Protocolo de retrotranscrição (2)

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PROTOCOLO PARA RETROTRANSCRIÇÃO (OBTENÇÃO DE cDNA)
Fazer a quantificação do RNA presente na amostra, com o auxílio do Nanodrop.
- Abrir o programa, clicar em ácidos nucléicos, escolher a opção RNA e salvar (File new workbook save)
- Fazer primeiramente o branco: pipetar 1 uL de água DEPC no leitor, fechar a tampa e clicar em Blank.	Comment by Valeria: Eu costumo usar 1.2uL só pra evitar formação de bolha que irá exigir que vc repita a operação e use mais 1uL de amostra...
- Após o branco, quantificar as amostras: pipetar 1 uL da amostra no leitor, fechar a tampa e clicar em Measure
- Entre cada quantificação, limpar delicadamente o leitor com papel higiênico.
- Anotar todas as quantificações (a amostra ideal deve ter uma razão A230A260/A280 > de 1,8 a 2,2)
Calcular a quantidade de RNA para cada amostra (1000ng)
Calcular a quantidade de água DEPC para cada amostra (o suficiente para completar o volume final de 5 uL, subtraindo a quantidade da amostra e do mix (2,1 uL)
Limpar a capela de fluxo laminar com álcool 70% e ligar o UV por 15 minutos.
Identificar os tubos eppendorf de 0,2 uL
Pipetar a água DEPC nos tubos.
Pipetar as amostras nos tubos.
Preparar o mix:	Comment by Valeria: Esses volumes são muito pequenos...eu faria reação em 20 uL de volume final
- 0,5 uL do tampão (10x PCR Buffer sem Mg) por amostra (Marca: Ambion)
- 1,5 uL de MgCl2 50mM por amostra (Marca: pht)	Comment by Valeria: O tampão já vem com magnésio...pelo que entendi vc precisará suplementar MgCl2 antes de fazer a transcrição reversa...o EDTA é justamente para quelar os cátios divalentes, pq eles com aquecimento causam quebra no RNA. Daí na etapa de transcrição a gente precisa por mais magnésio por causa do excesso de EDTA que vai junto
- 0,1 uL de DNAse I por amostra (Marca: Ambion 2U/ul)	Comment by Valeria: Poderíamos chegar num meio termo e usar 0.5 uL...
8) Pipetar 2,1 uL do mix nos tubos.
9) Aguardar 15 minutos em temperatura ambiente.	Comment by Valeria: O protocolo diz para incubar a 37 graus por 30 min
10) Adicionar 1 uL de EDTA 2,5 mM em cada amostra (Diluído 1:1) (Marca: Synth EDTA Sal dissódico PA)	Comment by Valeria: Depois mostro pra vcs o pq, mas a concentração final de EDTA tem que ser levemente maior que a soma de todas as concentrações de todos os cátions divalentes nos tampões
11) Levar ao termociclador, no programa DNASE (65ºC, 10 minutos, volume 5uL)
12) Retirar do termociclador e deixar resfriar no gelo por 1 minuto.
13) Adicionar 1 uL de Random Primer (Diluído 1:4) em cada amostra. (Marca: Promega 500ug/ul)
(Ás vezes utilizamos Oligo dT (Marca: IDT 10ug – 1660,0 pmoles)
* Quando utilizamos Oligo dT, nós diluímos o que chega da empresa (1uL para 29uL de agua) 
14) Levar ao termociclador, no programa OLIGODT (70ºC, 5 minutos, volume 7uL)
15) Retirar do termociclador e deixar resfriar no gelo por 1 minuto.
16) Preparar o mix:
	- 0,5 uL de DNTP por amostra (Marca: Invitrogen 10mM dNPT mix)
	- 0,25 uL de RNAsin (RNAse inhibitor) por amostra (Marca: RnaseOUT 40U/uL)
	- 3 uL de tampão (5x first buffer) por amostra (Marca: LW Biotec)
	- 0,25 uL Transcriptase reversa por amostra (Marca: LW Biotec 200U/ul)
	- 4,5 uL de água DEPC por amostra
17) Pipetar 8,5 uL do mix em cada tubo.
18) Levar ao termociclador, no programa RT (volume 15uL, 37ºC por 60 minutos e 70ºC por 5 minutos).
19) Retirar do termociclador e armazenar a -20ºC.