Biotécnicas aplicadas a reprodução animal Cap. 14

Prévia do material em texto

vitro quantoinvivo.Célulasgerminativasem-
bríonáriasforamestabelecidasemcamun-
dongos(MatsuietaI., 1992;Resnicketal.,
1992),suínos(PiedrahitaetaI.,1998;Shim
etaI., 1997)e humanos(ShamblottetaI.,
1998).Os protocolosparatransferênciade
genesusandoCGE foramdescritosanterior-
mentenaseçãosobreCTE.
O próximométodoparaintroduzirDNA
exógenoemanimaiscomoobjetivodeprodu-
zirtransgênicoséatransferênciadegenesme-
diadaporespermatozóides.Espermatozóides
deváriasespéciestêmdemonstradohabilida-
dedeseligaraDNA desnudo(Horanetal.,
1991;Lavitranoetal.,1989;Sperandioetal.,
1996)ouacomplexosdeDNA elipossomas
(Bachilleretal.,1991;Rottmannetal.,1992).
Geralmente,osespermatozóidessãocolhidos
na ejaculaçãoou no epidídimoe incubados
porperíodosvariadosa37-39°Cemmeiode
fecundação.Duranteosúltimos30minutos
a umahora,umasoluçãodeDNA éadicio-
nadaà suspensãode espermatozóidespara
gerarumaconcentraçãofinaldeDNA de 1-
25flg/ml(LavitranoetaI., 1989;Maioneet
al.,1998;Sperandioetal.,1996;Figura14.9).
Os espermatozóidestransformadospodem
serusadosemsistemasdefecundaçãoinvitro
(Lavitranoetal., 1989;Maioneetal., 1998;
Sperandioetal.,1996)ou inseminaçãoarti-
ficial(Gandolfietal.,1996;Schellanderetal.,
1995;Sperandioetal.,1996).Noentanto,a
maiorpartedosestudostêmseconcentrado
emsistemasdefecundaçãoinvitro.Parausar
célulasespermáticascomovetoresparatrans-
ferênciadegenes,deveocorrero transporte
V2\\B<0~\t
Figura14.9.Transferênciade DNA a embriãomediadaporespermatozóides.
312
de DNA exógenoparao oócitodurantea
fecundação.Váriosestudosavaliarame de-
monstraramestaformadetransferênciade
genesemdiversosestádiosdedesenvolvimen-
to,incluindoembriõesdeduascélulas,blasto-
cistoseanimaisadultos.Transferênciadege-
nescomsucesso,mediadasporespermatozói-
des,foramreportadasemcamundongos(Ba-
chilleretaI.,1991;Hochietal., 1990;Lavi-
tranoetaI.,1989;MaioneetaI.,1998),coe-
lhos(Brackettetal.,1971;Kuznetsov& Kuz-
netsov,1995),aves(Fainsoldetal., 1990),
Xenopus(Kroll & Amaya,1996)e bovinos
(Perezetal., 1991;SchellanderetaI.,1995;
SperandioetaI., 1996).A principalvanta-
gem dessemétodoparaproduzir animais
transgênicosé suasimplicidade;no entanto,
a desvantagemdestatécnicaé a habilidade
reduzidadogenomahospedeirodeincorpo-
rarDNA apresentadodestaforma.Apesarde
animaistransgênicosteremsidoproduzidos
pelatransferênciadeDNA mediadapor es-
permatozóides,os resultadosnãosãomuito
reprodutíveis.A maiorpartedosestudostem
obtidosucessofIxandoDNAa espermatozói-
deseintroduzindooespermatozóidenooóci-
to.Umnúmeromenordeestudostemnaver-
dadedocumentadoaproduçãodeembriões
transgênicos,eumnúmeroaindamenorde
estudosresultaramnaproduçãodeanimais
transgênicos.
A introduçãodecomplexosdelipossomas/
DNA é outratécnicasendoinvestigadapa-
ra introduzirDNA donadoemcélulaseem-
briões.Lipossomassãoestruturaspequenas,
consistindoemcamadasde lipídeosseme-
lhantesa lipídeosdemembrana,capazesde
protegerDNA exógenodadigestãoporpro-
teasese DNAse (Schaefer-Ridderet aI.,
1982).Lipossomascatiônicossãocapazesde
interagirespontaneamentecommoléculasde
DNA formandocomplexoslipídeo-DNA
(Felgneretal.,1987).Temsidopropostoque
interaçõesiônicasentreoexteriorhidrofílico,
positivamentecarregadodoslipossomas,eos
gruposfosfatocarregadosnegativamentedas
moléculasdeDNA, sãoresponsáveispelafor-
mação dos complexos(Mohn & Koller,
1995).A introduçãodoDNA exógenonascé-
lulasalvoocorreatravésdafusãodocomplexo
lipídeo-DNAcommembranascelulares(Fi-
gura 14.10).Sob condiçõesapropriadas,o
DNA exógenopodesertransferidoa células
eumaporçãodesteDNA selocalizanonú-
cleo(Felgneretal.,1987).Tantotransforma-
çõestransientes,quantoestáveis,decélulasde
mamíferostemsidoamplamentedemonstra-
dasnaliteratura.Oslipossomasemgeralapre-
sentammaiorefIciênciadetransfecção,em
comparaçãocomaeletroporaçãoouprecipi-
taçãodecálcio-fosfato(Felgneretal.,1987).
Umavantagemdousodelipossomascatiôni-
coséqueo tamanhodoDNAaparentemente
nãoéumfatorlimitanteduranteatransfecção
(Choietal.,1993;Lambetal.,1993).Atrans-
ferênciadegenesmediadaporlipossomastem
semostradoum métodoaltamenteefIciente
paratransformarcélulascultivadascomDNA
exógeno.Embriõesno estádiodeumacélula
tambémpodemserexpostosalipossomascar-
regandogenesclonadose,potencialmente,in-
corporarasseqüênciasdeDNAao seugeno-
ma.Asmetodologiasparaousodevetoresli-
possômicosemembriõesmamíferosainda
estãoemdesenvolvimento.Mesmoqueméto-
dosconfIáveise efIcientesnãosejamdesen-
volvidosparausarlipossomasnaproduçãode
indivíduostransgênicosemsualinhagemger-
minativa,estemétodocontinuasendomuito
útilparatransferirgenesalinhagenscelulares
cultivadas.
A eletroporaçãotemsidousadaparatrans-
ferirDNA clonadoacélulaseembriões(Gag-
neetaI.,1991;InoueetaI.,1990;Puchalski
& Fahl,1992;Reissetal., 1986;Tur-Kaspa
etal.,1986;Whitmer& Calarco,1992).Re-
sumidamente,as célulasalvo,ou embriões,
sãocolocadasemumasoluçãocontendoo
313
Figura14.10.TransferênciadeDNAa embriãomediadaporlipossomas
genedeinteresse.A soluçãoeascélulassão
expostasaumpulsoelétricodealtavoltagem
eduraçãomuitocurta(JlS),queprovocauma
quebratemporáriadamembranacelular(Fi-
gura14.11).Duranteessaquebraocorreo
aparecimentodeporosnamembrana,através
dosquaiso DNA podepenetrarnacélulae
fmalmenteatingironúcleo,ondepodeserin-
corporadoao genoma.Estemétodoé alta-
menteeficienteparaa transformaçãodecé-
lulascultivadascomDNA exógeno(Gagne
etal.,1991;Puchalski& Fahl,1992;Reisset
al.,1986;Tur-Kaspaetal.,1986).Estatécnica
temsidousadanatentativadeproduzirani-
maistransgênicos,atravésda eletroporação
deDNAa espermatozóides,quepor suavez
carregamo DNA exógenoatéo óvulonafe-
cundação(Gagneetal.,1991).Assimcomo
lipossomas,o usodaeletroporaçãodeDNA
314
nãotemsidocapazdepromovertransmissão
detransgenesatravésdalinhagemgerminativa
emespéciesdomésticas.No entanto,aeletro-
poraçãodeDNA acélulastroncoembrioná-
riasdecamundongos(Wurst& Joyner,1993),
e a transferênciasubseqüentedestascélulas
ablastocistos,pormicroinjeção,têmresultado
naproduçãodecamundongostransgênicos
(Camperetal., 1995).Estemétodopossui
grandepotencial,tantoisoladamente,quanto
emcombinaçãocomoutros,paratransferir
geneseficientementeparaaproduçãodeindi-
víduostransgênicos.
A biobalística,ou bombardeamentode
partículas,éummétodofísicoqueutilizami-
croprojéteisaceleradosparaintroduzirDNA
ououtramoléculasemtecidosecélulas(San-
fordetaI.,1991).Estemétodofoi desen-
volvidoinicialmenteporSanfordet.alo(1988)
, , , , , ,
, , , , , , ' , , , , ,
, , , , , " ,"""'"
,',',',',','.',',',
, , , , , ' , , , " ,,'
, ,
, ,
,-,
, , , , , , , ,
:':8:':':':':':':':':';
, , , , , , ,
"-,, ,
:',',','\:':'1
"-,,, ""
, , , , ,
, , , ,
"'.':':':"':',',',',
, , , , , , , , ,
, , ,
, , , ,
, , , , ,
, , , , " ,\,' , " ,
, ' , , , , , , , , ,
"" ,-"
:-:- \ :- :-:- :- :-
, , , , ,
, , " ""
"'-'" ,
""""' . ', . :' : -:-: -\ ' : -: ' : ' : ' : :- :- :- :.. , ..
, , , , , ,
, , , , , ,
Figura 14,11, Eletroporaçãode DNA emembrião,
.., , ...., ..,..
, ,.., ,
paratransferirgenesa plantas.Seuobjetivo
erasercapazdeatravessaraparedecelular,
querepresentavaumobstáculomajoritárioà
transformaçãogenéticadeplantas.Estemé-
todo temsido aplicadoprincipalmentena
manipulaçãogenéticadeplantas(Fitchetal.,
1990;FrommetaI.,1990;KleinetaI.,1987;
McCabeetal., 1988;McCabe& Martinell,
1993).Valeressaltarqueabiobalísticatam-
bémtemsido usadaparatransformarmi-
croorganismos(SanfordetaI.,1991)eorga-
nelascelulares,comomitocôndrias(Johnston
etaI.,1988).
A principalvantagemdabiobalística,em
comparaçãoaoutrosmétodosdetransfec-
ção,ésuahabilidademecânicaparaatraves-
sarmembranasbiológicas(BiewengaetaI.,
1997),nãosendodependentedaestrutura
oucaracterísticasdemembranadecélulas
alvo(Jiaoetal.,1993),nemtampoucodainte-
raçãoentremoléculasdeDNA comessas
membranasoucanais.
A introduçãoeexpressãodetransgenes
emdiversaslinhagensdecélulascultivadasin vitrotambémtemsidoalcançadacoma
adoçãodabiobalística(Baldarelli& Lengyel,
"1';
1990;Fizpatrick-McElligot,1992;Heiser,
1994;Johnston,1990;Klein et aI., 1992;
KosteretaI., 1996;Mialhe& Miller, 1994;
Woffendinetal.,1996;Yangetal.,1990;Yo-
shidaetaI.,1997;ZeleninetaI.,1991;Zele-
ninetaI.,1993;ZeleninetaI.,1989).No
entanto,existemapenasdoistrabalhosdes-
crevendoousodabiobalísticaparaintroduzir
DNA exógenoemembriõesdecamundongo.
Zeleninet aI., (1993)bombardearamem-
briõesde2-4células,mórulaseblastocistos,
comumaconstruçãogênicacontendoogene
deresistênciaàneomicinaadsorvidoapartí-
culasde tungstênio.Após transferênciaa
receptoras,umfetode 17diasfoi colhidoe
identificadocomopositivoparaapresençade
DNA exógeno.Cezaretal.,(1998)utilizaram
umequipamentobiobalísticodirigidoporgás
hélio, para introduzir partículasde ouro
adsorvidascomogenerepórterLacZemem-
briõesmurinosnoestádiodeumacélula.
O uso detécnicasdetransferêncianu-
clear(clonagem)podeteropotencialdeele-
var o númerode progêniesproduzidasa
partirdeumaúnicafêmea,naescalademi-
lharese possivelmentedezenasdemilhares
(BondiolietaI.,1990).Desdeo nascimento
da famosaovelhaclonada"Dolly" (Wilmut
etaI., 1997),a tecnologiadetransferência
nucleartemsetornadooutrametodologia
auxiliardisponívelparaa produçãodeani-
maistransgênicos.
O procedimentodetransferêncianuclear
utilizatantooócitosproduzidosinvitroquan-
toinvivocomocitoplasmadoador(citoplas-
to).O materialgenéticodo citoplastoé re-
movido(enucleação),deixandoapenasoci-
toplasma.Apósaenucleaçãodo oócito,um
núcleodoador(carioplasto)éinjetadonoes-
paçoperivitelínicodooócitoenucleado(cito-
plasto).O oócitoenucleadoeacélulasdoado-
rass~ofusionadasporeletrofusão.A eletro-
fusãodocitoplastoecarioplastoéaltamente
espécie-dependentenoquedizrespeitoàdu-
316
ração,meiodefusão,equilíbriodomeiode
fusãoeamplitudedopulso.Apósafusãodo
núcleodoadoredooócitoenucleado,ooóci-
to é ativadotantopor estimulaçãoquímica
quantoelétrica.Umaativaçãodesucessoini-
ciaodesenvolvimentoatéoestádiodeblasto-
cisto,seguidodetransferênciaaumarecep-
torapseudo-gestante.
Antesdonascimentoda"Dolly",investi-
gaçõesforamconduzidasparaavaliaçõesdo
citoplastoecarioplasto.PratheretaI. (1987)
investigaramo usodezigotosdesuínosco-
moo citoplastonatransferêncianuclearem
suínos.Existemváriasvantagensemseusar
o zigotocomoo citoplasto,umadasquaisé
onívelreduzidodefatorpromotordematu-
ração(MPF). Outravantageméqueo cito-
plastoestáativadoe prontoparadesenvol-
vimentosubseqüenteadiversosestádios.No
entanto,existemdesvantagensnousodezi-
gotoscomocitoplastosdoadores.A princi-
paldesvantageméanecessidadederemover
grandesporçõesdo citoplasma.O primeiro
suínoclonadocom sucessofoi produzido
usandoo zigotocomoo citoplasto.A vanta-
gemdeseusarumoócitoéqueapenasuma
pequenaporçãodo citoplasmaprecisaser
removida.Apesardessavantagem,existea
desvantagemparaooócitodequeocitoplas-
maprecisaserativado.
Antesde1997,atransferênciadenúcleos
estavalimitadaapenasacarioplastosdeori-
gemembrionária(Bondiolietal.,1990;Pra-
theretaI., 1987;PratheretaI., 1989;Robl
etaI.,1987;Smith& Wilmut,1989;Stice&
Robl,1988;Tsunoda& Kato, 1997;Tsuno-
da& Kato,1998;Willadsen,1986).Osca-
rioplastosescolhidoseramdeblastômerose
massacelularinternadeembriõesno está-
diodepré-implantação."Dolly"mostrouque
célulassomáticastambémpodemserusadas
comodoadorasdenúcleosnatransferência
nuclear.Depoisda produçãocom sucesso
de"Dolly",váriostiposcelularestêmsidoÍll-
vestigadosparaaproduçãodeanimaisclona-
dos, incluindo célulasda trofoectoderme
(Tsunoda& Kato,1998),célulasdocumulus
eovidutos(KatoetaI., 1998;Wakayamaet
aI.,1998),efibroblastosfetais(CibellietaI.,
1998b;WilmutetaI., 1997).
Célulastroncoembrionáriase célulassi-
milaresaCTE tambémtêmsidoempregadas
paratransferênciadenúcleos(Campbelletal.,
1996;Modlinskietal.,1990;Tsunoda& Ka-
to, 1993).No entanto,existeapenasumpro-
dutoclonadocomsucessoemovinos(Camp-
belletal.,1996).O potencialdatransferência
denúcleosparausonaproduçãodeanimais
transgênicos,dependefortementedatrans-
fecçãodecélulassomáticas,germinativasem-
brionáriase/ougerminativas.A utilizaçãode
CTE emsuínosofereceumafonteadicional
denúcleosembrionários,quepodemserusa-
dosemprotocolosdetransferêncianuclear.
A combinaçãodeCTE transfectadascomme-
todologiasdetransferêncianucleardevefor-
necerosinstrumentosnecessáriosparaapro-
duçãodeumgrandenúmerodeanimaisdo-
mésticostransgênicosgeneticamenteidênti-
cos.As tecnologiasde CTE e transferência
nuclearaindasãoexperimentaiseumaquan-
tidadeconsideráveldevariáveisprecisamser
examinadas.Ainda,poucoslaboratóriossão
habilitadosnessesprocedimentos,e o custo
previstodeumembriãosuínoclonadotrans-
gênicopermanecedesconhecido.A comercia-
lizaçãodestatecnologiavaipermitirqueuma
pressãodeseleçãosejaexercidaemfêmeas,
demodosimilaràquelaexercidanosmachos
atravésde inseminaçãoartificial(Wheeler,
1993;Figura14.12).
Finalmente,umoutrométodoparaapro-
duçãodeanimaistransgênicoséempregado
utilizando-secélulastroncoespermatogênicas
atravésdainjeçãodeDNA exógenonostes-
tículos.O DNA clonadodeinteresseéinjeta-
donostúbulosseminíferosdostestículos(Kim
etal., 1997;Yamazakietal.,1998).O DNA
injetadopodeserincorporadopelascélulas
troncoespermatogênicas,queeventualmen-
tevãodarorigema espermatozóidestrans-
gênicos.O sêmencontendoespermatozóides
transgênicospodeserusadoemmontanatu-
ralou fecundaçãoin vitro.Assimcomoa
transferênciadegenesmediadaporesperma-
tozóides,estemétodoésimplesmasaindaen-
contra-seemdesenvolvimento.
Estratégiasdetransgênese
Existemduasestratégiasbásicasnapro-
duçãodeanimastransgênicos.Essassãode-
nominadastransgênesede "ganhodefun-
ção" ou "perdade função".A idéiabásica
por trásdo paradigmadeganhodefunção
(Tabela14.1),équeatravésdaadiçãodefrag-
mentosclonadosdeDNAao genomaanimal,
alcançam-seváriosobjetivos.Um objetivoé
obternovaexpressãodeumprodutogênico
quenãoexistiapreviamentenaqueletipode
célulaou tecido.Um exemplodistoéa ex-
pressãodehormôniodecrescimentohuma-
no (hGH) emfígadodecamundongo(Pal-
miteretaI., 1982).O mesmoexemplopode
serusadoparaadicionarumgeneeobterex-
pressãoelevadano tecidoadequado(neste
casoapituitáriadecamundongo),ounuma
regiãoondeaexpressãodesteprodutogênico
nãoocorreusualmente(i.e.fígado,rinsein-
testinos).A expressãodonovoprodutogêni-
co podegerarumaalteraçãona regulação
deummetabólitosubseqüente,oudeumsis-
temaenzimáticonumprocessometabólico
ou detransduçãode sinal.Níveiselevados
do fatordecrescimentoIGF-I (insulin-like
growthfactor1) no sorode camundongos
transgênicoséumexemplodessetipodesi-
tuação.Outropotencialdeusodessaestraté-
giaéoempregodeconstruçõesdeDNA co-
dificantesdeumRNA mensageirodeorien-
taçãoreversaou antisenseem relaçãoao
promotor.EsseRNA antisenseseligaà fita
ou seqüênciasensedo RNA mensageiro,
317
~-:-:::-~.""""V' -.. . . . .. . . . . :d~34=
Remoção de DNA cromossômicodo oócito receptor
~ o@ Q <IDG @G :~~
Transferênciadenúcleosembrionáriosa partir deblastômerodoador
tfS::\
~
fifi\\
~
Fusãodemembranainduzidaeletricamente
Figura14.12.Transferênciade núcleoa partirde blastômerode embriãopré-implantacionalpara umovócitoenucleado.
transcritodoDNA natiyodoanimal,forman-
doumheteroduplexqueimpedea tradução
citoplasmáticada proteína (lzant et aI.,
1985).Seumaconstruçãoantisenseépro-
duzidaparaumaproteínainibitória,comoo
fatordecrescimentoe diferenciaçãoGDF-
8 (tàmbémconhecidocomomiostatina),po-
de-sepotencialmenteelevarocrescimentode
musculaturaesquelética(McPherronetaI.,
318
1997).O usofinaldestaestratégiadeganho
defunçãoépromoveradisrupçãodeumge-
neendógenoatravésdainserçãonogenoma
hospedeiro.Esteprocedimentoinduzoapa-
recimentodemutações,queporsuavezpo-
demserestudadas.Essamutagêneseporin-
serçãoéumaintegraçãoao acaso,fortuita,
emumaregiãofuncionaldogenomahospe-
deiro,portantonãopodeserplanejada;no
entanto,cercade 5% dosanimaistransgê-
nicosproduzidosirãoapresentartalmuta-ção.Palmiteretalo(1983)demonstraramque
umalinhagemdecamundongostransgênicos,
carregandoumgenedefusãoMT-l Herpes
tk,erafértil,porémosmachosnãoforamca-
pazesdetransmitiraseqüênciadeDNA exó-
geno.A conclusãofoiqueainserçãodotrans-
geneinativouumgeneendógeno,detalfor-
maqueosespermatozóidesqueherdaramtal
mutaçãoforamdestruídos(PalmiteretaI.,
1982).Eles demonstraramque DNA mi-
croinjetadopossuia habilidadede destruir
genesdoorganismohospedeiroenvolvidos
emprocessosmuitosutise específicosdo
desenvolvimento.
O paradigmade "perdadefunção"tem
muitasaplicaçõessimilaresà estratégiade
"ganhode função",especialmenteno que
concerneexpressãoexcessiva,mutaçõesde
inserçãoeantisense.Suaprincipaldiferença
éahabilidadededisrupçãodegenesdeuma
maneiradirigida.Estaestratégiaseutilizada
habilidadedeCTE derealizarrecombinação
homóloga.A produçãodeanimaistransgêni-
cosé dependentedahabilidadedascélulas
degerarrecombinantesestáveisentreoDNA
exógenoeo DNA cromossomaldogenoma
hospedeiro.A maioriadesseseventossão
recombinaçõesnão-homólogas,quandoo
DNA introduzidoseinsereaoacasonoge-
noma.No entanto,algumascélulaspossuem
o maquinárioenzimáticorequeridoparaa
recombinaçãoentreaseqüênciadeDNA in-
troduzidaeaseqüênciahomólogaouidênti-
ca no genomahospedeiro.Esteprocessoé
denominadorecombinaçãohomóloga,fre-
qüentementemencionadocomo"genetar-
geting".O fenômenodegenetargetingpossi-
bilitaatransferênciadealteraçõesgenéticas
criadasinvitroemsítiosprecisosnogenoma
embrionáriooucelular.Seascélulashospe-
deirassãocélulasembrionáriastotipotentes
ou pluripotentes(istoé,célulastroncoem-
brionárias,célulasgerminativasembrionárias
ou célulasgerminativasprimordiais)oucé-
lulassomáticasreprogramáveis,entãoestes
eventospodemsertransferidosà linhagem
germinativadaprogênie.O usodestaestra-
tégiapossuiumpotencialextraordináriopara
sefazermudançasgenéticasespecíficas,di-
rigidasao uso emmedicina,agricultura,e
paraoaprofundamentodanossacompreen-
sãodo controlegenéticodosprocessosde
desenvolvimento.
Tabela 14.1. Estratégiasbásicasna praduçãade animastransgênicas.
Ganho de função
Nova expressão
Expressão exacerbada
Regulação alterada
RNA antisense
Mutagênese de inserção
Perdadefunção
"Knock-outs"
Expressãoexacerbada
Mutagênesedeinserção
RNAantisense
Análise de transgenes
Logoapósonascimento,progêniesresul-
tantesdatransferênciadegenesporqualquer
dosmétodosdescritossãoexaminadaspara
apresençadoDNA exógenoemseugenoma.
EssaanálisedeDNA éusualmentefeitacom
areaçãoemcadeiadepolimerase(PCR) ou
análisepor Southernblot (Hogan et aI.,
1994).Animaisqueincorporamogeneclo-
nadoemseupróprioDNA sãotransgênicos
epodementãoserusadosparaestudossub-
seqüentes.
Aplicações
Pesquisabiológica,biomédicae genética
A produçãodeorganismostransgênicos
temsidoumavançotécnicomajoritáriono
estudodabiologia.Éummétodoimportante
paramudaro formatogenéticodeumani-
mal,fornecendoumatecnologiadirigidae
rápidaparagerarmutaçõesinduzidase"cru-
zamento"entreespécies.Animaistransgêni-
costêmsidoessenciaisaofornecimentode
319
novasperspectivasnoestudodosmecanismo
deregulaçãogênicaebiologiadedesenvolvi-
mento.A tecnologiatransgênicatempromo-
vidoavançossignificativoseoferecepossibili-
dadefuturasfascinantesemáreasadicionais,
como: 1) na açãode genesimplicadosna
participaçãodo desenvolvimentodecâncer
(oncogenes)evírusoncogênicos;2) nome-
canismoderegulaçãoe interaçãocelularno
sistemaimunológico;3)comomodelospara
doençasgenéticashumanas;4) nomecanis-
moecontroledocrescimentoe5)nosmeca-
nismosbásicosdebiologiaegenética.
Cadacéluladeumindivíduopossuitoda
ainformaçãorequeridaparasintetizarproteí-
nasquesãocaracterísticasdecadaumede
todosos tecidos.No entanto,apenasuma
parterestritadainformaçãopresenteéutili-
zadapelacélulaparticular.A sobrevivência
doanimaldependedaregulaçãodaexpres-
sãogênicanostiposcelularesapropriados,
bemcomodacoordenaçãoglobaldaexpres-
sãonumpadrãoadequadoduranteodesen-
volvimentodeumembriãoatéumadulto.A
utilidadedecamundongostransgênicosno
estudodaregulaçãodaexpressãodegenes,
controladapordesenvolvimentoeespecifici-
dadetecidual,temsidoelegantementeilus-
tradaemestudoscomogene(x-fetoproteína
(AFP) (Godboutetal.,1986;Hammeretal.,
1987;Krumlaufetal., 1985).Alfa-fetopro-
teínaé umaproteínasérica,predominante
no fetomurinoemdesenvolvimento,queé
ligadaaumaproteínarelacionadaàalbumi-
na.Essesdoisgenessãoativadosharmonio-
samenteno fígado,intestinose rinsdo feto
murinoemdesenvolvimento.O geneAFP é
inativadologoapóso nascimento,porémo
genedaalbuminacontinuaaserexpressado
nofígadodeanimaisadultos.Camundongos
transgênicosproduzidospor injeçãopronu-
clea;temsidoempregadosparamapearas
seqüênciasregulatóriasnogeneAFp,quesão
essenciaisparasuaexpressãoadequada.As
320
seqüênciasespecíficasdeDNA deinteresse
foramaquelasquerestringemaexpressãode
AFP apoucostecidos,e iniciamsuaregres-
sãoapósonascimento.Outrasáreasdabio-
logiadedesenvolvimentoqueutilizamani-
maistransgênicoscompreendemasintera-
çõesnúcleo-citoplasmaemcélulas,eo efeito
dalocalizaçãodegenesnoscromossomosna
suaexpressão.
O potencialparadirecionarcaracteresa
certostiposcelulares,atravésdousodepro-
motoresespecíficoscombinadoscomgenes
exógenos,tempromovidotentativasdemudar
afunçãofisiológicadeanimaisexperimental-
mente(Palmiter& Brinster,1986).A aplica-
çãodatecnologiatransgênicatemsidoparti-
cularmenteútilparaexaminaraimportância
daexpressãodeoncogenesouvírusoncogê-
nicosemmodelosanimais(Hanahan,1984;
Hanahan,1985;Hanahan,1986;Palmiteret
al., 1985;VanDykeetal., 1985;VanDyke
etaI.,1987).Algumassituaçõesquepodem
serfocadasutilizandoestesmétodossão:o es-
pectrode tecidosacessíveisà atividadede
transformaçãodo oncogene,a relaçãoentre
oncogenesesuahabilidadedecooperarcom
oncogenesdiferentesnaformaçãodetumo-
res,eo papeldeoncogenesno crescimento
e diferenciação.Tumoressãoformadosna
maioriadasvezesemqueoncogenessãoin-
corporadosemcamundongostransgênicos,
usandováriospromotoresligadosaomycou
rasoncogene(OrnitzetaI., 1985;Quaifeet
al.,1987).No entanto,quandoomesmopro-
motorfoiusadocommycouras,algunsteci-
dosforamaparentementemaisoumenossus-
cetíveisàformaçãodetumoresporumouou-
trodosoncogenes.O pâncreasésuscetívelà
transformaçãopormycmasnãoporras.Esses
resultadossugeremqueeventoscelularesadi-
cionaissãorequeridosparaefetuaro desen-
volvimentodetumoresmediadosporoncoge-
nes(Landetal.,1983).Camundongostrans-
gênicosrelevantestambémtêmfornecido
modelosvaliososparao estudodapatologia
dedoençasinduzidasporvírusoncogênicos,
comoa leucemiadecélulasT humana.
Camundongostransgênicossãoum ins-
trumentoimportantenoestudodosgenesde
imunoglobulinas(Altetal., 1985;Brinsteret
aI., 1983;Bucchinietal., 1987;Goodhardt
etal.,1987;Storb,1987).Essesgenessão
responsáveispelaproduçãodeanticorposno
sistemaimune.Váriosgrupostêmreportado
quegenesdeimunoglobulinasfuncionalmen-
terearranjadoseintroduzidosemcamundon-
gos,podemserapropriadamenteativados,re-
sultandonumaalteraçãodopadrãoinerente
deimunoglobulinasdocamundongo.Ainda,
umsistemaimunefuncionalenvolveumgru-
pocomplexodecomunicaçõescélula-a-célu-
Ia.Animaistransgênicosvãopermitiro estu-
dodafunçãoimuneemanimaisquesãopré-
programadoscomcertosanticorpos.Issopo-
deserdegrandevalorno estudodasíndro-
me de imunodeficênciaadquirida(AIDS)
causadapelovírusdeimunodeficiênciahuma-
no (HIV; PezenetaI.,1991).
Algumasdoençasgenéticasquetêmsido
estudadas,utilizandoanimaistransgênicos,
sãohipogonadismooureduçãodaatividade
funcionaldosováriosoutestículos,desordens
demielinização,comodistrofiamuscular,e
miasteniagravis(doençadeLou Gehrig's),
e doençasou desordenssanguíneas,como
talassemia(CiavattaetaI., 1995;Costantini
etaI., 1986;PasztyetaI., 1995;Yangetal.,
1995)eanemiasicklecell(Pasztyetal.,1997;
RyanetaI., 1997).
Camundongos,coelhos,ovinosesuínos
transgênicostêmsidousadoscomomodelos
paraexaminaro crescimentopós-natalde
mamíferos(BremetaI., 1985;Ebertetal.,1988;Ebert et aI., 1990;Hammeret aI.,
1985;Murrayetal.,1989;Polgeetal.,1989;
Purseletal.,1987;Rexroadetal.,1989;Rex-
roadetaI.,1991;Seamark,1987;Viseetal.,
1988;Wieghartetal., 1990).Os genesdo
hormôniodecrescimentoe fatordecresci-
mentoinsulin-liketêmsidoincorporadosem
animais.Isto tempossibilitadoo estudoda
expressãocrônicadesteshormônios,indepen-
dentementedasuaregulaçãonormal(Brem
etal., 1985;Ebertetal., 1988;Ebertetal.,
1990;Hammeretal., 1985;Murrayetal.,
1989;Polgeetal., 1989;PurseletaI.,1987;
Purseletal.,1989;Rexroadetal.,1989;Rex-
roadetal.,1991;Seamark,1987;Viseetal.,
1988;WieghartetaI.,1990).Resultadostêm
mostradoque o aumentodo hormôniode
crescimentohumano(hGH) induzumaeleva-
çãonocrescimentoeeficiênciadeconversão
alimentarnasespéciesdomésticas,porém
acompanhadadeefeitoscolaterais,taiscomo
maiorincidênciadeartriteeespessamentodos
ossos(Ebertetal., 1988;EbertetaI.,1990;
Papaioannouetal., 1979;Purseletal.,1987;
Wieghartetal., 1990).Resultadossimilares
têmsido demonstradoscom hormôniode
crescimentosuíno,massemefeitosemartrite
ou crescimentodo esqueleto.
Existemliteralmentemilharesdelinhagens
deanimaistransgênicos(primariamenteroe-
dores)produzidasparaestudaralgunsaspec-
tos específicosda biologia,genéticaou de
doenças.Os exemplosdescritosacimasão
apenasapontadoiceberg.O usodatecnolo-
giatransgênicanapesquisabiológica,médica
egenéticaélimitadoapenaspelanossaima-
ginação,criatividadee ingenuidade.
Aplicaçõesdatransgênesenaproduçãoanimal
Existeminúmerospotenciaisdeaplicação
dametodologiatransgênicaparadesenvolver
linhagensnovasoualteradasdeanimaisdo-
mésticosimportantesparaa agropecuária.
Aplicaçõespráticasdatransgênesenaprodu-
çãoanimalincluemomelhoramentonapro-
duçãoecomposiçãodeleite,nataxadecres-
cimento,composiçãodecarcaça,resistência
a doenças,performancereprodutiva,proli-
ficidadee alteraçãodascaracterísticasde
321
célulase tecidosparaapesquisabiomédica
(Wheeler& Choi, 1997).A produçãode
suínostransgênicoscomhormôniodecresci-
mentofuncionacomoumexemploexcelente
dovalordestatecnologia(Bremetal.,1985;
HammeretaI.,1985).A alteraçãotransgê-
nicadacomposiçãodoleitepossuio poten-
cialdeaumentaraproduçãodecertaspro-
teínase/oufatoresdecrescimentodeficientes
noleite(BremeletaI.,1989).O melhora-
mentodovalornutricionalouterapêuticado
leitepodeproduzirumimpactoprofundona
sobrevivênciae crescimentode recémnas-
cidos,tantoemhumanosquantoemanimais.
Genescodificantesdeproteínasdevalorfar-
macêutico,comoo fatordecoagulaçãohu-
manoIX, geneticamentedeficienteemhe-
mofílicos,podeser incorporadoemvacas
transgênicas.Essaproteínapodeserextraí-
dadoleite,purificadaefornecidaterapeuti-
camentea humanos.O uso de CTE e/ou
transferêncianuclearvaifacilitara introdu-
çãodessesgenesdemaneiradireta,através
darecombinaçãohomóloga.Váriosexemplos
sãodescritosa seguir.
Modificaçãodo Leite
Avançosna tecnologiade DNA recom-
binantetêmfornecidoaoportunidadetanto
dealteraracomposiçãoquantodeproduzir
proteínastotalmentenovasnoleite.Essasal-
teraçõespodemmelhorarovalor,assimco-
moaumentarospotenciaisdeutilizaçãodo
leite.O melhoramentodo crescimentoou
dosíndicesdesobrevivênciadeanimaisen-
volvidosno setorprodutivo,atravésdamo-
dificaçãoda composiçãodo leite,requera
produçãode animaistransgênicosque: 1)
produzammaiorquantidadedeleite;2)pro-
duzamleitecomumvalornutritivomaisalto;
ou3)produzamleitequecontenhaumapro-
teína"nutricêutica".Osprincipaisnutrientes
doleitesãoproteína,gorduraelactose.Atra-
vésdaelevaçãodequalquerumdessescom-
ponentespode-seproduzirum impactono
322
crescimentoesaúdedaprogênieemdesen-
volvimento.Em váriasespéciesprodutivas,
comobovinos,ovinosecaprinos,osnutrien-
tesdisponíveisparaosprodutosjovenspo-
demserfatoresnãolimitantes.No entanto,
aproduçãodeleiteemporcaslimitaocresci-
mentodosleitões,econseqüentementeapro-
duçãodesuínos(HartmannetaI.,1984).Em
suínos,44%da taxade crescimentode lei-
tõespodemseratribuídosàproduçãoecom-
posiçãodoleitedaporca(LewisetaI.,1978).
Métodosqueaumentamo crescimentode
leitõesduranteaamamentaçãoresultamnum
aumentodepesoaodesmame,emumaredu-
çãononúmerodediasrequeridoparaalcan-
çarpesodemercadoe,portanto,emumare-
duçãodaquantidadedealimentorequerida
paraosanimaisatingirempesodemercado.
A altapercentagemdataxadecrescimen-
toatribuídaaoleiteindicaautilidadepoten-
cialdestatecnologiaparaodesenvolvimento
deleitões.Umaestratégiaparaelevarapro-
duçãodeleiteemsuínospodeseracompa-
nhadadealteraçõesnoscomponentesdolei-
te,comolactose,umosmolarizantemajoritá-
riodoleitenascélulasdaglândulamamária.
A expressãoexcessivadelactoseno leitede
suínosvaiaumentaro consumodecarboi-
dratospelosanimaisjovensemdesenvolvi-
mento,resultandonomelhoramentodocres-
cimentodessessuínos.Um exemplodesta
estratégiaédescritoa seguir.
Suínostransgênicoscontendoconstru-
çõesgênicasprojetadasparamelhoraro leite
deporcastêmsidoproduzidos(BlecketaI.,
1996).Suínostransgênicosiniciaispossuíam
umaconstruçãogênicaparaa produçãoda
proteínaa-Iactalbuminanoleite(a-IA). Re-
sultadosdeestudospreliminaresdemonstra-
ramquearegiãoregulatória5'dea-IA éca-
pazdedirigiraltosníveisdeexpressãodea-
IA especificamenteno tecidomamáriode
camundongostransgênicos(Bleck& Bre-
mel,1994).Ainda,essesresultadosindica-
ramqueosvetoresconstruídosparaa-LA
foramexpressosemníveiselevados.Camun-
dongostransgênicos,produzidoscomames-
maconstruçãogênica,produzirammaislei-
teesuaprogêniecresceu8,7%maisrápido
quecamundongosnormais(BostonetaI.,
1999).Nessescamundongostransgênicos,
a expressãoelevadadogenea-LA bovina
coincidiucomumaatividademamáriaau-
mentadadesíntesedelactose(Bostonetal.,
1995).Suínostransgênicoscontendoogene
a-LAbovinapermitiramoestudodahabili-
dadedea-LA demelhorara produçãoe
composiçãodo leiteemsuínos.Adicional-
mente,osefeitosdealteraçõespotenciaisdo
leite,nocrescimentoedesenvolvimentode
suínosestãosendoanalisados.
A construçãogenômicaa-LA utilizada
nesseestudocontinha2,0kb deregiões
flanqueadoras5',aregiãocodificantede1,7
kbdogenee1,0kbderegiõesflanqueadoras
3' (BlecketaI.,1996;Figura14.13).Duzen-
tosembriõespronuclearessuínosforaminje-
tadoscomo vetora-LA. Os embriõesma-
nipu1adosforamtransferidosa 11recepto-
rasoCincodas11receptoras(45,5%)con-
duziramgestaçõesa termoe 31 leitões
(15,5%dosembriõestransferidos)foram
desmamados.Umanimal,dos31(umma-
cho),foipositivoparao transgene.
Resultadosdoestudodemonstraramque
oleiteproduzidoporporcastransgênicasa-
LAbovina,continha0,4-0,9gramasdea-LA
bovinapor litro(Blecketal., 1998b).A con-
centraçãodea-LA bovinafoicorrelacionada
diretamentecomaconcentraçãodeproteínas
endógenasporcrnasdoleiteduranteos21dias
delactação.A adiçãodea-LA bovinaelevou
aconcentraçãodea-LA total(bovina+por-
cina)doleiteem50%(Figura14.14).A con-
centraçãodea-LA bovinafoi maisaltanos
diasOe5 delactação,ediminuiudeacordo
comoprogressodalactação.A relaçãodea-
LA bovinaparasuínamudoudurantea lac-
taçãodaporca.Essarelaçãofoide4,3para1
nodiaOdelactação,masaoredordodia20
delactaçãoarelaçãofoide0,43para1.Isto
sugeriuqueo transgenebovinoeogenesuí-
no endógenoestãosobmecanismosdecon-
troleligeiramentediferentes.O nívelmaisalto
dea-LA, presentenodiaOdelactaçãofoicor-
relacionadocomumapercentagemmaisalta
de lactoseno diaO emporcastransgênicas
(3,8%)emcomparaçãoaosanimaiscontrole
(2,6%).Emboraa percentagemde lactose
tambémfossemaiselevadanasporcastrans-
gênicasnosdias5e10delactação,diferenças
significativasnãoforamobservadas.Essesda-
dossugeremqueaproduçãodea-LA élimita-
daaoiníciodalactaçãoemsuínos.Ainda,con-
centraçõesmaiselevadasdea-LA no início
dalactaçãopodemdesencadearmaiorsecre-
çãodeleite(Figura14.15).
A taxadecrescimentodeleitõesamamen-
tadospor porcastransgênicasfoi compara-
3'Região
Flaogueadora(~29bp)
5'RegiãoFlanqueadora(2,0kb)
Exon1
(160bp)
Exon2 Exon3
(159bp) (76bp)
Exon4
(329bp)
Figura14.13.Estruturadaconstruçãogênicaa-tAbovinamicroinietada.Aregiãoflanqueadora5'édeaproximada-mente2.0kb,a regiãocodificantelexonse intronsléde2.0kb,ea regiãoflanqueadora3'éde329
paresdebasesIBlecketai, 1998b).
323
1 2345678
a-lactalbumina
Suína
a-lactalbumina
Bovina
Figura 14.14.Separaçãodea-Iactalbuminabovinae porcina,usandouréianãoredutora,PAGE.Colunas1e 8: leite
de vaca.Colunas3 a 6: Leitede porcacontrole,dia 20 de lactação.Colunas2 , 4, 5 e 7: leitede
porcatransgênica,dia20 delactação.Colunas2 e 5 mostrama migração"normal"da a-Iactalbumina
bovina.Colunas4 e 7 mostramo mobilidadereduzidaalteradoda proteína(Blecketai., 1998b).
800
]'
b:õ700
~--
!\S
.S 600~
O
j:Q
!\S
'§ 500
;::I
~400
......u
!\S-
I
d 300 .
O
T.
...
. T.
.L
10
I
155
DiadeLactação
Figura14.15.Produçãodea~actalbuminabovinanoleite
deporcastransgênicasduranteumalacro.
çãode 20 dias(primeiroparto).Amostras
deleiteforamcoletadasnosdias0,5. 10,
15 e 20 de lactação.Os resultadossão
umamédiadetrêsporcastransgênicos.As
barrosde erromostrama médiode erro
padrãoIBlecketai., 1998b).
da.comaqueladefilhotesamamentadospor
porcascontrole.Ao desmame(dia21), lei-
tõesamamentadospelastrêsporcastransgê-
324
20
nicaspesaramaproximadamente500ga
maisqueanimaisamamentadosporseispor-
cascontrole(4,32kgvs.3,83kg)(Bleck,GT,
Donovan,SM, Seigel,M, Wheeler,MB,
dadosnãopublicados).
Umsegundomecanismopeloqualaal-
teraçãonacomposiçãodoleitepodeafetar
o crescimentoanimal,éa adiçãoousuple-
mentaçãodehormôniosbenéficos,fatoresde
crescimentooufatoresbioativosaoleiteatra-
vésdousodeanimaistransgênicos.Temsido
sugeridoquesubstânciasbioativas(lGF-I,
EGF,TGF-aelactoferrina)noleitepossuem
funçõesimportantesnoneonato.Essaspro-
teínasinfluenciamo crescimento,desenvol-
vimentoematuraçãodointestino,osistema
imuneeosórgãoendócrinos(Grosvenoret
aI.,1993).Aexpressãoexcessivadessaspro-
teínasno leiteatravésdo usodeanimais
transgênicospodemelhoraro crescimento,
saúdeesobrevivênciadaprogênieemdesen-
volvimento.
Emtrabalhoanterior,foidemonstradoque
suínosjovenscriadosartificialmente,alimen-
tadoscomfórmulassuplementadascom500
. a 1000Ilg/l deIGF-I (insulin-likegrowth
factar)humanorecombinante,duranteospri-
meiros14diaspós-parto,possuíramvilosida-
desintestinaismaislongasemaioratividade
delactasequesuínosalimentadosexclusiva-
mentecomafórmula.Baseadosnessesresul-
tados,nossoobjetivofoiproduzircamundon-
gosesuínostransgênicosIGF-I, paraexami-
narosefeitosdeníveiselevadosdeIGF-I na
glândulamamáriaenoleite.O IGF- I devein-
fluenciarocrescimentoneonatal,saúdeintes-
tinal,sobrevivênciadecrias,crescimentoma-
máriodeporcasesíntesedeleite.O vetorgê-
nicoécompostodogenea-Iactalbuminabo-
vinaea seqüênciagênicacodificantedos70
aminoácidosdopeptídeoIGF-I humanoma-
duro.IGF- I humanoéidênticoaospeptídeos
suínosebovinos.A seqüênciadogeneIGF-
I foi inseridadiretamenteatrásdaseqüência
codificantedopeptídeosinaldea-Iactalbumi-
na,noexon1dogene,parapermitirsecreção
de IGF-I no leite.Atéo presentemomento,
trêslinhagensdecamundongostransgênicos
equatrosuínosmachosfundadorestransgê-
nicosforamgeradosusandoestaconstrução
gênica.Setentaeumleitõesvivosnascerama
partirdereceptorascarregandoembriõesinje-
tados.Quatrodessesanimaisforamtransgê-
nicos,resultandonumaeficiênciadetransfe-
rênciadegenesde5,6%.
Outraspropriedadesdo leitequemere-
cem consideraçãopara modificaçãosão
aquelasqueafetamasaúdehumanaeanimal.
Temsidodemonstradoqueanticorposespe-
cíficospré-formadospodemserproduzidos
emanimaistransgênicos(Storb,1987).De-
veserpossíveldeseproduziranticorposna
glândulamamáriacapazesdeprevenirmastite
embovinos,suínosecaprinoseMMA (masti-
te-metrite-agalaxia)em suínose/ou anti-
corposqueauxiliemnaprevençãodedoen-
çasnosanimaisdomésticosouemhumanos
(Pursel&Rexroad,1993).Outroexemploé
aumentaras proteínasque desempenham
papéisfisiológicosdentrodaprópriaglândula
mamária,comoalisozima(Magaetal.,1995)
ououtrospeptídeoscompropriedadesanti-
microbianas.
É importanteseconsiderarousodetrans-
gênicosparaaumentarcomponentesespecí-
ficosquejá estãopresentesnoleiteparapro-
pósitosdemanufatura.Umexemplopodeser
oaumentodeumdoscomponentesdecaseí-
nado leite.Issopodeelevaro valordo leite
nosprocessosdemanufaturação,taiscomo
naproduçãodequeijoouiogurte.Asproprie-
dadesfísicasdeumaproteínatambémpodem
seralteradas,talcomoelevaraglicosilaçãoda
~-caseína(ChoietaI.,1996).Alteraçõesnas
propriedadesfísicaspodemgerarprodutos
lácteoscom melhorescaracterísticas,como
queijodebaixoteordegorduracommelhor
sabor(BlecketaI., 1995).
Atravésdousodatransgêneseetecnolo-
giade DNA recombinante,épossíveldese
adicionarvirtualmentequalquerproteínaao
leite,apartirdequalquerespécieanimal,ve-
getaloubacteriana(Bremeletal.,1989).Por
exemplo,é possívelse expressarproteínas
adicionaisdoleiteeoutrasproteínasfarma-
cêuticasdevalorno leitedecamundongos,
coelhos,suínos,caprinoseovinos(Buehler
et aI., 1990;EbertetaI., 1991;Simonset
aI.,1987;WalletaI., 1991;Wurst& Joyner,
1993).As vantagensdasíntesemamáriade
proteínasincluemahabilidadedascélulasse-
cretorasmamáriasde modificarproteínas
adequadamente,demaneiraqueessassejam
biologicamenteativaseentãosecretadasno
leiteemgrandesquantidades.Issotemresul-
tadono desenvolvimentodeum novoseg-
mentodaindústriafarmacêutica,quetemsi-
do denominadode"biapharming,ouseja,a
produçãodeanimaisbioreatores.Exemplos
degenesintroduzidosemanimaistransgêni-
cosqueresultaramnaproduçãodeváriosti-
posdiferentesdeproteínasnoleitesãocita-
dosnatabela14.2.
325
Tabelo14.2. Expressãode proteínastransgênicosno glândulamamóriadeespéciesdomésticos.
Modificaçãodo crescimentoe composição
decarcaça
A produçãodeanimaisdomésticostrans-
gênicostemsidoum instrumentoessencial
nofornecimentodenovasperspectivaspara
acompreensãodaaçãodegenesenvolvidos
nocontroledocrescimento(Bremetal.,1985;
Hammeret aI., 1985;PurseletaI., 1989;
Seamark,1987;ViseetaI., 1988;Wieghart
etaI.,1990).Camundongos,ovinosesuínos
transgênicostêmsidousadosparaexaminar
o crescimentopós-nataldemamíferos.Ge-
nesdohormôniodecrescimentoe fatorde
crescimentosemelhanteàinsulina(IGF) têm
sidoincorporadoseexpressosemníveisva-
riadosemanimaistransgênicos(Seamark,
1987).Essetipodetrabalhopermitiuoestu-
dodaexpressãocrônicadesseshormôniosno
crescimentodemamíferos(Seamark,1987).
Resultadosdesseestudomostraramqueum
aumentono hormôniodecrescimentohu-
manoinduza um aumentono crescimento
eeficiênciadeconversãoalimentaremsuí-
- nos:porémacompanhadosdeefeitoscolate-
raiscomoumaumentonaincidênciadear-
trite e espessamentoósseo(Purselet aI.,
326
1990).Aumentossimilaresnocrescimentofo-
ramdemonstradoscomogenedohormônio
de crescimentosuíno (pGH), massemau-
mentonaocorrênciadeartriteecrescimento
anormaldoesqueleto(Viseetal.,1988).Um
enfoquealternativofoi conduzidoatravésda
introduçãodo oncogeneaviário"ski",que
tinhasidopreviamentedemonstradocapazde
causarhipertrofiadeváriosmúsculos,aomes-
motemporeduzindoagorduracorporal(Su-
traveetal.,1990).Estaestratégia,noentanto,
tevesucessolimitado,apesardealgumahiper-
trofiamusculartersidoobservadaemalguns
suínostransgênicos(Purseletal.,1992)ebo-
vinostransgênicos(Bowenetal., 1994).
O geneRN(RendementNapole)ougene
Carne-Ácidatemsidoimplicadonaprodução
reduzidade carneparaprocessamentoem
váriaslinhagensdesuínosHampshire,puros
ecruzados.O baixopH post-mortemdacar-
caçaresultaemdiferençasna qualidadede
carnesuína,quepodemserdistinguidaspor
váriaspropriedades,taiscomocapacidadede
reterágua,cor,marmorização,firmeza,força
dedisrupçãoeproduçãodisponívelparapro-
cessamento.O "knock-out",oudisrupçãodo
ProteínaExpresso Espécie Promotor Referência
aoctolbumino Suínos aoctolbuminobovino Blecket01.,1998b
FatorcoogulonteIX Ovinos l3-Ioctoglobulinoovino Simonset01.,1988
a-I onli-tripsino Ovinos l3-Ioctoglobulinoovino Wrightetol.,1991
Ativodorplosminogênicoteciduol Coprinosecoelhos Proteínaácidodosorodoleite Ebertetol.,1991;
asl-<oseínobovino Riegoet01.,1993IGF-I Coelhos asl-<oseínobovino Bremet01.,1994
Loctoferrino Bovinos ashoseínobovino Krimpenfortet01.,1991
FatorcoogulonteVII Ovinos l3-Ioctoglobulinoovino Holteretol.,1993
ProteínaC Suínos Proteínaácidodosorodoleite Velonderel01.,1992
Proteínaácidodosorodoleite Suínose ovinos Proteínaácidodosorodoleite Shomoyetol.,1991;
Wolletol.,1991;Wolletol.,1996
Interleucinohumono-2 Coelhos Ikoseínodecoelhos Buehleret01.,1990
geneRN (umavezidentificadoeseqüencia-
do), podefornecerum métodoalternativo
paraalteraro potencialglicolítico,pH post-
morteme portantoa qualidadede carne
nessaespécie.
Outrosloci específicosquepodemafetar
ospadrõesdecrescimentosão:o receptorde
rianodina(previamenteo locusdo genede
sensibilidadeao halotano,Hal; Fujii et aI.,
1991),o myo-D (Harvey,1991;Sorrentino
et aI., 1990),o callipyge(Snowderet aI.,
1994)eodamiostatina(fatordecrescimen-
to/diferenciação-8,GDF-8;McPherronetal.,
1997).Deacordocomdescriçãorecenteno
camundongo(McPherronetal.,1997),oge-
nedamiostatinaéumlocuscomumpotencial
excepcionalmenteintrigantepara"knock-out"
usandocélulastroncoembrionáriasemespé-
ciesprodutorasdecarne.A perdadaproteína
miostatinaresultanum aumentoda massa
muscularesquelética.Camundongossemesse
genetêmombrosequadrismaislargos.O au-
mentodamassamuscularesquelética,apa-
rentementenormal,é distribuídopor todaa
carcaça.Gruposmuscularesindividuaisde
knock-outshomozigotospossuempeso2-3
vezesmaiorqueodeanimaiscontrole.O con-
teúdodegordurafoi comparávelnosgenóti-
posmutantese normais(McPherronetal.,
1997).Ospesquisadoresconcluíramqueuma
grandepartedoaumentonamassamuscular
esquelética,ocorreudevidoaumahiperplasia
dascélulasmusculares.Certamenteexistem
váriosgenespotenciaisrelacionadosaocres-
cimento,incluindofatoresdecrescimento,re-
ceptoresoumoduladores,queaindanãofo-
ramusados,maspossuemimportânciaprática
na produçãode animaistransgênicoscom
índiceselevadosdecrescimentoe/ouconver-
sãoalimentar.
Modificaçãoda resistênciaa doenças
Um aspectomuitointeressantedousode
transgênicosna agropecuáriaé o potencial
deaumentara resistênciaadoençasatravés
daintroduçãodegenesespecíficosemanimais.
A identificaçãodegenesúnicosnocomple-
xoprincipaldehistocompatibilidade(MHC),
queinfluenciaarespostaimune,foiessencial
ao reconhecimentodabasegenéticadere-
sistência/suscetibilidadea doenças(Bena-
cerraf& McDevitt,1972).Apenasrecente-
mente,elucidou-sequeexistemmuitosas-
pectosda resistênciaou susceptibilidadea
doençasemespéciesdomésticasquesãode-
terminadosgeneticamente(Lewin, 1989).
CTE e/ou transferêncianuclearserãomuito
úteisparaamanipulaçãodegenesougrandes
gruposdegenesdoMHC. O usodeCTE ou
transferêncianuclearvaipermitiraintegração
defragmentosmuitosmaiores(>100kb)de
DNA doquetemsidopossívelatéomomen-
tocomainjeçãopronuclear.Grandesvetores
de cromossomosartificiais de leveduras
(YAC)contendogenesextremamentelongos
(>400kb) temsidotransfectadosemCTE,
produzindotransgênicosmodificadosemsua
linhagemgerminativa(Choi et aI., 1993;
LambetaI.,1993).A manipulaçãodoMHC
emanimaisdeprodução,atravésdeCTE ou
transferêncianucleare transgênese,pode
produzirum efeitobenéficomajoritáriona
resistênciaadoençasparaprodutores.
Umexemploespecíficoondeatransgênese
temsidoaplicadanaresistênciadedoenças
emanimaisprodutivoséaproduçãodesuí-
nos quesãoresistentesà influenza.linha-
gensdefibroblastosdecamundongoseca-
mundongosquecontêmaproteínaMx+ são
resistentesàinfecçãocomovírusdainfluen-
za (HalleretaI.,1981;StaehelietaI.,1986).
O cDNA de Mx temsido introduzidoem
zigotosporcinosproduzindosuínosquesão
resistentesà influenza(BrenigetaI.,1990).
Essamanipulaçãoé um exemploexcelente
decomoatransgênesepodeserusadapara
aumentararesistênciaadoençasemanimais
domésticos.A aplicaçãoda tecnologiade
327
CTE outransferêncianuclearvaiproporcio-
narumaumentodealelosbenéficos,ejoua
remoção(viaknock-out)dealelosindesejá-
veis,associadoscomresistênciaoususcetibi-
lidadea doenças.Um exemploé o knock-
outdoreceptorparao antígenoK88.A au-
sênciadesseantígenoconferiuresistência
tantoa infecçõesinduzidasexperimental-
mentequantonaturalmentecomE. coliK88
positiva(Edfors-Liliaetal.,1986).Áreaspo-
tenciaisparainvestigaçãoincluemresistência
a: 1)organismosparasitascomotripanosso-
masenematódeos;2) organismosbacteria-
nosouvirais,comoovírusdeleucemiabovi-
na,vírusdepseudo-raiva,vírusdefebreafto-
sa,Clostridiumsp e Streprococcussp;e 3)
doençasgenéticas,taiscomoDUMPS (defi-
ciênciade UMP sintetase),"mule[oot" e
BLAD (deficiênciadeadesãodeleucócitos
bovina).Essaéapenasumalistaparcialde
muitosorganismosoudoençasgenéticasque
reduzema eficiênciadeproduçãoepodem
seralvosparamanipulaçãoviaCTE outrans-
ferêncianuclear.
Modificação da performancereprodutivae
proliflcidade
Vários genespotenciaisforamrecente-
menteidentificados,quepodemafetarpro-
fundamenteaperformancereprodutivaepro-
lificidade.Essesincluemosgenesdoreceptor
deestrógeno(ESR) efecundidadeBooroola
(FECB).Rothschildetalo(1994)reportaram
umaassociaçãodeumpolimorfismonogene
receptorde estrógeno(ESR) comtamanho
deleitegadasemsuínos.Elesobservaramuma
diferençade 1,4suínosnascidosa maispor
leitegadaentreosdoisgenótiposhomozigo-
tos.A introduçãodeum geneESR mutado
oupolimórficopodeaumentaro tamanhode
leitegadasemdiversasraçasde suínos.Um.
. geneautossômicoúnicoparafecundidade,o
geneBooroolaFECB,queprovocaíndicesele-
vadosdeovulação,foiidentificadoemapeado
328
emovelhasMerino (PiperetaI., 1985).Ca-
dacópiadogeneécapazdeaumentaro ín-
dicedeovulaçãoemaproximadamente1,5
oócitos,apesardo aumentono númerode
produtosnascidosnão sercompletamente
aditivo.A produçãodeovinostransgênicos
contendooaleloBooroola(FECB)apropria-
dopodeelevara fecundidadeemumnúme-
ro dediversasraças.
Modificação de característicasde célulase tecidos
Uma aplicaçãoúnicadastecnologiasde
CTE outransferênciadenúcleoséaprodu-
çãodecélulas,tecidosouórgãosquecontêm
antígenoshumanosouproteínasparaxeno-
transplanteseoutrosusosbiomédicos.Exem-
plosusandosuínosincluemodesenvolvimen-
to decélulas~pancreáticasparaterapiade
insulina,célulasdopaminérgicasparaterapia
deParkinson,hemoglobinahumanaeproteí-
na C parasangueartificial(Swansonetal.,
1992;Velanderetal.,1992),hepatócitospara
fígadosartificiais,célulastroncohematopoiéti-
casparaleucemiaouanemia,ecorações,pul-
mões,rins,fígadosecórneasparatransplantes
deórgãos(Lin& Platt,1996).Adicionalmen-
te,linhagenscelularesespecíficasderivadasde
animaistransgênicosproduzidosviaCTE, po-
demserúteisparaoutrasaplicaçõesbiomé-
dicasou demanufaturação.
Fatores que Afetam a Eficiência de
Produção de Animais Transgênicos
A habilidadedeproduziranimaistransgê-
nicoséumaferramentamuitopoderosa,no
entanto,influenciadaporalgunsfatoresmui-
to importantes.Asseçõesseguintesvãodes-
tacaralgumasdestasquestões.Algunsfatores
reconhecidosinicialmenteforama concen-
traçãodeDNA injetado,formadeDNA inje-
tado(linearversusenovelado)elinhagemde
camundongos(Brinsteretal.,1985).Consi-
deraçõesadicionaisqueinfluenciamaeficiên-
ciadatransferênciadegenesaembriõessão
o tamanhodo DNA, extremidades"cegas"
versusaderentesdoDNA, sítiodeinjeção(ci-
toplasma,pronúcleo,umacélulaversusduas
células),soluçãotampãonaqualo DNA está
em suspensão(incluindo contaminantes
comoEDTA, MgCI2,fenol!clorofórmio)ea
espécieanimal(murina,suína,ovinaoubo-
vina).QuandoretroYÍrusoueletroporaçãosão
utilizadosparatransferirgenes,ovetorretro-
viral,intensidadedecorrenteefreqüênciade
pulsosãofatoresimportantes.
A eficiênciadeproduçãodeanimaistrans-
gênicosébaixacomtodososmétodosatual-
menteemuso (microinjeção1-20%emca-
mundongos,menorem espéciesdomésti-
cas).No entanto,algunsavançostêmsido
descritosnumaescalalimitada,epodemcon-
ferirumaumentonaeficiênciadeprodução
(Chanetal., 1998).A microinjeção,queéo
métodomaisusadoparaproduziranimais
transgênicosnasespéciesdomésticas,possui
algunsproblemasrelacionadosaoszigotos
deespéciesprodutivas.Primeiro,ocitoplas-
made suínos,ovinos,caprinose bovinosé
muitoopaco,portantoédifícilvisualizaros
pronúcleos.Em suínosebovinos,umasolu-
çãoécentrifugaroszigotosde 1e2 células
por 15.000X g por3-10minutos,queper-
miteavisualizaçãodasestruturasnucleares
(WalletaI.,1985).Essetratamentonãopre-
judicaodesenvolvimentoinvivodeembriões
suínosoubovinos.A eficiênciadaprodução
detransgênicosaumentadeacordocomaex-
periênciaem microinjeção,apesarda mi-
croinjeçãoaindareduzirenormementeaso-
brevivênciaembrionária.Rexroad& Wall
(1987)demonstraramqueessareduçãona
sobrevivênciaembrionáriaémaioremovinos
queem suínos.Na maioriados estudos,a
percentagemdeembriõesmicroinjetadosque
produziramprogêniesvivasé demenosde
20% (Rexroad& Pursel,1988).
Existetambémumasériede fatoresre-
lacionadosdiretamenteaoDNA easuainte-
graçãoaogenomadoembriãoqueafetama
expressãodotransgene.Elementosregulató-
rios e/ou potencializadorese promotores,
fatoresativadoreseis (BrinsteretaI., 1981)
e trans (GordonetaI., 1987),e o sítiode
integraçãonogenomaafetamprofundamen-
te a expressãodo transgene(Chadaet aI.,
1985;TownesetaI., 1985).Issotambémé
dependentedaforçadoselementospromoto-
res/potencializadoresnaconstruçãotransgê-
nica.Aparentemente,algunssítiosnãosão
permissivosparaa expressãodotransgene,
independentementedoselementospromoto-
res/potencializadorespresentesno vetor
(CostantinietaI.,1984).Algunssítiosdein-
tegração,noentanto,sãomuitopermissivos
paraexpressão.Essessítiossãochamados
"pontosquentes"detranscrição.Fatoresadi-
cionaisafetandoa expressãosãoo número
decópiasdo transgene,metilaçãodeDNA
ealteraçãodeseqüênciasdeDNA. Números
decópiasmuitoaltospodemcausarexpres-
sãoexageradadosprodutos,aomesmotem-
poqueasituaçãoinversaocorrecompoucas
cópias.Quandocópiasmúltiplasseintegram,
elassãoencontradasquasesempreligadas
emarranjoscabeça-a-caudanosítiodeinte-
gração(BrinsteretaI.,1981).Tantoameti-
laçãodeDNA, quantoalteraçõesnaseqüên-
ciadeDNA, agemparareduziraexpressão
do transgene.
Algunsfatoresquepodemsermanipula-
dosparaaumentaraeficiênciadaexpressão
estãodiretamenterelacionadosàconstrução
transgênica.A adiçãodeintronsaovetorau-
mentaa eficiênciadetranscrição.A adição
deregiõesdeligaçãoàmatriz(MAR;McKni-
ghtetaI.,1992)tambémajudaaminimizar
níveisdeexpressãotransgênicosdependen-
tesdeposição.O usodeconstruçõesquesão
similaresao máximo,com suasseqüências
complementaresendógenas,aumentaa ex-
pressãodo transgene(Rexroad& Pursel,
1988).Construçõestransgênicascontendoa
329
seqüênciagenômicacomoselementospro-
motores/potencializadores,introns,seqüên-
ciadacaudapoliA eMAR apropriadossão
expressosmaiseficientementequemini-ge-
nes (cDNAs comum intron),quepor sua
vezsãoexpressosmaiseficientementeque
seqüênciasdecDNA exclusivas.
Problemas
Comosepodeimaginar,problemasocor-
remfreqüentemente.Essesproblemaspodem
ser:1) expressãodesreguladadegenes,re-
sultandonaproduçãoexcessivaoureduzida
dosprodutosgênicos;2) númeromuitoalto
decópiasresultandoemexpressãoexcessiva
dosprodutos;3) efeitoscolateraispossíveis,
taiscomoartrite,crescimentoesquelético
anormal,cardiomegalia,dermatite,úlceras
gástricase patologiarenal,encontradasem
suínostransgênicosparahormôniodecres-
cimentohumano;4) mutaçõesde inserção,
queresultamnaalteraçãodeprocessosbio-
lógicosessenciais;5)mosaicismonosanimais
fundadores,queresultana transmissãodo
transgeneparaapenasalgunsanimaisdapro-
gênie;e6) integraçãodotransgenenumcro-
mossomosexual,queresultaemapenasum
sexocarregandoo transgene.Muitos,senão
todosessesproblemas,estãorelacionadosao
transgeneporsi,sítiodeintegração,número
decópiaseexpressãodotransgene.
Perspectivas e Conclusões
Os objetivosgeraisdeproduçãodeani-
maistransgênicossão1)aumentaroconhe-
cimentodabiologiaeciênciabiomédicae2)
aumentara habilidadedeproduzireficien-
tementeleite,carnee fibras.Paraalcançar
essasmelhoriascomsucesso,serátestadaa
habilidadedequantificarcaracteresdesejá-
veis,queidentificamgenesresponsáveispor
essescaracteres,eintroduziressesgenesem
animaisdelaboratório,assimcomoemani-
matsdeprodução.Devemosselecionare/ou
reprogramarpopulaçõesdeindivíduossupe-
rioresquepodemserpropagadas.A incor-
330
poraçãodastecnologiasdeCTE, transferên-
ciadenúcleos,eDNA recombinantenestas
estratégiascontinuaaserumaspectoimpor-
tanteparaavançosfuturos.No entanto,nós
devemoslembrarquea capacidadedepro-
duçãodeanimaisgeneticamenteseleciona-
dose/ou produzidospor engenhariagené-
ticasó podeseralcançadaquandoseupo-
tencialgenéticoé maximizado,atravésde
condiçõesdemanejoeambiente.
A utilidadeprincipaleovalordatecnologia
transgênicaserãolimitadospelahabilidadede:
1)identificargeneseseqüênciasregulatórias
apropriadasparaaproduçãodecaracteresque
desejamosestudar,melhorarouincluirnode-
senvolvimentodeanimaistransgênicos.e2)
incorporaressesgenesdesejáveisemanimais
domésticos,demaneiraqueelessejamexpres-
sose reguladosdeformaadequada.
O estabelecimentodemétodosdeCTE,
CGE e transferêncianuclearem espécies
produtivasseráútilparaaproduçãodeani-
maistransgênicos,assimcomoparaestudos
dediferenciaçãocelular,desenvolvimentoe
regulaçãogênicaemanimaisdeprodução.
O usodatransferênciadegenesmediadapor
CTE/CGE aindanãofoiempregadoemes-
péciesdomésticas,principalmentedevidoà
ausênciadelinhagenscelularesestáveisees-
tabelecidasdeCTE/CGE. Existemduasbar-
reirasaseremsuperadasparaproduzirani-
maistransgênicoscomessatecnologia:1)o
estabelecimentode linhagenscelularesde
CTE/CGE nãodiferenciadase2) atransfor-
maçãoeficientedeCTE/CGE comgene(s)
exógeno(s).Um grandeprogressotemsido
alcançadono sentidodesuperaraprimeira
destasbarreiras(Gerfen& Wheeler,1995;Pie-
drahitaetaI.,1998;RundetaI.,1996;Shim
etaI., 1997;WheeleretaI., 1995),queé o
isolamentodeCTE ouCGE porcinasnãodi-
ferenciadas.No entanto,aindarestauma
quantidadesignificativadetrabalhoparaque
a produçãorotineirade animaistransgêni-
cos,apartirdeCTE ou CGE, sejaestabele-
cidanasespéciesprodutivas.
Agradecimentos
OsautoresgostariamdeagradeceraoPau-
10BayardDiasGonçalvespelosvaliososco-
mentárioscomrespeitoà preparaçãodeste
manuscrito.Osautorestambémgostariamde
agradeceraseuscolegasquetêmcontribuído
nostrabalhosdescritos:GregoryT.Bleck,Lau-
rieRund,BrettR.White,MelissaIzard-Hent-
ges,LindaGrum,JoEllaBarnes,RayW.Ger-
fen,MichaelEllis,DianaBidner,ScottHughes,
Bill FishereAnaPaulaAlvesVieira.
ReferênciasBibliográficas
ALT,F.W,BLACKWELL, T.K.,YANCOPOULOS,
G.D.Immunoglobulingenesintransgenicmice.
TIG, v.l, p.231-236,1985.
BACHILLER, D., SCHELLANDER, K, PELI, K,
etaloLiposome-mediatedDNAuptakebysperm
cells.MoIReprodDev,v.30,p.194-200,1991.
BALDARELLI,RM., LENGYEL, JA Transientex-
pressionofDNAafterballisticintroductioninto
Drosophilaembryos.NucleieAeidsRes,v.18,
p.5903-5904,1990.
BENACERRAF, B.,McDEVITT,H.O.Histocom-
patibilitylinkedimmuneresponsegenes.A new
classof genesthatcontraislhe formationof
speciesimmuneresponsehasbeenidentified.
Seienee,v.175,p.273-279,1972.
BIEWENGA, J.E., DESTRE, O.H.L SCHRAMA,
LH. Plasmid-mediatedgenetransferinneurons
usinglhebiolisticstechnique.J Neuro Methods,
v.71,p.67-75,1997.
BLECK,G.T.,BREMEL,RD. Variarioninexpression
of+a-Iacalbumintransgeneinmilkoftransgenic
mice.J DairySei,v.77,p.1897-1904,1994.
BLECK, G.T.,JIMINEZ-FLORES, R, WHEELER,
M.B. Productionof transgenicanimaiswith
alteredmilk as a toei to modifymilk com-
position,increaseanimalgrowthandimprove
reproductiveperformance.In: GreppiGF,Enne
G (eds),AnimalProduetion& Bioteehnology.
Amsterdam:EIsevier,1995.p.I-19.
BLECK, G.T., MONACO, M.H., DONOVAN,
S.M., eta!.ProductionofTransgenicPigsand
Mice Containinglhe GeneEncodingHuman
Insulin-LikeGrowthFactorI (lGF-l) under
contraiof lhebovinea-Iactalbuminprometer
andregulatoryregions.J AnimSei,v.76(Suppl
1),p.213,1998a.
BLECK, G.T.,WHITE, B.R, HUNT, E.D., etalo
Productionof transgenicswinecontaininglhe
bovinea-Iactalbumingene.Theriogenology,
v.45,p.347,1996.
BLECK, G.T.,WHITE,B.R, MILLER, D.J., etalo
Productionofbovinea-Iactalbuminin lhemilk
of transgenicpigs.J Anim Sei,v.76,p.3072-
3078,1998b.
BONDIOLI, KR, WESTHUSIN, M.E.,LOONY,
C.R Productionofidenticalbovineoffspringby
nucleartransfer.Theriogenology,v.33,p.165-
174,1990.
BONGSO, A, FONG, C-Y., NG, S-C., etaI.Iso-
lationandcultureof innercellmassfromhu-
maublastocyst.Hum Reprod,v.9,p.2110-
2117,1994.
BOSTON, WS., BLECK, G.T.,WHEELER, M. B.,
et a!.Expressionof bovinea-Iactalbuminin
transgenicmiceincreasesmammarylactose
synthaseactivity.MoI Biol Cell, v.6 (Suppl),
p.440,1995.
BOSTON,WS., BLECK, G.T.,WHEELER, M.B.,
etaI. Increasedexpressionof a-Iactalbuminin
transgenicmiceaugmentsmilkyieldandpup
growth.TransgenieRes1999.(noprelo).
BOWEN, RA, REED, M., SCHNIEKE, A, etalo
TransgeniccaUleresultingfrombiopsiedem-
bryos:Expressionofc-skiin a transgeniccalf.
Biol Reprod,v.50,p.664-668,1994.
BRACKETT, B.G., BORANSKA, W, SAWICKI,
W, et a!.Uptakeof heterologousgenomeby
mammalianspermatozoaanditstransfertoova
throughfertilization.ProeNatlAeadSeiUSA,
v.68,p.353-357,1971.
BRADLEY, A, EVANS,M., KAUFMAN, M.H., et
aI.Formationofgerm-linechimaerasfromem-
bryo-derivedteratocarcinomacelllines.Nature,
v.309,p.255-256,1984.
BREM, G., BRENIG, B., GOODMAN, H.M., et
aI. Productionof transgenicmice,rabbitsand
pigsby microinjectioninto pronuclei.Zueh-
thygiene,v.20,p.241-245,1985.
BREM, G.,HARTL, P.,BESENFELDER, U.,etaI.
Expressionof syntheticcDNA sequences
encodinghumaninsulin-likegrowthfactar-l
(lGF-1) in lhe mammaryglandof transgenic
rabbits.Gene,v.149,p.351-355,1994.
BREMEL, RD., YOM, H-C., BLE~:(,G.T.Alte-
rationofmilkcompositionusingmolecularge-
netics.J Dairy Sei,v.72,p.2826-2833,1989.
BRENIG, B.,MULLER, M.,BREM,G.Genetrans-
fer in pigs.In: Proc 4thWorld CongGenet
Applied to Livestock Prado Edinburgh,
Seotland,v.12,p.41-48,1990.
BRINSTER, RL, CHEN, H.Y., MESSING,A, et
aloTransgenicmiceharboringSV40T-anrigen
,,1
genesdevelopcharacteristicbraintumors.Cell,
v.37,p.367-379,1984.
BRINSTER, RL, CHEN, H.Y., TRUMBRAUER,
M.E.,etaI.Somaticexpressionofherpesthymi-
dinekinaseinmicefollowinginjectionofaforeign
geneintoeggs.Cell,v.27,p.223-231,1981.
BRINSTER, RL, CHEN, H.Y., TRUMBAUER,
M.E.,etaI.Factorsaffectingtheefficiencyofin-
troducingforeignDNA intomicebymicroinjec-
ting DNA Proe NatI Aead Sei USA, v.82,
p.4438-4442,1985.
BRINSTER, RL., RITCHIE, KA, HAMMER,
RE., etaI.Expressionofamicroinjectedimmu-
noglobulingeneinthespleenoftransgenicmice.
Nature,v.306,p.332336,1983.
BUCCHINI, D.,REYNAUD,C-A.,RIPOCHE, M-
A, etaI. Rearrangementof a chickenimmu-
noglobulingeneoccursintheIymphoidlineage
oftransgenicmice.Nature,v.326,p.409-411,
1987.
BUEHLER, TA, BRUYERE, T.,WENT, D.E, et
aI.Rabbit~-caseinpromoterdirectssecretionof
humaninterleukin-2intothemilkoftransgenic
rabbits.Bio/TeehnoIogy,v.8,p.140-143,1990.
CAMPBELL,KH.S., MCWHIR, J., RITCHIE,
WA.,etaI.Sheepclonedbynucleartransferfrom
acuIturedcellline.Nature,v.380,p.64-66,1996.
CAMPER, SA, SAUNDERS, T.L., KENDALL,
S.K, etaI. Implementingtransgenicandem-
bryonicstemcelltechnologytostudygeneex-
pression,cell-cellinteractionsandgenefunc-
tiDO.Biol Reprod,v.52,p.246-257,1995.
CAPECCHI, M.R Alteringthegenomebyhomo-
logousrecombination.Seienee,v.244,p. 1288-
1292,1989.
CEZAR,G.G.Avaliaçãodabiobalístieaparaintro-
duçãodeDNA exógenoemembriõesmurinos.
1998.Dissertação(Mestrado),Universidadede
Brasília,1998.
CHADA, K, MAGRAM, J., RAPHAEL, K, etaI.
Specificexpressionofaforeignbeta-globingene
in erythroidcellsof transgenicmice.Nature,
v.31,p.4377-4380,1985.
CHAN,AWS., HOMAN, E.J.,BALLOU, LU., et
aI.Transgeniccattleproducedbyreverse-trans-
cribedgenetransferinoocytes.ProeNatlAead
SeiUSA, v.95,p.14028-14033,1998.
CHEN, LR, WU, M.C. Establishmentofporcine-
blastocyst-derivedembryonicstemcellsandpro-
ductionofchimerasbyblastocystinjection.J Re-
prodFertil,1993;48(Suppl):94
CHOI, B.K.,BLECK, G.T.,WHEELER, M.B., et
aI.Geneticmodificationofbovine~-Caseinand
itsexpressionin themilkof transgenicmice.J
Agri FoodChem,v.44,p.953-960,1996.
332
CHOI, T.K, HOLLENBACH, P.W, PEARSON,
B.E.,etaI.Transgenicmicecontainingahuman
heavychainimmunoglobulingenefragmentclo-
nedinayeastartificialchromosome.NatGenet,
v.4,p.117-123,1993.
CIAVATTA,D.J., RYAN,T.M., FARMER, S.C.,et
aI.Mousemodelofhumanbetazerothalasse-
mia:targeteddeletionof themousebetamaj-
andbetamin-globingenesin embryonicstem
cells.ProeNatIAeadSei USA, v.92,p.9259-
9263,1995.
CIBELLI, J.B., STICE, S.L.,GOLUKE, P.J.,etaI.
Transgenicbovinechimericoffspringproduced
fromsomaticcell-derivedstem-likecells.Nat
Bioteehnol,v.16,p.642-646,1998a.
CIBELLI, J.B.,STICE, S.L, GOLUEKE, P.J.,etaI.
Clonedtransgeniccalvesproducedfromnon-
quiescentfetal fibroblasts.Seienee,v.280,
p.1256-1258,1998b.
COSTANTINI, E, CHADA,K, MAGRAM, J. Cor-
recriouofmurineI3-thalassemiabygenetransfer
intothegermliDe.Seienee,v.233,p.1192-1194,
1986.
COSTANTINI, E, LACY,E. Introductionofarabbit
I3-globingeneintothemousegermliDe.Nature,
v.294,p.92-94,1981.
COSTANTINI, ED., ROBERTS, S.,EVANS,E.P.,
etaI.PositionEffectsandGeneExpressionin
thetransgenicmouse.In: GinsbergHS, Vogel
HS (eds),TransferandExpressionofEukaryo-
tic Genes.NewYork:AcademicPress,1984;
123-134.
DOETSCHMAN, T.C.,EISTETTER, H., KATZ,
M., etaI.Theinvitrodevelopmentofblastocyst-
derivedembryonicstemcelllines:formationof
visceralyolksac,bloodislandsandmyocardium.
J EmbryoI Exp Morph , v.87,p.27-45, 1985.
DOETSCHMAN, T.,WILLIAMS, P.,MAEDA, N.
Establishmentof hamsterblastocyst-derived
embryonicstem(ES) cells.Dev BioI, v.I27,
p.224-227,1988.
DU, E, GILES, J.R, FOOTE, RH., etaI.Nuclear
transferof putativerabbitstemcellsleadstonor-
mal blastocystdevelopment.J Reprod Fertil,
v.1O4,p.219-223,1995.
EBERT,K, LOW M., OVERSTROM, E., etaI.A
MoloneyMLV-RAT somatotropinfusiongene
producesbiologicallyactivesomatotropinin a
transgenicpig. MoI EndoerinoI,v.2,p.277-
283,1988.
EBERT, KM., SELGRATH, J.P.,DITULLIO, P.,
etaI.Transgenicproductionofavariantofhu-
mautissue-typeplasminogenactivatoringoat
milk: Generationof transgenicgoats and
analysisof expression.Bio/Teehnology,v.9,
p.835-840,1991.
EBERT,K.M., SMITH, T.E.,BUONOMA, EC., et
aI. Porcinegrowthhormonegeneexpression
fromviTalpromotersintransgenicswine.Anim
Bioteehnol,v.l, p.145-159,1990.
EDFORS-LILIA, 1.,PETERSSON, H., GAHNE,
B. Performanceofpigswithor withoutthein-
testinalreceptorforEscherichiaColiK88.Anim
Prod,vA2, p.381-387,1986.
EVANS, M.).,KAUFMAN, M.H. Establishmentin
cultureofpluripotcntcellserammouseembryos.
Nature,v.292,p.154-156,1981.
EVANS, M.J, NOTARIANNI, E., LAURIE, S., et
aI.Derivationandpreliminarycharacterization
ofpluripotentceIlliDesfromporcineandbovine
blastocysts.Theriogenology,v.33,p.125-128,
1990.
FAINSOLD, A, FRUMPKIN, A, RANGINI, Z.,et
a!. Chickenhomeogenesexpressedduring
gastrulationandthegenerationof transgenic
chicken.In: EMBO-EMBL Symp,Moi Biol
VertebrateDev.abstr.31,1990.
FAJFAR-WHETSTONE,C.J.,RAYBURN,mA L,
SCHOOK, LB., et aI. Sexdeterminationof
porcinepreimplantationembryosviaY-chro-
mosomespecificDNA sequences.Anim Bio-
teehol,vA, p.183-193,1993.
FELGNER, P.L, GADEK, T.R, HOLM, M., etaI.
Lipofection:a highlyefficient,lipid-mediated
DNA-transfectionprocedure.ProeNatl Aead
SeiUSA, v.84,p.7413-7417,1987.
FIRST,N.L, SIMMS, M.M., PARK,S.P.,etaI.Sys-
temsforproductionofcalvesfromculturedbo-
vineembryonicstemceIls.ReprodFertilDev,
v.6,p.553-562,1994.
FITCH, M.M.M., MANSHARDT, RM., GON-
SALVES,D.,etaloStabletransformationofpa-
payaviamicroprojectilebombardment.Plant
CellRep,v.9,p.189-194,1990.
FIZPATRICK-McELLIGOT, S. Genetransferto
tumor-infiltratinglymphocytesandothermam-
maliansomaticcellsby microprojectilebom-
bardment.Bio/Teehnology,v.l0, p. 1036-
1040,1992.
FROMM, M.E., MORRISH, E, ARMSTRONG,
C.,etaloInheritanceandexpressionofchimeric
genesin theprogenyof transgenicmaize.Bio/Teehnology,v.8,p.833-839,1990.
FLECHON, J.E., NOTARIANNI, E., GALLI, C.,
etaI.Characterizationofovineandporcineem-
bryonicstemcells.J ReprodFertil,v.6 (Abstr
Series),p.25,1990.
FOLEY,G.L,RUND,LA, WHEELER,M.B.Fac-
torsaffectingmurineembryonicstemceIltera-
tomadevelopment.Biol Reprod,v.509(Suppl
1),p.291,1994.
FUJII, J., OTSU, K., ZORZTO, E, etaI..Identifi-
cationof a mutationin theporcineryanodine
receptorassociatedwithmalignanthyperther-
mia.Seienee,v.253,pA48-451,1991.
GAGNE, M.B.,POTHIER, E, SIRAD, M-A Elec-
troporationof bovinespermatozoato carry
foreignDNA inoocytes.Moi ReprodDev,v.29,
p.6-15,1991.
GANDOLFI, E, LAVITRANO, M., CAMAIONI,
A, etaI..Theuseofsperm-mediatedgenetrans-
fer for the generationof transgenicpigs. J
ReprodFertil,vA(AbstrSer),p.lO,1989.
GANDOLFI, E, TERQUI, M.,MODINA, S.,etal.
Failuretoproducetransgenicoffspringbyintra-
tubalinseminationof giltswith DNA treated
sperm.ReprodFertilDev,v.8,p. 1055-1060,
1996.
GERFEN, RW, FAJFAR-WHETSTONE, C.J.,
WHEELER, M.B. Isolationof embryonicceIl
linesfromporcineblastocysts.In:SeranoSymp
PreimplantEmbryoDev.Boston,MA, Anais...
abstr.16,1991.
GERFEN, RW, WHEELER, M.B.Isolationofplu-
ripotentembryonicceIllinesframporcineblas-
tocysts.Anim Bioteehol,v.6,p.I-14, 1995.
GILES, J.R, FOOTE, RH., MARK, W Develop-
mentof embryostemceIltechnologyfor pro-
duction of chimeric rabbits.Biol Reprod,
vA4(Suppl1),p.57,1991.
GILES, J.R, YANG, x., MARK, W, etaI. Pluri-
potencyof culturedrabbitinnercellmassceIls
detectedby isozymeanalysisandeyepigmen-
tationof fetusesfollowinginjectionintoblas-
tocystsor morulae.Moi ReprodDev,v.36,
p.130-138,1993.
GODBOUT, R, INGRAM, R, TILGHMAN, S.M.
Multipleregulatoryelementsin theintergenic
regionbetweenthea-fetoprateinandalbumin
genes.MoiCellBiol,v.6,pA77-487,1986.
GOODHARDT, R, CAVELIER, E, AKIMENKO,
MA., etaI. Rearrangementandexpressionof
rabbitimmunoglobulinkappalightchaingene
in transgenicmice.ProeNatl AeadSeiUSA,
v.84,pA229-4233,1987.
GORDON, J.W, CHESA, P.G.,NISHIMURA, H.,
et aI. Regulationof Thy-l geneexpressionin
transgenicmice.Cell,v.50,pA45-452, 1987.
GORDON, M.E, SCANGOS, GA, PLOTKIN,
D.J., et aI. Genetictransformationof mouse
embryosby microinjectionof purifiedDNA
ProeNatlAeadSeiUSA, v.77,p.7380-7384,
1980.
GOSSLER,A, DOETSCHMAN, T.,KORN, R, et
ai.Transgenesisbymeansofblastocyst-derived
embryonicstemcellliDes.ProeNatlAeadSei
USA, v.83,p.9065-9069,1986.
GRAVES, KH., MOREADITH, RW Derivation
andcharacterizationof putativepluripotential
embryonicstemcellsfrom preimplantation
rabbitembryos.Moi ReprodDev,v.36,p.424-
433,1993.
GROSVENOR, C.E., PICCIANO, M.E, BAUM-
RUCKER, C.R.Hormonesandgrowthfactors
in milk.EndoerinolRev,v.14,p.6:710-728,
1993.
GRUM, LR, WHITE, B.R, RUND, LA, et aI.
Attachmentcapabilityof swineblastocystscul-
turedfromDuroc,Yorkshire,LandraceXYork-
shirepigsandMeishan.JAnimSei,v.72(Suppl
1),p.l091,1994.
GUO, Z., CHANG, AS., JANDESKA, S., etaI..
Genegun-mediatedgenetransferandexpres-
SiDOinratislets.TransplanProc,v.29,p.2209-
2210,1997.
HALLER, O.,ARNHEITER, H., GRESSER,1.,et
aI.Virus-specificinterferonaction/protection
ofnewbomMx carriesagainstlethalinfection
withinfluenzavirus.J ExpMed,v.154,p.199-
203,1981.
HALTER, R, CARNWATH,J., ESPANION,G.,et
aI..StarategiestoexpressfactorVIII genecons-
tructsintheovinemammarygland.Theriogeno-
logy,v.39,p.137-149,1993.
HAMMER, RE., KRUMLAUF,R, CAMPER,SA,
etaI.Diversityofalphafetoproteingeneexpres-
SiDOin miceis generatedbya combinationof
separateenhancerelements.Seienee,v. 235,
p.53-58,1987.
HAMMER, RE., PURSEL, Y.G., REXROAD Jr.,
C.E., et al.Productionof transgenicrabbits,
sheepandpigsby microinjection.Nature,v.
315,p.680-683,1985.
HANDYSIDE, A, HOOPER, M.L, KAUFMAN,
M.H., etaI..Towardstheisolationof embryo-
nalstemcelllinesfromsheep.Roux'sArehDev
Riol, v.196,p.185-190,1987.
HANAHAN,D. Oncogenesintransgenicmice.Na-
ture,v.312,p.503-504,1984.
HANAHAN, D. Heritableformationof pancreatic
j3-celltumorsin transgenicmiceexpressionre-
combinantinsulin/simianvirus40 oncogenes.
Nature,v.315,p.115-122,1985.
HANAHAN,D.Oncogenesisintransgenicmice.In:
KahnP,GrafT (eds),OncogenesandGrowth
Control.Heidelberg,Germany:Springer-Verlag,
1986;349-363.
334
HARTMANN, P.E., MCCAULEY, 1.,GOONE-
RATNE, AO., etaI. Inadequaciesof sowlac-
fatiGo:survivalofthefittest.In:SympZoolSoe.
London,v.51,p. 301-326,1984.
HARVEY, R.P.Widespreadexpressionof MyoD
genesinXenopusembryosisamplifiedinpre-
sumptivemuscleasadelayedresponsetomeso-
derminduction.Proe Natl Aead Sei USA,
v.88,p.9198-9202,1991.
HEISER, WC. Genetransferintomammaliancells
byparticlebombardment.AnalRiochem,v.217,
p.185-196,1994.
HOCHI, S., NINOMIYA, T, MIZUNA, A, etaI.
FateofexogenousDNA carriedintomouseeggs
by sperniatozoa.Anim Rioteehnol,v.l, p.25-
30, 1990.
HOGAN, B.,BEDDINGTON, R, COSTANTINI,
E, etaI.Analysisoftransgenicmice.In: Hogan
B, BeddingtonR, CostantiniF, LacyE (eds),
ManipulatingtheMouseEmbryo:alaboratory
manual.NewYork:ColdSpringHarborLabo-
ratoryPress,1994.p.291-324.
HORAN, R, POWELL, R, MCQUAID, S.,etaI.
Associationof foreignDNA withporcinesper-
matozoa.ArehAndrol,v.26,p.83-92,199i.
HOULE, Y.M., SCHROEDER, EA, ODLE, J., et
aI. Smallintestinaldisaccharidaseactivityand
ilealvillusheightareincreasedin pigletscon-
sumingformulacontainingrecombinanthuman
insulin-likegrowthfactor-I.PediatrieReseareh,
vA2, p.78-86,1997.
IANNACCONE, P.M.,TABORN,G.U.,GARTON,
RL, etai.Pluripotentembryonicstemcellsfrom
theratarecapableofproducingchimeras.Dev
Riol,v.163,p.288-292,1994.
INOVE, K, YAMASHITA,S.,HATA,J.,etal.Elec-
troporationasa newtechniquefor producing
transgenicfish.Cell Diff Dev,v.29,p. 123-
128,1990.
IZANT, J.G., WEINTRAUB, H. Constitutiveand
conditionalsuppressionof exogenousand
endogenousgenesbyanti-senseRNA Seienee,
v.229,p.345-352,1985.
JAENISCH, R, FAN, H., CROKER, B. Infection
ofpreimplantationmouseembryosandofnew-
bommicewithleukaemiavirus:Tissuedistribu-
tiDOofviralDNA andRNA leukemogenesisin
adultanimal.ProeNatl AeadSei USA, v.72,
pAO08-4012,1975.
JAENISCH, R, HRABERS, K, SCHMIEKE, A,
etaI.Germlineintegrationof moloneymurine
leukemiavirusat themovEtocosleadsto re-
cessivelethalmutationandearlyembryonic
death.Cell, v.32,p.209-216,1983.
JAENISCH, R., JAEHNER, D., NOBIS, P.,etaI.
Chromosomalpositionandactivationof retro-
viralgenomesinsertedintothegermliDeofmice.
Cell,v.24,p.519-529,1981.
JAENISCH, R., MINTZ, A. Simianvirus40DNA
sequencesinDNA ofhealthyadultmicederived
frompreimplantationblastocystsinjectedwith
viralDNA ProeNatl Aead Sei USA, v.71,
p.1250-1254,1974.
JIAO, S., CHENG, L, WOLFF, J., etaI. Particle
bombardment-mediatedgenetransferandex-
pressionin ratbraintissues.Bio/Teehnology,
v.ll, pA97-502,1993.
JOHNSTON, SA Biolistictransformation:micro-
bestomice.Nature,v.346,p.776-777,1990.
JOHNSTON, SA, ANZIANO, P.O.,SHARK, K.,
etaI.Mitochondrialtransformationinyeastby
particlebombardmentwith microprojectiles.
Seienee,v.240,p.1538-1581,1988.
KATO,Y., TANI, T.,SOTOMARU, Y., etaI.Eight
calvesclonedfromsomaticcellsofasingleadulto
Seienee,v.282,p.2095-2098,1998.
KIM, J~H.,JUNG-HA, H-S.,LEE,H.T.,etal.Deve-
lopmentofapositivemethodformalestemcell-
mediatedgenetransferinmongeandpig.Moi
ReprodDev,vA6,p.515-526,1997.
KLEIN, T.M.,ARENTZEN, R.,LEWIS, P.A.,etaI.
Transformationofmicrobes,plantsandanimais
byparticlebombardment.Bio/Teehnology,v.lO,
p.286-291,1992.
KLEIN, T.M.,WOLF,E.D.,WU,R.,etal.High-velo-
citymicroprojectilesfordeliveringnucleicacids
intolivingcells.Nature,v.327,p.70-73,1987.
KOSTER, J.G., EIZEMA, K., PETERSON-MA-
DURO, LJ., etaI.Analysisof Wnt/Engrailed
signalinginXenopusembryosusingbiolistics.
DevBiol, v.173,p.348-352,1996.
KRIMPENFORT, P.,RADEMAKERS, A, EYES-
TONE, W, etaI.Generationoftransgenicdairy
cattleusing'in vitro'embryoproduction.Bio/
Teehnology,v.9,p.844-851,1991.
KROLL, K., AMAYA,E.TransgenicXenopusem-
bryosfromspermnucleartransplantationreveal
FGF signalingrequirementsduringgastrulation.
Development,v.122,p.3173-3183,1996.
KRUMLAUF, R., HAMMER, R.E., TILGHMAN,
S.M.,etal.Developmentalregulationofa-feto-
prateiogenesintransgenicmice.Moi CellBiol,
v.5,p.1639-1648,1985.
KUZNETSOV, Av., KUZNETSOV, Lv. The bin-
dingof exogenousDNA pRK31acZby rabbit
spermatozoa,itstransfertooocytesandexpres-
sionin preimplantationembryos.Ontogenez,
v.26,p.300-309,1995.
LAMB, B.T.,SISODIA, S.S., LAWLER,AM., et
aI.Introductionandexpressionof the400kilo-
baseprecursoramyloídprateiogeneintransge-
nicmice.Nat Genet,v.5,p.22-30,1993.
LAND, H., PARADA,LF., WEINBERG, RA Tu-
morigenicconversionofprimaryembryofibro-
blastsrequiresatleasttwocooperatingoncoge-
negoNature.,v.304,p.596-602,1983.
LAVITRANO, M., CAMAIONI, A, FAZIO,v.M.,
et aI. Spermcellsasvectorsfor introducing
foreignDNA intoeggs:Genetictransformation
ofmice.Cell,v.57,p.717-723,1989.
LEWIN, H.A. Diseaseresistanceand immune
responsegenesincattle:strategiesfortheirde-
tectionand evidenceof theirexistence.J Dairy
Sei,v.72,p.1334-1348,1989.
LEWIS, AJ., SPEER, v.C.,HAUGHT, D.G. Rela-
tionshipbetweenyieldandcompositionof sow's
milkandweightgainsofnursingpigs.J Anim
Sei,v.47,p.634-638,1978.
UN, S.S.,PLATT,J.L Immunologicaladvances
towardsclínicalxenotransplantation.In:Tumble-
souME, SchookLB (eds),Advancesin Swine
in BiomediealReseareh.NewYork: Plenum
Press,1996.p.147-162.
MAGA, EA, ANDERSON, G.B.,MURRAY, J.D.
Theeffectofmammaryglandexpressionofhu-
mauIysozymeon thepropertiesof milkfrom
transgenic mice. J Dairy Sei, v.78, p.2645-
2652,1995.
MAIONE, B.,LAVITRANO, M.,SPADAFORA,C.,
et aI. Sperm-mediatedgenetransferin mice.
Moi RepodDev,v.50,pA06-409,1998.
MARTIN, G.R. Isolationof a pluripotentcellliDe
fromearlymongeembryosculturedinmedium
conditionedbyteratocarcinomastemcells.Proe
NatlAeadSeiUSA, v.78,p.7634-7638,1981.
MATSUI, Y., ZSEBO, K., HOGAN, B.LM. Deri-
vationofpluripotentembryonicstemcellsfrom
rumineprimordialgermcellsin culture.Cell,
v.70,p.841-847,1992.
McCABE,D.E.,SWAIN,WF.,MARTINELL, B.J.,
etaI.Stabletransformationof soybean(Glycin
max)byparticlebombardment.Bio/Teehnolo-
gy,v.6,p.923-926,1988.
McCABE, D.E., MARTINELL, B.J. Transforma-
fiouof elitecottoncultivarsviaparticlebom-
bardmentofmeristems.Bio/Teehnology,v.ll,
p.596-598,1993.
McKNIGHT, R.A.,SHAMAY,A, SANKARAN,L,
etaI.Matrix-attachmentregionscanimpartpo-
sition-independentregulationofatissue-specific
genein transgenicmice.ProeNatl AeadSei
USA, v.89,p.6943-6947,1992.
335
McPHERRON, AC., LAWLER, AM., LE, S-J.
Regulationof skeletalmusclemassinmicebya
newTGF-betasuperfamilymember.Nature,
v.387,p.83-90,1997.
MIALHE, E., MILLER, LH. Biolistictransfection
of mosquitoembryos(Anophelesgambiae).
Biotechniques,v.16,p.924-931,1994.
MINTZ, B. Geneticmosaicismin adultmiceof
quadriparentallineage.Science,v. 148,p.
1232-1233,1965.
MODLINSKI, JA, GERHAUSER, D., LIOI, B.,
etaI.Nucleartransferfromteratocarcinomacells
intomouseoocytesandeggs.Development,
v.lO8,p.337-348,1990.
MOHN, A, KOLLER, B. Geneticmanipulationof
embryonicstemcells.In: GloverDM, Hames
BD (eds), DNA Cloning:apracticalapproach.
Oxford-NewYork:IRLPress,1995.p.143-184.
MURRAY, J.D., NANCARROW, C.D., MAR-
SHALL, J.T.,etai.Theproductionoftransgenic
Merino sheepby microinjectionof ovine
metallothionein-growthhormonefusiongenes.
ReprodFertilDev,v.l, p.147-155,1989.
MURRAY, J.D., NANCARROW, C.D., WARD,
KA. Controlledproductionofsheepgrowthhor-
moneintransgenicmiceandsheep.In: 11thIntl
CongAnimReprod& ArtificialInsemination.
Dublin,Ireland,v.5,p.20-27,1988.
NElMANN, H., STRELCHENKO, N. Isolationand
maintenanceofrabbitembryonicstem(ES)cell
likecells.Theriogenology,v.41,p. 265,1994.
NOTARIANNI, E., GALLI, C., LAURIE, S.,etaI.
Derivationof pluripotentembryoniccelltines
eramthe pig and sheep.J Reprod Fertil,
v.43(Suppl),p.255-260,1991.
NOTARIANNI, E.,LAURIE, S.,MOOR, RM., et
aI.Maintenanceanddifferentiationin culture
of pluripotentembryoniccell tinesfrompig
blastocysts.J ReprodFertil,v.41(Suppl),p.51-
56, 1990.
ONISHI, A., YOUNGS, C.R. Comparisonof
immunosurgerywith calcium ionophore
treatmentfor isolationof innercellfiassesof
porcineblastocysts.Theriogenology,v.39,
p.274,1993a.
ONISHI, A, YOUNGS, C.R Isolationofinnercell
mass(ICM) derivedcellcoloniesfromintact
porcineblastocysts.J AnimSei,v.71(Suppll),
p.74,1993b.
ORNITZ, D.M.,PALMITER, RD., MESSING,A,
etaI. Elastasepromoterdirectsexpressionof
~mangrowthhormoneandT-antigengenesto
pancreaticacinarcellsin transgenicmice.In:
ColdSpringHarborSymp,QuantBiol. USA,
v.50,p.399-409,1985.
336
PALMITER, RD., BRINSTER, R.L Germ-line
transformationof mice.Ann RevGenet,v.20,
p.465-499,1986.
PALMITER, RD., BRINSTER, RL, HAMMER,
RE., etai.Dramaticgrowthofmicethatdevelop
fromeggmicroinjectedwithmetallothionein-
growthhormonefusiongenes.Nature,v.300,
p.611-615,1982.
PALMITER, RD., CHEN, H.Y.,MESSING, A, et
aI.SV40enhancerandlargeT-antigenareins-
trumentalin developmentof choroidplexux
tumorsin transgenicmice.Nature, v.316,
p.457-463,1985.
PALMITER, RD., NORSTEDT, G., GELINAS,
RE., etaI.Metallothionein-humanGH fusion
genesstimulategrowthofmice.Science,v.222,
p.809-814,1983.
PAPAIOANNOU,Y.E.,EVANS,E.P.,GARDNER,
RL, et aI. Growthanddifferentiationof an
embryonalcarcinomacellline (C145b). J
EmbryolExpMorph,v.54,p.277-295,1979.
PASZTY, C., BRION, C.M., MANCI, E., et aI.
Transgenicknockoutmicewith exclusively
humansicklehemoglobinandsicklecelldisease.
Science,v.278,p.876-878,1997.
PASZTY,C., MOHANDAS, N., STEVENS, M.E.,
etaI.Lethalalpha-thalassaemiacreatedbygene
targetingin miceandits geneticrescue.Nat
Genet,v.ll, p.33-39,1995.
PEREZ, A., SOLANO, R, CASTRO, R., et aI.
Spermcellsmediatedgenetransferin caule.
BiotechnolAplicada,v.8,p.90-94, 1991.
PEZEN, D.S., LEONARD, J.M., ABRAMCZUK,
J.W, etai.TransgenicmicecarryingHN proviral
DNA In:FirstNL, HaseltineFP (eds),Trnasge-
nicAnimais.Boston:ButterworthHeinemann,
1991.p.213-226.
PIEDRAHITA, J.A., ANDERSON, G.B., BON-
DURANT, RH. On theisolationofembryonic
stemcells:comparativebehaviorof murine,
porcine,andovineembryos.Theriogenology,
v.34,p.879-901,1990a.
PIEDRAHITA, J.A., ANDERSON, G.B., BON-
DURANT, RH. Influenceof feederlayertype
ontheefficiencyofisolationofporcineembryo-
derivedcelllines.Theriogenology,v.34,p.865-
877,1990b.
PIEDRAHITA, J.A.,MOORE, K, OETAMA,B.,et
aI. Generationof transgenicporcinechimera
usingprimordialgermcell-derivedcolonies.Biol
Reprod,v.58,p.1321-1329,1998.
PIPER, LE., BINDON, B.M., DAVIS, G.H. The
singleinheritanceof thehighliuersizeof the
BorollaMerino.In: Land RB, RobinsonDW
(eds),Genetiesof Reproduetionin Sheep.
London:Butterworths,1985.p.115-125.
POLGE, E.I.C.,BARTON,S.C.,SURANI, M.HA.,
et a\. Inducedexpressionof a bovinegrowth
hormoneconstructintransgenicpigs.In: Heap
RB, ProsserCG, LammingGE (eds),Bioteeh-
nologyofGrowthRegulation.London:Butte-
rworths,1989.p.189-199.
PRATHER, RS., BARNES,Elo, SIMS, M.M., et
aloNucleartransplantationinthebovineembryo:
assessmentofdanarnucleiandrecipientoocyte.
Biol Reprod,v.37,p.859-866,1987.
PRATHER,R, SIMS,M., FIRST,N. Nucleartrans-
plantationin earlypig embryos.Biol Reprod,
v.41,p.414-418,1989.
PUCHALSKI, RB., FAHL, WE. Genetransferby
electroporation,lipofection,andDEAE-dextran
transfection:compatibilitywithcell-sortingby
flowcytometry.Cytometry,v.13,p.23-30,1992.
PURSEL,Y.G.,HAMMER, RE., BOLT,D.J.,etalo
Integration,expressionandgerm-linetransmis-
siGOof growth-relatedgenesin pigs.J Reprod
Fertil,v.41(Suppl),p.77-87,1990.
PURSEL, Y.G.,PINKERT, CA., MILLER, KF., et
aI. Geneticengineeringof livestock.Seienee,
v.244,p.1281-1288,1989.
PURSEL,Y.G.,REXROAD,C.E.Statusofresearch
with transgenic farm animais. J Anim Sei,
v.71(Suppl3),p.1O-19,1993.
PURSEL, Y.G., REXROAD, C.E Jr., BOLT,D.I.,
etaI.Progressongenetransferinfarmanimais.