Resumo de Eng Genética

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Resumo de Engenharia Genética 
A tecnologia de DNA recombinante , com base essencialmente no processo de clonagem 
gênica, abriram uma grande era pra genética, conduzindo a rápidas e eficientes técnicas de 
sequenciamento de DNA, as quais permitiram que as estruturas de genes individuais fossem 
determinadas. A partir daí, foram desenvolvidos procedimentos para o estudo da regulação de 
genes individuais, o que permitiu que os biólogos moleculares entendessem como aberrações 
na regulação gênica podem resultar em doenças humanas, como o câncer. Essas técnicas 
geraram a biotecnologia moderna, que coloca os genes em funcionamento para a produção de 
proteínas e outros compostos necessários à medicina e aos processos industriais. 
Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante: é um conjunto de técnicas que 
permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar e expressar genes de quaisquer 
organismos. 
Transferência gênica horizontal: a transferência horizontal gênica é a troca de material genético 
entre células ou genomas de espécies não relacionadas, ocorrendo em procariotos através da 
conjugação, transdução e, principalmente, a transformação. 
#O material genético entre os organismos. Em especial as bactérias, por diversos mecanismos. 
O DNA pode ser captado do ambiente por transformação, transferidos por vírus por meio da 
transdução passada de outra bactéria de uma bactéria para outra por conjugação. 
#Qualquer segmento de DNA em uma população bacteriana pode ser horizontalmente 
transferido. Porém, apenas uma pequena porcentagem do DNA adquirido será mantido na 
célula receptora e, então, transferido para gerações subsequentes, pois muitos mecanismos 
limitam as aquisições horizontais de genes. Dentre esses mecanismos, encontram-se 
modulações fisiológicas, ambientais e genéticas. 
 
Clonagem gênica: consiste na inserção de um segmento selecionado de DNA (DNA doador ou 
inserto) em um plasmídio ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam como vetores de 
clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como 
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do 
DNA do hospedeiro replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma 
dessas células transformadas são obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células 
idênticas (clones), cada uma dotada de várias cópias do DNA recombinante. 
#Clonagem: obtenção de uma grande quantidade de uma determinada sequência de DNA de 
interesse. 
 
Vetores de clonagem: é capaz de transportar uma sequência de DNA “estranha” dando origem 
a um DNA recombinante. Para ser capaz de atuar como veículo para a clonagem gênica é 
necessário que uma molécula de DNA tenha capacidade de replicar-se no interior da célula 
hospedeira, de modo que numerosas cópias de molécula de DNA recombinante possasm ser 
produzidas e passadas às células-filhas. 
 Para ser um vetor de clonagem uma molécula precisa de: replicação autônoma (que 
permite a replicação a qualquer DNA que se ligue); marca de seleção (permite que células 
contendo o vetor – o DNA inserido neste – sejam identificadas [geralmente utiliza-se um gene 
de resistência a um antibiótico para diferenciar o organismo]); sítio para clonagem (sítio que 
contém as sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição [normalmente um sítio para cada 
enzima, para que essa possa “abrir” o vetor e aí ser colocado o insert]). 
#Porque utilizar vetor de clonagem? É utilizado para “enganar” a célula para que ela não destrua 
o fragmento de DNA que será inserido. No caso do vetor plasmídeo -> o fragmento dentro do 
plasmídeo vai fornecer uma compatibilidade, “enganando a bactéria”, e assim, o fragmento de 
DNA entra no organismo-alvo. 
#Os vetores de clonagem devem ser fáceis de purificar 
#Devem possuir locais de restrição únicos, polylinker (é uma sequência sintética de DNA que por 
conter vários sítios de restrição, pode ser utilizado com várias enzimas para fragmentar o DNA). 
 
Vetores de clonagem 
 
Plasmídeos: são moléculas de DNA circulares que contém uma existência independente na 
célula bacteriana. Os plasmídeos quase sempre são portadores de um ou mais genes que são 
responsáveis por características úteis apresentadas pela célula hospedeira (ex: capacidade de 
sobreviver a concentrações tóxicas de antibióticos); por isso, em laboratório, é frequentemente 
utilizada como marcador selecionável para assegurar que as bactérias em cultura contém um 
determinado plasmídeo. 
#Fazer plasmídeo recombinante (processo): plasmídeo nativo -> clivar o plasmídeo -> adição do 
fragmento de DA isolado com pontas coesivas -> colocar ambos num mesmo tubo de ensaio -> 
acrescentar DNA ligase -> DNA recombinante. 
*Pode acontecer da DNA ligase religar as pontas do plasmídeo, não recombinando o DNA de 
interesse. Para evitar isso, insere dentro do tubo de ensaio vários fragmentos de DNA de 
interesse para aumentar a chance de se ligarem com as extremidades do plasmídeo. 
*No final do processo: DNA recombinante + Plasmídeos que se religaram + Fragmentos de DNA 
no meio que não se ligaram a nada + moléculas de vetor que foram recircularizadas. Por isso 
deve ter técnicas de marca de seleção. 
*Os plasmídeos e os fragmentos de DNA unidos possuem resistência a determinados 
antibióticos; assim pode colocar os produtos do final do processo num meio com antibiótico, 
fazendo com que se obtenha apenas os DNA recombinantes (plasmídeo + DNA recombinante). 
 
Bacteriófagos ou fagos: são vírus que infectam especificamente bactérias. Esses vírus aderem a 
bactéria, perfuram sua membrana celular e injetam na hospedeira o seu conteúdo genético. 
Dentro da bactéria, o vírus aproveita da célula hospedeira para se reproduzir. Depois as 
partículas virais produzidas dentro da célula hospedeira são liberadas da bactéria. 
#A maioria dos organismos vivos é infectada por vírus e, por isso, é natural que haja um grande 
interesse na possibilidade de que vírus possam ser utilizados como veículos de clonagem em 
organismos superiores. Isso é especialmente importante quando lembramos que plasmídeos 
não são comumente encontrados em outros organismos, que não bactérias e leveduras. 
 
Cosmídeos: são resultados de uma hibridização entre plasmídeos e fagos (fago λ) [são 
plasmídeos que contêm um fragmento de DNA do fago λ que inclui o sítio cos]. Estes cosmídeos 
podem ser usados como veículos de clonagem molecular empregando o sistema de 
empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabeça e cauda) e assim é usado 
para infectar a célula hospedeira. 
#Aumentam a capacidade de clonagem em pelo menos 2x; mas são difíceis de utilizar. 
#É um vetor que está bastante em desuso, pois esse processo não é simples (o de 
empacotamento in vitro). É muito trabalhoso detectar quais são os clones e quais são as colônias 
não infectadas. 
 
Fagemídeos: a mesma ideia do cosmídeo, mas alguma característica de fago é também 
expressa. Foram desenvolvidos de modo a juntar as vantagens do fago e do plasmídeo. São 
particularmente úteis na clonagem de cDNA 
#Apresentam zona versátil de múltiplos locais de clonagem , o que permite a conagem de genes 
grandes (propriedade interessante no sequenciamento de DNA) 
 
 
 
 
Derivados dos bacteriófagos: 
• PAC (cromossoma artificial P1): contêm também sequências de bacteriófago P1, mas 
estas são introduzidas diretamente em plasmídeos em E. coli, permitindo a inserção 
de fragmentos de tamanho compreendido entre 130 e 150 kb. 
• BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmídeos naturais de E. coli, 
denominado de fator F. A origem de replicação e as outrassequências do fator F, 
permitem a sua replicação enquanto plasmídeos estáveis, possuindo inserções de 
120-300kb. Devido à sua estabilidade, capacidade de aceitar grandes fragmentos de 
DNA e facilidade de manuseamento, são agora os vectores de clonagem preferidos 
para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos. 
• YAC (cromossoma artificial de levedura): contém origens de replicação de leveduras 
e outras sequências (centrómeros e telômeros), que permitem a sua replicação 
como moléculas lineares do tipo cromossómico em células de levedura. 
 
pGEM T Easy vector(Promega): plasmídeo que vem dentro de um kit, contendo extremidade 
com alguas repetições de timina. 
 
#A escolha do vetor de clonagem vai depender do tamanho do fragmento de DNA que se 
quer clonar, da característica do hospedeiro e dos recursos do laboratório. 
 
Introdução do DNA na célula hospedeira: 
 
#A clonagem serve para dois propósitos: 
-Permite que um grande número de moléculas de DNA recombinante seja produzido a partir 
de uma quantidade limitada de material de partida. 
-Permite a purificação (as manipulações podem ser controladas a ponto de não permitirem 
que qualquer outra molécula de DNA esteja também no final do processo [processo que 
envolver a seleção de seleção de colônias recombinantes através de antibióticos, por 
exemplo 
*A clonagem é análoga a um processo de purificação, pois a partir de moléculas diferentes, 
podem ser obtidos clones contendo cópias de apenas uma molécula. 
 
Células competentes por cloreto de cálcio: trata uma bactéria com cloreto de cálcio para 
flexibilizar sua membrana, facilitando a abertura dos poros para que o material desejado seja 
inserido. 
#A maioria das espécies de bactéria, inclusive E. coli, incorpora apenas quantidade limitada 
de DNA sob circunstâncias normais. Para transformar tais espécies eficientemente, as 
bactérias devem passar por alguma forma de tratamento físico e/ou químico que aumente 
as suas capacidades de captação de DNA. Células submetidas a esse tratamento são ditas 
competentes. 
#Células incubadas em uma solução de sal gelada (ex cloreto de cálcio) capta DNA de forma 
mais eficiente que células não tratadas 
#A transformação de células competentes implica a necessidade de encontrar uma maneira 
para distinguir entre uma célula que incorporou um plasmídeo os muitos milhares de células 
que não foram transformadas. Por isso, utiliza-se marcador de seleção presente no 
plasmídeo (um gene que confere uma propriedade característica à célula transformada, que 
não ocorre em uma bactéria não transformada). 
#A maioria dos vetores de clonagem carrega pelo menos um gene que confere resistência a 
antibiótico às células hospedeiras, com a seleção de transformantes sendo feita por 
plaqueamento em meio de ágar que contém o antibiótico relevante. A resistência ao 
antibiótico não é devida meramente a presença do plasmídeo nas células transformadas. O 
gene de resistência do plasmídeo também deve ser expressado para sitentização da enzima 
que desintoxica o antibiótico. A expressão do gene de resistência começa imediatamente 
após a transformação, mas leva alguns minutos até que a célula contenha uma quantidade 
de enzimas suficiente para ser capaz de suportar efeitos tóxicos do antibiótico [assim, 
bactérias transformadas não devem ser plaqueadas em meio seletivo imediatamente após o 
tratamento por choque térmico; em primeiro lugar elas devem ser colocadas em um 
pequeno volume de meio líquido, na ausência de antibiótico, e incubadas por um curto 
período]. 
Processo de eletroporação: consiste na aplicação de pulsos elétricos curtos de alta voltagem 
que aumentam o potencial de transporte de membrana, promovendo uma formação 
transitória de poros aquosos (“aquaporinas”) na bicamada lipídica, permitindo que 
macromoléculas migrem através desses poros. 
#Serve para bactérias e outros tipos de organismos. É o “choque-térmico”, o processo 
funciona dando choque elétrico nos vetores, facilitando a passagem dos vetores nas 
membranas das células hospedeiras. É um método mais elaborado devido a necessidade do 
equipamento “eletroporador”. É mais eficiente e, em relação ao custo benefício, é mais 
vantajoso. Entretanto o investimento inicial é caro devido o preço do equipamento. 
 
Bombardeamento de DNA (biobalística): é um método de transferência direta de genes em 
uma célula. 
#Shotgun: dá tiro dentro das células que estão sendo trabalhadas. Há uma força propulsora 
que arremessará partículas de ouro envoltas com DNA m direção as células, com o objetivo 
de atingir o núcleo celular. O equipamento é caro e somente para usos específicificos. 
 
Lipossomas e vírus atenuados: é um método pouco utilizado, utilizado apenas em terapia 
gênica. Basicamente ativam o sistemas de endocitar células, favorecendo a entrada do DNA 
de interesse. 
 
Passos para clonagem de fragmentos de DNA em vetores: 
1- digestão, PCR (ou RT-PCR) do genoma onde está o gene que se pretende isolar 
(fragmento de DNA); 
2- inserção dos fragmentos de DNA num vector (um fago ou um plasmídeo, 
geralmente); 
3- introdução do DNA recombinante numa bactéria RE–; 
4- isolamento dos clones. (através de marcas de seleção [ex: lac Z]) 
5- confirmação dos clones (enzima de restrição e/ou PCR 
Screening de colônias azuis e brancas: é um método de seleção: 
• O X-Gal é utilizado para triagem azul-branca. Em diversos vetores de clonagem, um 
"sítio de clonagem múltipla" está presente no meio da sequência codificadora do 
fragmento α (parte N-terminal) da β-galactosidase. Nesse sítio é possível colocar 
DNA exógeno de interesse, como fragmentos provenientes de PCR. Com isso, a 
sequência da β-galactosidase é quebrada somente nas células transformadas com 
vetor contendo o inserto (DNA exógeno de interesse, que passam a não expressar 
mais a enzima. Disso segue-se que essas células não poderão mais clivar a X-Gal, não 
produzindo produto azul. Nesse processo de transformação, as colônias sem o 
fragmento exógeno inserido no vetor aparecerão em azul, enquanto as brancas (com 
o DNA de interesse) aparecerão brancas. A X-Gal é utilizado normalmente em 
conjunto com IPTG (um indutor do promotor lac), para a triagem das colônias azuis. 
#No meio de cultura tem lactose, se a enzima estiver presente na célula, vai transformar o 
composto numa coloração azul. Por isso utiliza-se culturas de cores brancas. 
#Na prática, coloca-se o X-Gal e o o IPTG para fazer o screening, onde: 
 -O X-Gal é um análogo a lactose; 
 -O IPTG é um indutor do mecanismo de operon 
 -A β-galactose vai clivar o X-Gal, formando uma coloração azul (bactérias azuis não 
possuem inserto de fragmentos de DNA; 
 -As colônias de interesse possuem coloração branca 
#Quando a bactéria já tem o mecanismo de operon “naturalmente”, tem que ter um processo 
de inativação desse operon, eliminando uma parte ou utilizando outro método de marcas de 
seleção. 
 
Biblioteca de DNA genômico 
A biblioteca que inclui fragmentos representativos da totalidade do genoma de uma 
célula ou organismo é designada por biblioteca genômica. Nesta biblioteca estão presentes 
não só as regiões codificantes mas também as regiões não codificantes. Desta forma, quando 
se pretende estudar uma zona não codificante mas importante para a regulação da 
transcrição, por exemplo, recorre-se a este tipo de biblioteca. 
Passos necessários para construção de uma biblioteca genômica são: 
• Isolamento de DNA de alto peso molecular; 
• Digestão do DNA isolado com enzimas de restrição de modo a produzir fragmentos de 
tamanho compatível com o vector de clonagem; 
• Ligação desses fragmentos ao vector, geralmente baseado no fago l;• Introdução do DNA recombinante nas células hospedeiras de E. coli. 
#Quando se pretende obter um certo fragmento da biblioteca é necessário fazer o screening, 
ou seja, utilizando sondas de DNA, identifica-se e seleciona-se os clones que contêm o 
fragmento de interesse. 
 
 
 
Bibliotecas de DNA complementar (cDNA) 
A enzima transcriptase reversa é capaz de sintetizar DNA a partir de mRNA. Desta 
reação, surge o cDNA que é constituído apenas pela parte codificante, uma vez que o mRNA só 
contém os éxons. Assim, a sua utilização na área da biotecnologia trouxe muitas vantagens como 
a possibilidade de cDNAs de células eucarióticas superiores serem diretamente transcritos e 
traduzidos em microrganismos, permitindo assim a produção em grande escala de polipeptídios 
ou a determinação direta da sequência de RNA e subsequente dedução da sequência de 
aminoácidos da proteína por ele codificada, importante para a sequenciação. Com a utilização 
crescente deste tipo de DNA surgiu a necessidade de organizar esta informação em bibliotecas, 
da mesma forma que se fez para o DNA genômico. 
A construção de bibliotecas de cDNA passa pelas seguintes etapas: 
• Extração do RNAm total da célula de interesse; 
• Síntese in vitro de cDNA a partir do RNAm pela transcriptase reversa e conversão das 
moléculas de cadeia simples de cDNA em cadeia dupla pela polimerase; 
• Introdução dos cDNA recombinantes nos vetores e estes nas células hospedeiras; 
• Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem dos clones 
recombinantes. 
#Tal como nas bibliotecas de DNA genômico, quando se pretende obter um certo fragmento da 
biblioteca é necessário fazer o screening. Neste caso, se a sequência for conhecida utiliza-se 
sondas de DNA, se não utiliza-se anticorpos (se cDNA estiver num vetor de expressão). Depois 
identifica-se e seleciona-se os clones que contêm o fragmento de interesse. 
 
Produção de protozoários e animais transgênicos: 
 
Métodos diretos: Causam danos 
#Fazem modificações nas membranas para inserir o DNA de interesse. 
Métodos indiretos: não causam danos. 
 
-PEG 
#Policátions, como o polietilenoglicol (PEG) pode ser usado como agente químico, permitindo a 
passagem passiva do DNA para dentro da célula vegetal. No contato dos protoplastos com os 
policátions, a permeabilidade da membrana é aumentada pela interação das cargas positivas 
dos policátions com as cargas negativas do DNA e da membrana, facilitando a penetração. (Os 
policátions também protegem o DNA exógeno contra a ação de nucleases da célula vegetal). 
*A maior limitação do uso dessa técnica consiste na obrigatoriedade do uso de protoplastos. 
-Eletroporação 
#Introduz macromoléculas em células 
-Bombardeamento de partículas 
#utiliza microprojéteis em alta velocidade para introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas 
em células e tecidos in vivo. [para protozoários o bombardeamento de partículas não é muito 
utilizado]. 
 
-Métodos químicos: DNA-fosfato de cálcio; DNA-lípide; DNA-proteína; cromossomos 
artificiais,etc. 
-Métodos físicos: microinjeção direta; eletroporação; injeção de plasmídeo; injeção balística de 
DNA 
 
OGM vs Transgênicos: 
 
Um OGM é um ser biológico (semente, planta, inseto, animal) que sofreu alguma 
mudança artificial em seu material genético (DNA). Caso a mudança tenha sido apenas 
estrutural ou na função do próprio material genético do organismo sem ter havido introdução 
de um novo material genético de uma especie diferente, então esse organismo é considerado 
um OGM. Quando há introdução de material genético de uma espécie diferente, esse organismo 
passa a ser, além de um OGM, um organismo transgênico.