.,Supri.vA, p.287-
318,1986.
GURDON,J.B.,COLMAN,A Thefutureofclo-
ning.Nature,vA02,p.743-746,1999.
GURDON,J.B.,UEHLINGER,V "Fertile"intes-
tinenuclei.Nature,v.210,p.1240-1241,1966.
HEYMAN,Y., CHESNÉ,P.,LEBOURHIS,D.,
etaI.Developmentalabilityofbovineembryos
afternucleartransferbasedonthenuclear
source:invivoversusinvitro.Theriogenology,
vA2,p.695-702,1994.
HILL, J.R, ROUSSEL,AJ., CIBELLI,J.B.,etai.
Clinicalandpathologicfeaturesof doned
transgeniccalvesandfetuses(13casestudies).
Theriogenology,v.51,p.1451-1465,1999.
ILLMENSEE, K, HOPPE,P.C.Nucleartrans-
plantationin Musmusculus:Developmental
potentialofnucleifrompreimplantationem-
bryos.Cell,v.23,p.9-18,1981.
JOHNSON,RT, RAO,P.N.Mammaliancellfu-
siGo:Inductionof prematurechromosome
condensationin interphasenudei.Nature,
v.226,p.717-722,1970.
KATO,Y.,TANI,T, SOTOMARU,Y,.etai,Eight
calvesclonedfromsomaticcellsofa single
adult.Science,v.282,p.2095-2098,1998.
KATO,Y.,YABUUCHI,A, MOTOSUGI,N.,etal
Developmentalpotentialofmousefollicularepi-
thelialcellsandcumuluscellsafternuclear
transfer.BioI.Reprod.,v.61,p.111O-1114,1999.
KEEFER,C.L, STICE,S.L, MATTHEWS,D.L.
Bovineinnercellmasscellsasdanarnucleiin
theproductionofnucleartransferembryosand
calves.BioI.Reprod.,v.50,p.935-939,1994.
KIKYO, N., WOLFFE, AP. Reprogramming
nuclei:insightsfromcloning,nucleartransfer
andheterokaryons.J. CellSci.,v.113,p.ll-
20,2000.
KLINE,D.Activationofthemouseegg.Therioge-
nology,vA5,p.81-90,1996.
297
..
KLINE, D., KLINE, J.T. Repetitivecalcim
transientsandlheroleofcalciuminexocytosis
andcellcycleactivationinlhemouseegg.Dev.
Biol.,v.149,p.80-89,1992.
KONO,T.,KWON,O.Y.,NAKAHARA,T.Deve-
lopmentofenucleatedmouseoocytesreconsti-
tutedwithembryonicnuclei.J.Reprod.Fertil.,
v.93,p.165-172,1991a.
KONO,T.,KWON,O.Y.,WATANABE,T.De-
velopmentof mouseenucleatedoocytes
receivinga nucleusfromdifferentstagesof
lhesecondcellcycle.J. Reprod.Fertil.,v.94,
p.481-487,1992.
KONO, T.,SOTOMARU,Y., AONO, F.,etalo
Effectofooplastactivationonlhedevelopment
ofoocytesfollowingnucleustransferincattle.
Theriogeoology,v.41,p.1463-1471,1994.
KONO,T.,TSUNODA,Y.,NAKAHARA,T.Pro-
ductionof identicaltwinandtripletmiceby
nucleartransplantation.J. Exp.Zool.,v.257,
p.214-219,1991b.
KRUlp,TAM., DEN DMS, J.H.G.Invitropro-
ducedandclonedembryos:effectsonpregnan-
cy,parturitionandoffspring.Theriogenology,
v.47,p.43-52,1997.
KUBOTA,C.,YAMAKUCHI,H., TODOROKI
J.,etaI.Sixclonedcalvesproducedfromadult
fibroblastcellsafterlong-termculture.Proc.
Natl.Aead.Sei.USA,v.97,p.990-995,2000.
KUHHOLZER,B.,TAO,T.,MACHATY,Z.,et
aI.Productionoftransgenicporcineblastocysts
bynucleartransfer.MoI.Reprod.Dev.,v.56,
p.145-148,2000.
KWON,O.Y.,KONO,T.Productionofidentical
sextupletmicebytransferringmetaphasenuclei
fromfour-cellembryos.Proc.Nad.Acad.Sei.
USA,v.93,p.1301O-13013,1996.
LANZA,RP.,CIBELLI, J.B.,BLACKWELL,C.,
etaI.Extensionofcelllife-spanandtelomere
lengthinanimaisclonedfromsenescentsoma-
ticcells.Seieoce,v.288,p.665-669,2000.
LE BOURHIS,D., CHESNE,P.,NIBART,M.,
etaI.Nucleartransferfromsexedparentem-
bryosincattle:efficiencyandbirthofoffspring.
J. Reprod.Fertil.,v.I13,p.343-348,1998.
LENO, G.H.,DOWNES,C.S.,LASKEY,RA
Thenuclearmembranepreventsreplicationof
humanG2nucleibutnotG1nucleiinXenopus
eggextract.CelI,v.69,p.151-158,1992.
298
LENO, G.H.,MILLS, AD., PHILPOTT,A, et
aI.Hyperphosphorylationof nucleoplasmin
facilitatesXenopusspermdecondensationat
fertilization.J. Biol. Chem.,v.271,p.7253-
7256,1996.
LIU, L.,DAI,Y.,MOOR,RM. Nucleartransfer
insheepembryos:lheeffectofcell-cyclecoor-
dinationbetweennucleusandcytoplasmand
lheuseofinvitromaturedoocytes.MoI. Re-
pradoDev.,v.47,p.255-264,1997.
LIU, L.,MOOR,RM., LAURIE,S.etaI.Nuclear
remodellingandearlydevelopmentincryopre-
served,porcineprimordialgermcellsfollowing
nucleartransferintoinvitro-maturedoocytes.
lot. J. Dev.Biol.,v.39,p.639-644,1995.
LOI, P.,LEDDA,S.,FULKA,n, etaI.Develop-
mentof parthenogeneticandclonedovine
embryos:effectofactivationprotocols.Biol.
Reprod.,v.58,p.1177-1187,1998.
MCCREATH, KJ., HOWCROFT, J., CAMP-
BELL,KH., etaI.Productionofgene-targeted
sheepbynucleartransferfromculturedsomatic
cells.Nature,v.405,p.1O66-1O69,2000.
MCGRATH,J" SOLTERD. Inabilityof mouse
blastomerenucleitransferredtoenucleatedzy-
golestosupportdevelopmentinvitro.Scieoce,
v.226,p.1317-1319,1984.
MITALIPOV,S.M.,WHITE ,KL., FARRAR,Y.R,
etaI.Developmentof nucleartransferand
parthenogeneticrabbitembryosactivatedwith
inositol1,4,5-trisphosphate.Biol. Reprod.,
v.60,p.821-827,1999.
MODLINSKI, JA, SMORAG,Z. Preimplan-
fatiGodevelopmentof rabbitembryosafter
transferofembryonicnucleiintodifferentcy-
toplasmicenvironment.MoI. Reprod.Dev.,
v.28,p.361-372,1991.
MOENS,A, CHASTANT,S.,CHESNE,P.,etaI.
Differentialabilityofmaleandfemalerabbit
fetalgermcellnucleitobereprogrammedby
nucleartransfer.Differentiation,v.60,p.339-
345,1996a.
MOENS,A, CHESNÉ,P.,DELHAISE,F.,etaI.
Assessmentof nucleartotipotencyof fetal
bovineDiploidgermcellsbynucleartransfer.
Theriogenology,v.46,p.871-880,1996b.
NAGAI,T. Parthenogeneticactivationof cattle
follicularoocytesinvitrowithethanol.Gamete
Res.,v.16,p.243-249,1987.
NORBUaY,C.,NURSE,P.Animalcellcyclesand
theircontraI.Annu. Rev.Biochem.,v.61,
pA41-470,1992.
NURSE,P.A longtwentiethcenturyof thecell
cycleandbeyond.Cell,v.l00,p.71-78,2000.
OTAEGUI, P.J.,O'NEIL, G.T.,CAMPBELL,
KH.S.,etaloTransferofnucleifrom8-cellsta-
gemouseembryosfollowinguseofNocoda-
zoletocontraIthecellcycle.MoI. Reprod.
Dev.,v.39,p.147-152,1994.
OZIL, J-P.Theparthenogeneticdevelopmentofrab-
bitoocytesafterrepetitivepulsatileelectricalsti-
mulation.Development,v.109,p.117-127,1990.
PARRINGTON, J., SWANN, K, SHEVCHEN-
KO, VI., etaI.Calciumoscillationsinmamma-
lianeggstriggeredbyasolublespermprotejo.
Nature,v.379,p.364-368,1996.
PEURA, T.T., TROUNSON, AO. Recycling
bovineembryosfor nucleartransfer.Reprod.
Fertil.Dev.,v.lO, p.627-632,1998.
PHILPOTT, A, LENO, G.H. Nucleoplasminre-
modelsspermchromatininXenopuseggex-
tracts.Cell, v.69,p.759-767,1992.
PHILPOTT ,A, LENO, G.H., LASKEY, RA
SpermdecondensationinXenopuseggcyto-
plasmismediatedbynucleoplasmin.Cell,v.65,
p.569-578,1991.
PINTO-CORREIA, C.,COLLAS, P.,raNCE DE
LEON, FA., etaI.Chromatinandmicrotubule
organizationinthefirstcellcycleinrabbitpar-
thenotesandnucleartransplantembryos.MoI.
Rep.Dev.,v.34,p.33-42,1993.
PINTO-CORREIA, C., LONG, C.R, CHANG,
T.,etaloFactorsinvolvedinnuclearreprogram-
mingduringearlydevelopmentin therabbit.
MoI. Rep.Dev.,vAO,p.292-304,1995.
Polejaeva,IA., Chen,S.H.,Vaught,ID., etaloClo-
nedpigsproducedbynucleartransferfromadult
somaticcells.Nature,vA07,p.86-90,2000.
PRATHER,RS., BARNES,EL, SIMS, M.M.,
etaloNucleartransplantationinthebovineem-
bryo:assessmentofdanarnucleiandrecipient
oocyte.Biol.Reprod.,v.37,p.859-866,1987.
PRATHER,RS., KUBIAK.J., MAUL, G.G.,et
aI.TheexpressionofnuclearlaminA