RESUMOS Engenharia Genética

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Engenharia Genética 
Teóricas 
Resultados da Engenharia Genética 
• Novos produtos 
• Nossos processos 
• Novas terapias 
Várias definições 
- Compreender como todos os genes se relacionam uns com os outros e toda a componente 
epigenética de forma a podermos controlar um certo objetivo para se poder manipular. 
- Manipulação artificial, modificação e recombinação de DNA ou outras moléculas de ácido 
nucleico para modificar um organismo ou população de organismos. 
- A engenharia genética é a alteração do material genético por intervenção direta na 
genética, por processos com a finalidade de produzir novas substâncias ou melhorar funções de 
organismos existentes. 
- Grupo de técnicas aplicadas de genética e biotecnologia usadas para cortar e unir o material 
genético, especialmente o DNA de uma ou mais espécies de organismo, e introduzir o resultado 
hospedeiro, a fim de mudar uma ou mais das suas características. 
- Modificação genética onde um gene sintético ou DNA estranho é inserido em um organismo 
de interesse. 
O que é clonagem? 
- Um grupo de células idênticas derivadas de um ancestral comum. Remove-se um gene de 
um certo DNA genómico de um organismo, insere-se num vetor de clonagem e transforma-se 
num hospedeiro que o vai replicar. 
- Reprodução de organismos geneticamente idênticos, natural ou artificialmente, por 
reprodução assexuada. 
• DNA recombinante: moléculas de DNA formados por ligações a partir de diferentes 
fontes (organismos). 
• Transgénico: organismo ou célula na qual um ou mais genes exógenos (de outro 
organismo) foram incorporados. É um OGM. 
• Organismo geneticamente modificado: organismo cujo genoma foi projetado para 
permitir que a expressão/produção de traços ou produtos desejados. 
Contextualização histórica 
- 1940: A. Jost cunha o termo “engenharia genética” 
- 1966: Código genético decifrado 
- 1967: DNA ligase 
- 1968/1970: enzimas de “corte” de DNA 
- 1973: Unindo fragmentos de DNA a um plasmídeo (tecnologia de DNA recombinante 
estabelecida) 
- 1973: primeiro gene animal clonado 
- 1976: Primeira Empresa de Engenharia Genética (Genentech) 
- 1977: Métodos de sequenciamento de DNA estabelecidos 
- 1978: Genentech produz insulina humana em E. coli 
- 1980: O primeiro camundongo geneticamente modificado foi desenvolvido 
- 1983: Mullis desenvolveu PCR (reação em cadeia da polimerase) 
- 1988: O primeiro milho transgénico foi desenvolvido 
- 1990: A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou o primeiro alimento 
geneticamente modificado 
- 1991: A terapia genética foi experimentada e testada pela primeira vez em humanos 
- 1995: O primeiro genoma bacteriano completo foi sequenciado 
- 1996: Dolly, o primeiro animal clonado, nasceu. Plantio comercial de OGM. 
- 2001: Lançamento do primeiro rascunho da sequência do genoma humano 
- 2009: Primeiro ensaio clínico com células-tronco embrionárias. Primeira droga produzida 
em animal geneticamente modificado 
- 2015: Primeiro animal transgénico para consumo humano 
- 2016: Tecnologia de edição de genoma CRISPR num ensaio clínico 
Enzimas de restrição 
Endonucleases que servem para cortar o DNA em locais específicos. 
Existem para defesa contra vírus, substituir uma cadeia de DNA por outra (topoisomerases) e 
impede a entrada de DNA exógeno. 
Conferência Asilomar (1975) 
Um grupo de biólogos se reúne com alguns advogados e médicos para criar diretrizes para o uso 
seguro de DNA geneticamente modificado 
Objetivo: abordar os riscos biológicos apresentados pela tecnologia de DNA recombinante 
Recomendações: 
• O projeto experimental deve considerar a contenção (ter cautela) 
• A contenção deve corresponder ao risco estimado 
• Barreiras biológicas devem ser criadas para limitar a disseminação de DNA 
recombinante 
Consequências: 
• Impacto público 
• Pesar os benefícios 
• Setor de biotecnologia 
Impactos: 
• Pesquisa: estrutura e função do gene. 
• Medicina: vacinas, anticorpos monoclonais, modelos animais, animais doadores, terapia 
génica. 
• Indústria: proteínas e enzimas. 
• Agricultura: alimentos geneticamente modificados resistentes a pragas, doenças e 
herbicidas. 
 
 
Sequenciação de DNA 
É relevante pois: 
• conseguimos observar se determinada doença provém de bases azotadas 
• ao conhecer a sequência também a podemos alterar mediante o nosso objetivo 
• reconstruir histórias evolutivas e filogenéticas 
• permite sequenciar o vetor para o usarmos na 
clonagem 
Faz uso dos análogos 2', 3'-didesoxi e arabinonucleotídeo do 
normal desoxinucleotídeos trifosfatos, que atuam como 
inibidores específicos de terminação de cadeia da DNA 
polimerase (interrompem a síntese). 
Princípio de Sanger 
Temos uma determinada cadeia de DNA que estaria inserida num clone e fazia-se uma reação 
de síntese. O primer que se liga a uma determinada região do DNA molde e depois adiciona-se 
os nucleótidos distintos. Em cada um dos nucleótidos, há um dedisoxinucleótido diferente. 
Manualmente, a leitura do gel era feita em cada poço, começando pela base do gel até ao topo 
e identifica-se a sequência. 
Com a evolução, desenvolveu-se um processo automático. 
Princípio de nova geração: 
 
Amplificação clonal de recursos de sequenciamento de segunda geração 
a) Plataformas 454 e SOLiD - PCR de emulsão. Ligam-se adaptadores à sequência de DNA. 
Estes adaptadores têm a função ligar os fragmentos a umas pequenas esferas e 
mobilizá-los. As esferas são posteriormente misturadas com um conjunto de reagente 
que origina uma emulsão (gotículas). Dentro das gotículas, tem reatores onde ocorrem 
reações de PCR e vão sendo geradas cópias daquele fragmento. 
b) Tecnologia Illumina / Solexa - PCR de ponte (também conhecida como PCR de cluster). 
É mais utilizada e temos uma matriz sólida que tem um conjunto de regiões que são 
complementares a um dos primers que utilizamos para ligar como adaptador aos 
fragmentos. Esses fragmentos vão ser imobilizados contra a placa e cada primer se liga 
a uma extremidade diferente (formando uma ponte). Inicia-se então um processo de 
síntese e é gerada uma cópia da cadeia. 
 
Pirosequenciação 
Princípio de ELIDA “Enzimatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay” 
1. Reação de polimerização do ácido nucleico 
(polimerase) 
2. PPi inorgânico é libertado 
3. PPi é subsequentemente convertido em ATP 
por ATP sulfurilase 
4. Luciferase oxida luciferina e gera luz 
 
 
Tecnologia 454 
 
É usada uma placa que contém vários poços e p processo é feito de forma sequencial. O 
sistema permite que vão sendo adicionados nucleótidos sequencialmente e há medida que vão 
sendo incorporados, vão sendo emitidos sinais (sinais luminosos) 
Tecnologia dos iões 
Diferença: como é feita a deteção da incorporação dos nucleótidos (não é emitido um sinal 
luminoso). A base da placa tem um sensor que gera uma pequena variação no pH e liberta um 
protão H+ cada vez que é incorporado um nucleótido. 
 
 
Tecnologia Illumina (mais utilizado) 
 
b) Adaptadores ligam-se a uma matriz sólida e depois são amplificados gerando as cópias. No 
final, ficamos com os fragmentos de cadeia simples e vamos sequenciá-los a partir da matriz 
sólida. 
c) O nucleótido é incorporado, é detetado o sinal fluorescente que desbloqueia o terminal 3’ 
(não avança para a incorporação do novo nucleótido enquanto não for desbloqueado). 
Tecnologia PacBio 
SMRT - Sequenciamento em tempo real de moléculas únicas desenvolveu PacBio. 
Ao contrário do SGS, o sequenciamento PacBio é um método para sequenciamento em tempo 
real e não requer uma pausa entre as etapas de leitura. Esses recursos distinguem o 
sequenciamento do PacBio do SGS, por isso é classificado como o sequenciamento de terceira 
geração (TGS). 
Comprimentos de leitura muito mais longos e execuções mais rápidas do que os métodos SGS, 
mas é prejudicado por um menor rendimento, maior taxa de erro e maior custo por base. 
Umavantagem importante do sequenciamento do PacBio é o comprimento da leitura. Enquanto 
o PacBio RS original com a primeira geração química C1 gerou comprimentos médios de leitura 
em torno de 1500 bp, o sistema PacBio RS II com a química C4 atual apresenta leitura média de 
comprimentos acima de 10 kb, com um N50 de mais de 20 kb (ou seja, mais da metade de todos 
os dados estão em leituras mais de 20 kb) e comprimentos máximos de leitura acima de 60 kb. 
Em contraste, no rendimento total, a leitura máxima comprimento do Illumina HiSeq 2500 é 
apenas 250 bp de extremidade emparelhada (usando o modo de execução rápida). 
Modelo SMRTbell 
• O que está imobilizado numa matriz é a DNA polimerase! 
É um círculo fechado de cadeia simples de DNA que é criado ligando adaptadores para ambas 
as extremidades de uma molécula alvo cadeia dupla de DNA. 
A polimerase está ancorada na parte inferior de um ZMW e incorpora bases na leitura vertente. 
Célula SMRT única 
Cada célula SMRT contém 150.000 ZMWs. 
Aproximadamente 35.000-75.000 destes poços produzem uma leitura numa corrida duradoura 
de 0,5–4 h, resultando em 0,5–1 Gb de sequência. 
Sequenciamento por meio de pulsos de luz 
A. Um SMRTbell (cinza) difunde-se num ZMW e o adaptador liga-se a uma polimerase 
imobilizada na parte inferior. 
B. Cada um dos quatro nucleotídeos é marcado com um corante fluorescente diferente para que 
eles tenham espetros de emissão distintos. Como um nucleotídeo é mantido no volume de 
deteção pelo polimerase, é produzido um pulso de luz que identifica a base. 
Tecnologia nanopore 
Lançado pela Oxford Nanopore Technologies 
Identifica bases de DNA medindo as mudanças na condutividade elétrica geradas, pois as fitas 
de DNA passam por um poro biológico. 
Medindo apenas 10 × 3 × 2 cm e pesando apenas 90 g, o MinION é o menor dispositivo de 
sequenciamento atualmente disponível. Ele pode ser conectado diretamente a uma porta USB3 
padrão a um computador com baixo requisito de hardware e configuração simples. 
Tem a capacidade de sequenciar moléculas únicas, comprimentos de leitura longos, análise em 
tempo real e eficácia de custo. 
A taxa de transferência por execução da célula de fluxo não é muito estável e as taxas de erro 
são maiores do que as leituras do PacBio. 
 
NGS vs. Sanger 
Sequenciamento Sanger: 
• Sequenciamento de genes únicos 
• Sequenciamento de 1-100 alvos de ampliação com o 
menor custo 
• Sequenciamento de 96 amostras por vez 
• Identificação microbiana 
• Análise de fragmentos, genotipagem de alto rendimento 
• Análise de microssatélites ou STR 
• Confirmação NGS 
NGS: 
• Interrogando mais de 100 genes por vez, de maneira 
económica 
• Encontrar novas variantes, expandindo o número de alvos 
sequenciados numa corrida única 
• Amostras de sequenciamento que têm baixas quantidades 
de entrada de material 
• Sequenciamento de genomas 
 
Manipulação da expressão génica 
Sequência de DNA → Deteção de ORF → Proteína: função e atividade 
 
 
Para expressar, precisamos de clonar. Vetor de expressão é um vetor de clonagem com algumas 
características adicionais que um vetor de clonagem típico não tem. 
 
Vantagens das tecnologias recombinantes 
1. Enzimas superproduzidas por fermentações microbianas 
2. Produção de enzimas a partir de organismos difíceis de cultivar ou manipular geneticamente 
3. Produção de enzimas a partir de espécies patogénicas ou produtoras de toxinas 
 
Hospedeiros para a produção de proteínas recombinantes 
 
 
Fatores que determinam o hospedeiro e o vetor para a produção de polipeptídeos estranhos 
Para fazer a escolha destes: 
Segurança 
• Potencial virulência para o hospedeiro 
• Contenção do hospedeiro 
• Toxicidade potencial do produto 
Fermentação 
• Taxa de crescimento da cultura 
• Densidade celular alcançada 
• Custos de indutores metabólicos e de média 
• Propriedades físicas das células (espuma, sedimentação, etc.) 
Estabilidade 
• Estabilidade da (s) sequência (s) de DNA dos clones 
• Estabilidade do vetor no hospedeiro 
• Toxicidade do produto para o hospedeiro 
Expressão 
• Dosagem de gene otimizada (número da cópia do vetor) 
• Controle de expressão 
• Transcrição eficiente 
• Tradução eficiente 
• Nível de expressão totalmente induzida 
• Razão de expressão gênica induzida:não induzida (especialmente para produto letal) 
• Estabilidade do produto (por exemplo, suscetibilidade à degradação) 
Recuperação 
• Aceitabilidade da proteína como um organismo de inclusão, ou como um produto 
exportado para periplasma ou meio 
 
 
Comparação de vários sistemas de expressão 
de proteína recombinante comercial 
 
 
 
Recursos de vetor de expressão (E. coli) 
Objetivo: expressar determinado gene para obter uma proteína. 
Comum aos vetores de clonagem básicos: marcador selecionável, origem de replicação, sítio de 
clonagem múltipla. 
Promotor - inicia a transcrição; posicionado 10-100 nucleotídeos a montante do RBS (ligação ao 
ribossoma local). Geralmente deve: 
- Ser forte o suficiente para permitir o 
acúmulo de produto 
- Tem nível de expressão basal muito 
baixo (rigidamente regulado) 
- Seja fácil de induzir 
Marcador seletivo - resistência a antibióticos. 
Origem de replicação - para o plasmídeo gerar 
cópias. 
Terminador de transcrição: reduz a transcrição indesejada; aumenta a estabilidade do 
plasmídeo e do mRNA. 
Sequência Shine-Dalgarno: necessária para o início da tradução; determina a eficiência da 
iniciação da tradução; posicionados 4-14 nucleotídeos a montante do codão de início com o 
espaçamento ideal sendo 8 nucleotídeos. 
Gene regulador (repressor): evita a expressão de baixo nível na ausência de indutor; 
constitutivamente expresso. 
Local de clivagem da protease - remover o marcador ou parceiro da proteína de fusão. 
 
Tags e proteínas de fusão 
• Melhorar a expressão: pode resultar a fusão de uma proteína heteróloga com um 
parceiro de fusão altamente expresso em expressão de alto nível da proteína de fusão. 
• Melhorar a solubilidade: a fusão de uma proteína heteróloga com um parceiro de fusão 
solúvel pode melhorar a solubilidade. 
• Deteção: fusão de uma proteína a um pequeno peptídeo ou proteína que é reconhecida 
por um anticorpo, ligação proteína ou outros métodos (por exemplo, GFP) permitindo a 
deteção durante a expressão e purificação. 
• Melhorar a purificação: Proteínas fundidas a marcadores ou proteínas que se ligam 
especificamente a resinas de afinidade. 
Que tipo de proteína deve ser expressa? 
Origem procariótica - sistema de E. coli é a melhor escolha. 
Origem eucariótica - devemos considerar outros fatores. 
 
Expressão de proteínas em corpos de inclusão 
Quando as proteínas recombinantes se acumulam intracelularmente em agregados insolúveis. 
Vantagens: 
• Os corpos de inclusão podem representar mais de 50% da proteína celular total. 
• Os corpos de inclusão contêm quase exclusivamente a proteína muito expressa. 
• A proteína é protegida da degradação proteolítica. 
• A célula está protegida contra a toxicidade da proteína recombinante. 
Desvantagem: 
Para recuperar proteínas ativas e solúveis de corpos de inclusão em alto rendimento, é 
necessário para realizar procedimentos complexos, demorados, caros e, às vezes, protocolos 
ineficazes para: 
• Isole os corpos de inclusão (exemplo: centrifugação) 
• Solubilizar as proteínas agregadas (exemplo: agentes desnaturantes e temperatura) 
• Redobrar as proteínas 
 
➢ Expressão da proteína alvo como uma proteína de fusão com um parceiro altamente solúvel, 
como glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação à maltose (MBP) ou DsbA podem 
melhorar a sua solubilidade. 
 
Melhorar a solubilidade da proteína 
• Reduzir a síntese de proteínas (temperatura mais baixa, promotor mais fraco, indutor) 
• Mudar o meio de cultura (controlar o pH, adicionar co-fatores, osmoprotetores, etc.) 
• Co-expressam foldases e acompanhantes 
• Induzira secreção para o periplasma (exemplo: pela adição de uma sequência líder) 
 
➢ Ou mude para um sistema de expressão eucariótico! 
 
 
Modificações pós-tradução: Problema para E. coli 
 
 
 
Uso de codões - limitação à expressão de proteínas 
Se o uso de codão da proteína alvo difere significativamente do uso de codão do hospedeiro: 
• Diminuição da estabilidade do mRNA (ao desacelerar a tradução) 
• Término prematuro da transcrição e / ou tradução, o que leva a uma variedade de 
produtos proteicos truncados 
• Frameshifts, exclusões e misin corporations 
• Inibição da síntese de proteínas e crescimento celular 
 
Em cada célula, a população de tRNA reflete de perto a tendência do codão do mRNA população: 
 
 
São diferentes e têm o mesmo código genético, mas existem diferenças na preferência do 
aminoácido que preferem codificar, tendo grandes implicações a nível da síntese. 
Se a proteína contiver codões raros de E. coli, ela pode ser expressa em uma cepa que co-
expressa os tRNAs para esses codões raros: 
 
 
Representação esquemática da expressão do estrangeiro proteínas em uma célula hospedeira 
típica de E. coli (A) e em uma célula de E. coli célula hospedeira que foi projetada para super 
expressar vários tRNAs raros (B): 
 
 
Mutagénese dirigida (trocar um codão pelo outro, mas o aminoácido mantém-se o mesmo) ao 
local para substituir codões raros por codões comumente usados. 
➢ Ou mude para um sistema de expressão eucariótico! 
 
Os níveis expressos também podem ser melhorados por: 
• Examinando o segundo codão: a eficiência da expressão varia dependendo deste codão. 
• Minimizando o conteúdo de GC na extremidade 5 ': Um alto conteúdo de GC na extremidade 
5' do gene de interesse geralmente leva à formação de estrutura secundária no mRNA. 
• Adição de um terminador de transcrição 
• Adição de um parceiro de fusão 
• Usando cepas hospedeiras deficientes em protéase 
O que é uma proteína recombinante? 
É posterior à utilização de vetores de expressão, pois estes expressam determinados genes para 
obter proteínas específicas. 
Uma proteína cuja sequência de aminoácidos é codificada por um gene clonado. 
A proteína recombinante é uma forma manipulada de proteína nativa, que é gerada em várias 
maneiras, a fim de aumentar a produção de proteínas, modificar sequências de genes (parte 
codificante é que é clonada, os exões) e fabricar produtos comerciais úteis. 
Porque precisamos de proteínas recombinantes? 
• Pesquisa biomédica para entender a saúde e a doença 
• Proteínas recombinantes para bioterapêuticos (medicina, fármacos, etc.) 
Purificação de proteínas recombinantes 
1. Amplificação do gene de interesse. 
2. Insira no vetor de clonagem. (Ex: PCR 8). 
3. Subclonagem num vetor de expressão. 
4. Transformação em bactérias (hospedeiro) que expressam proteínas, leveduras, … 
5. Teste para identificação de proteína recombinante. 
6. Produção (em grande escala). 
7. Isolamento e purificação. 
Purificação da proteína 
A tarefa é separar o componente desejado - um único tipo de moléculas - de uma mistura 
complexa, mas isso nem sempre é possível ou necessário, só quando precisamos de a 
caracterizar bioquimicamente. 
Proteínas celulares 
• Grande número de proteínas (maior do que o número de genes, especialmente em 
células eucarióticas) 
• A maioria dos tipos de células em organismos multicelulares expressa dezenas de 
milhares de proteínas diferentes 
• Abundâncias relativas de várias proteínas variam amplamente (grande faixa dinâmica) 
Exemplo: Com E. coli, uma fermentação de 2 litros, usando um meio complexo e eliminando o 
sobrenadante, irá gerar aproximadamente 50 a 80 g (peso das células). Em 2% a 5% da proteína 
celular total (peso da célula), estão disponíveis entre 100 e 300 mg de proteína recombinante. 
Proteínas solúveis podem ser recuperadas com bons rendimentos (> 50%). Proteínas insolúveis, 
que devem passar por um ciclo de desnaturação e dobramento, podem ser recuperadas com 
rendimentos mais baixos (5% a 20%). 
Portanto, usando fermentações em pequena escala e equipamentos de processamento em 
escala de laboratório, proteínas geralmente podem ser produzidas em quantidades suficientes 
(10 a 100 mg) para iniciar os estudos, incluindo determinações estruturais detalhadas. 
Objetivos da purificação de proteínas recombinantes (nativas) 
- Obter uma determinada proteína livre de outras e de componentes da célula. 
- Obter um bom rendimento (quantidade absoluta e proporção de montante inicial). 
Importante: 
• Manter a atividade do componente ao longo do processo 
• Rendimento é importante 
• Atividade/conformação 
• Alcançar um é muitas vezes às custas do outro 
• Manter a atividade/função da proteína 
• Evitar: 
o desnaturação irreversível (acontece por extremos de pH) 
o proteólise 
Fatores a considerar 
• Vetor de expressão 
• Sistema hospedeiro 
• Localização da expressão 
• Propriedades da proteína alvo: 
o Ligado à membrana 
o Solubilidade 
o Único ou múltiplos domínios (cadeias polipeptídicas) 
o Tamanho 
Purificação da proteína – Fluxo de trabalho 
1) Desenvolver um ensaio quantitativo 
➢ Medição quantitativa da atividade 
➢ Imunoensaio quantitativo (com anticorpos) 
➢ Geralmente deseja aumentar a atividade específica (U/mg proteína) em cada etapa, pois 
a quantidade de proteína vai diminuindo 
2) Ou um ensaio qualitativo 
➢ Ensaios de placa 
➢ Ensaio de eletroforese em gel (imunotransferência 
ou zimografia de ensaio de atividade em gel) 
➢ Imunoensaios: 
 
 
3) Definir a fonte 
➢ Superprodução em um sistema heterólogo 
➢ Acumulação intracelular ou extracelular 
➢ Solúvel ou em corpos de inclusão 
O uso de tags de fusão pode ajudar ou não… 
Proteínas marcadas → etapa de purificação única 
Proteínas não marcadas → purificação em várias etapas 
Tags de fusão 
• Expressão melhorada 
• Solubilidade aprimorada 
• Os compartimentos celulares podem ser direcionados 
• Deteção aprimorada (ex: fluorescência ou imunoensaio) 
• Purificação aprimorada (ex: usando troca iónica ou 
cromatografia de afinidade) 
- Pequenos peptídeos (comprimento do gene): GFP; Tag de poli-histidina; Tag FLAG; Myc-tag 
- Grandes peptídeos: Proteína de ligação à maltose (MBP); Ligação de quitina domínio; Domínio 
de ligação de celulose 
 
4) Definir a escala 
• Preparativo: purificações preparativas objetivam produzir uma relativamente grande 
quantidade de proteínas purificadas para uso posterior. Exemplos incluem a preparação 
de produtos comerciais, como enzimas. 
• Analítico: a purificação analítica produz uma quantidade pequena de uma proteína para 
uma variedade de pesquisas ou propósitos analíticos identificação caracterização. 
5) Definir as técnicas 
As etapas de separação podem explorar diferenças em: 
• Tamanho ou peso molecular: centrifugação; cromatografia de exclusão de tamanho 
• Propriedades físico-químicas: pontos isoelétricos (carga neutra pelo pH), através de 
cromatografias de troca iónica 
• Polaridade/hidrofobicidade: cromatografia de fase reversa e cromatografia de 
interação hidrofóbica 
• Ligação/atividade biológica: cromatografia de afinidade 
Evite degradação/desnaturação/perda de atividade: 
• Por proteases: use um hospedeiro de expressão deficiente em protéase, trabalhe rápido 
e trabalhe em baixa temperatura 
• Por valores extremos de pH 
• Estar ciente da concentração de proteína 
7) Purificação 
• Com mais frequência usando cromatografia. 
• O procedimento básico em cromatografia é o fluxo da solução contendo a proteína por 
meio de uma coluna empacotada com vários materiais. 
• Normalmente, as proteínas são detetadas à medida que estão saindo da coluna pela sua 
absorbância a 280 nm. 
As etapas iniciais de um esquema de purificação são geralmente aquelas que têm o menor poder 
de resolução, precipitação de sulfato de amónio, centrifugação ou para algumas proteínas, 
desnaturação por calor. 
✓ Esses procedimentostêm a vantagem de reduzir bastante a quantidade total de 
proteína na amostra. 
Procedimentos de alta resolução, mas de baixa capacidade, como cromatografia de afinidade, 
são frequentemente aplicadas apenas no final de um esquema de purificação, quando a 
quantidade total de proteínas é relativamente pequena e quando os contaminantes estão 
presentes em concentrações bastante baixas. 
Normalmente, é mais eficiente escolher métodos que exploram diferentes aspetos físicos ou 
propriedades funcionais das proteínas, em vez de etapas explorando a mesma propriedade. 
Assim, esquemas de purificação empregando a coluna de cromatografia, geralmente inclui pelo 
menos um procedimento de fracionamento de tamanho (filtração em gel) e pelo menos uma 
etapa de fracionamento de carga (troca iónica cromatográfica). 
Para proteínas marcadas, a cromatografia de afinidade é usada. 
Principais tipos de cromatografia 
• Exclusão de tamanho 
• Troca de iões 
• Afinidade 
 
Afinidade (pela cauda de histidinas) 
 
 
Mutagénese 
Mutações são alterações hereditárias no material genético e podem ocorrer espontaneamente 
ou podem ser induzidos. Estas fornecem variabilidade genética e são uma das forças motrizes 
da evolução. 
 
Aplicações 
• Estudo da estrutura e função do gene/proteína 
• Investigar as vias celulares 
• Selecionar mutações de DNA, RNA ou proteína com uma propriedade desejada 
• Introduzir ou remover locais de endonuclease de restrição 
• Evolução direcionada de moléculas 
• Engenharia de proteínas 
• Terapia de genes 
Mutagénese generalizada (ou aleatória) 
Cria mutações em locais indefinidos e não requer conhecimento de sequência ou função. 
Mutagénese dirigida ao local (ou específica do local) 
Produção de uma mudança específica predeterminada numa sequência de DNA. 
 
- Mutagénese in vivo (direta) 
- Mutagénese in vitro (exógena) 
 
Mutagénese aleatória (só as alterações) 
• Permite criar um grande número de mutações num gene ao mesmo tempo 
• Evolução natural “imita” 
• Pode criar diversidade e novas propriedades 
Processos para fazer mutagénese: 
• Química ou irradiação UV (física) 
• PCR sujeito a erros (mutagénese enzimática) 
• PCR com primers degenerados 
• Cepas mutantes 
• Análogos de nucleotídeos 
• Recombinação de DNA 
Experiência Beadle – Tatum (aleatória): 
Identificação e caracterização de mutantes nutricionais de Neurospora. 
 
A evolução dirigida (também aleatória) é um método de engenharia de proteínas que simula a 
seleção natural no laboratório. O processo começa com um gene que codifica para uma enzima 
de interesse do “tipo selvagem” ou não modificada. Variações aleatórias são introduzidas no 
gene por meio de um processo de mutagénese, gerando uma biblioteca de milhões de genes, 
cada codificação de uma variante enzimática única. Uma pressão de seleção funcional é então 
aplicada à biblioteca, e apenas os genes que codificam para as enzimas de melhor desempenho 
sobrevivem. Este processo de mutação aleatória e a seleção é repetida, até que a função 
enzimática desejada evolua. 
 
 
- Alta performance 
- Enzimas para PCR 
 
 
 
PCR na mutagénese (permite gerar cópias do DNA-alvo) 
 
PCR sujeito a erros 
Método usado para criar bibliotecas de mutações dentro de genes únicos. 
• Aumentar a concentração de dCTP e dTTP 
(em comparação com dGTP e dATP) 
• Aumentar as bases azotadas (A, T, G, C) 
• Aumentar a concentração de Mg2+ (MgCl2) 
• Introduzir a concentração de Mn2+ (MnCl2) 
• Polimerase Taq de baixa fidelidade (sem atividade de revisão) 
A área que sofre mutagénese é determinada pela posição dos primers. 
 
 
 
Transposões - genes móveis entre regiões de DNA 
Consiste em dois elementos: 
1. Enzima transposase (Tn5) que catalisa a reação de transposição 
2. Sequência de DNA transponível (transposão), contendo transposase, e sequências de 
reconhecimento 
 
A reação de transposição pode ser realizada in vitro ou in vivo. 
O transposão é inserido no DNA alvo numa maneira altamente aleatória e imparcial, podendo 
haver mutagénese. 
Uma enzima transposase catalisa a inserção aleatória de um transposão "artificial" em qualquer 
outro DNA, podendo inativar genes. 
Os transposões conferem a função desejada ao DNA alvo. 
 
Sequências de reconhecimento da transposase EZ-Tn5 da extremidade do mosaico de 19 pares 
de base: 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Os transposomas EZ-Tn5 são ideais para gerar bibliotecas de nocautes de genes 
aleatórios; 
• Os transposomas EZ-Tn5 estão disponíveis com resistência à canamicina ou resistência 
ao trimetoprim; 
• As bactérias Gram-negativas e Gram-positivas são transformadas com sucesso; 
• O transposome EZ-Tn5 foi otimizado para que, em média, apenas um transposão EZ-Tn5 
seja inserido no DNA de uma célula. 
Formulários/aplicações 
- Caracterização do genoma 
➢ Mutagénese por transposão da bactéria termofílica Thermus thermophilus HB27 
➢ Extremófilos; Volume 19, 2015, páginas 221-228 
➢ “Entendendo a vida em alta temperatura, mas também por suas aplicações 
biotecnológicas e industriais” 
- Identificação de novos genes 
➢ Identificação de sete novos genes de virulência de Xanthomonas citri subsp. citri 
baseado em Tn5 
➢ Mutagénese aleatória 
➢ Journal of Microbiology; Volume 53, maio de 2015, páginas 330-336 
- Identificação de genes essenciais 
➢ Mutagénese de saturação em todo o genoma de Burkholderia pseudomallei K96243 
prediz essencial 
➢ Genes e novos alvos para o desenvolvimento antimicrobiano 
➢ mBio janeiro/fevereiro 2014; 5: doi: 10.1128/mBio.00926-13 
Mutagénese dirigida ao local 
Mutagénese de cassete 
• 1 vetor de plasmídeo 
• 2 oligonucleotídeos sintéticos contendo 
a mutação 
• A cassete de DNA mutado é substituído 
no plasmídeo 
• O plasmídeo é usado para transformar 
células bacterianas 
- Quase 100% de eficiência 
- Introduzir uma ou mais mutações 
- Limitada pela disponibilidade de locais de 
restrição adequados 
Mutagénese de oligonucleotídeo 
• 1 vetor ssDNA 
• Hibridizado com um oligonucleotídeo contendo 
a mutação 
• Síntese de vertentes complementares 
• O plasmídeo é usado para transformar em 
células bacterianas 
 
Bacteriófago M13 
 
Genoma: DNA circular de fita simples de 
4,5 a 8 kb, codificando 4 a 10 proteínas. 
Replicação ocorre via dsDNA 
intermediário e círculo rolante. 
 
Vetores M13 
- Com base no RF de fita dupla; 
- Sítio de clonagem múltipla para gerar círculos de DNA recombinante de fita dupla; 
- Pode ser transfretado em cepas adequadas de E. coli; 
- As partículas de fago são colhidas e removidas dos seus revestimentos de proteína para 
libertar DNA recombinante de cadeia simples. 
Obter ssDNA de M13 
 
Mutagénese Kunkel 
• dut-: desoxiuridina trifosfatase não funcional (dUTPase), que degrada dUTP. Mutação 
vai permitir que dUTP se acumule e será incorporado no DNA por um erro. 
• ung-: uracil-N-glicosilase não funcional (cortes de U's (mutações de uracilo) encontrados 
no DNA, promovendo a excisão de base reparação do site). Em seguida, a mutação de 
U permanece no DNA. 
dUTP é incorporado em M13 ssDNA em uma cepa de E. coli com defeito nos dois enzimas uracil-
N-glicosilase (ung) e dUTPase (dut). 
 
O oligo mutagénico é hibridizado ao DNA molde contendo uracilo (U) e a síntese de DNA in vitro 
é realizada para gerar DNA de cadeia dupla. 
A sequência do oligo é perfeitamente complementar à sequência do gene na região de ser 
mutado, mas com uma única diferença: no local de mutação pretendido, ele carrega uma base 
que é complementar ao nucleotídeo mutante desejado em vez do original. 
 
Após a transformação de ung+, dut+ de E. coli, a fita modelo é degradada e o fagemídeo de 
cadeia dupla sobrevivente é isolado e sequenciado ou os clones são rastreados. 
Mutagénese dirigida em locais específicos, usando PCR 
Não requer modificações ou cepas exclusivas e incorpora mutações no DNA por PCR com 
primers padrão. 
Usa primers(A e D) complementares ao termina da 
sequência alvo e primers internos com extremidades 
complementares (B e C). 
Os primers internos contêm a mutação desejada e 
hibridizará com a região a ser alterada. Durante a 
primeira rodada de PCR, o AB e o CD fragmentos são 
criados. 
Esses produtos são misturados para o segundo PCR 
usando os primers A e D. O complemento 
extremidades dos produtos hibridizam neste segundo PCR para criar o produto final, AD, que 
contém a sequência interna mutada. 
Os primers internos, B e C, são posicionados em qualquer 
lado da região a ser excluído para impedir que seja 
incorporado dentro fragmentos AB e CD da primeira rodada 
de PCR. 
As sequências complementares nas extremidades desses 
fragmentos, criados pelos primers B e C, permite a 
hibridização de AB para CD durante a segunda rodada de 
PCR, e o produto final com a exclusão desejada (AD) é criada. 
Uma polimerase de alta-fidelidade que cria produtos de ponta cega é usada para produzir um 
fragmento linearizado com a mutação, que é então re-circularizado por intramolecular ligadura. 
(A) Exclusão: primers que hibridizam em qualquer um dos lados da área a ser excluída. 
(B) Substituição: um dos primers contém a mutação desejada (azul). 
(C) Inserção: os primers hibridizam em ambos os lados. Um primer contém a sequência 
adicional. 
 
Kit de mutagénese 
Incorporação rápida e eficiente de inserções, deleções e substituições de plasmídeo na fita dupla 
de DNA. A primeira etapa é uma amplificação exponencial usando primers padrão e um master 
mix de hot start. 
Polimerase de DNA de alta-fidelidade. A segunda etapa envolve a incubação com uma mistura 
única de enzimas contendo uma quinase, uma ligase e Dpn I. Juntas, essas enzimas permitem a 
rápida circularização do produto de PCR e remoção do DNA molde. A última etapa é uma 
transformação de alta eficiência em células quimicamente competentes. 
 
- Polimerase de alta-fidelidade é crucial para minimizar as chances de introdução de 
mutações indesejadas; 
- Uma enzima de "hot start" é desejável, como a capacidade de revisão da maioria dessas 
enzimas podem, de outra forma, degradar os primers durante a configuração; 
- Após a PCR, a digestão da Dpn I é crucial. Esta enzima cliva apenas nos locais metilados, por 
isso digere o plasmídeo modelo, mas não o produto de PCR. Esta significa que o plasmídeo 
modelo não pode vir de uma metilação cepa deficiente. 
Substituição de gene direcionada/gene knockout 
O gene knockout é uma técnica para inativar seletivamente um gene, substituindo-o por um 
alelo mutante num organismo normal, para perceber como funcionam a nível de doenças. 
Esta técnica de interromper a função do gene é uma ferramenta poderosa para desvendar os 
mecanismos pelos quais ocorrem os processos celulares básicos. 
• O gene é alterado in vitro 
• Introduzido no hospedeiro 
• Seleção 
Vetor suicídio: um vetor que não é capaz de se 
replicar; será eliminado da célula, mas parte 
pode ser integrada no cromossoma por 
recombinação. É um evento molecular básico na 
substituição de genes direcionados. 
Gene knockout em bactérias 
Usando DNA circular: Usando DNA linear: 
 
 Usa genes de recombinação homóloga de bacteriófagos 
Projeto de primer e construção de mutantes de deleção de um gene único 
 
 
Gene knockout em leveduras 
1) Plasmídeo recombinante: 
- Gene URA3 (marcador selecionável) 
- Gene mutante (amarelo) 
2) Transformar que requer uracilo (Ura3) 
células de levedura diploides. 
Nota: Células com plasmídeo crescem na 
ausência de uracilo. 
Recombinação intracromossómica produz células 
que perderam URA3 e retém o tipo selvagem 
(gene HIS3 ou o mutante his3). 
Células que carregam o gene mutante his3 são 
detetadas por plaqueamento na presença e 
ausência de histidina. 
As células recombinantes podem sintetizar 
actina? Como determinar se a actina é essencial 
para o celular? 
3) Induzir meiose e esporulação (privação 
celular) - esporos haploides. 
O experimento demonstra que o gene da actina é essencial para a viabilidade da levedura. 
O sistema Delitto Perfetto 
É um sistema de mutagénese local específico in vivo que foi desenvolvido para gerar mudanças 
à vontade no genoma da levedura. 
• Usa oligonucleotídeos sintéticos 
• Fornece uma ampla variedade de modificações do genoma por meio de recombinação 
homóloga 
 
Plasmídeos CORE usados na técnica Delitto Perfetto: 
A cassete CORE contém: 
CO marcador não selecionável de um gene reporter (recursos adicionais opcionais) 
Gene repórter - permite a seleção de células de levedura que recebem a cassete CORE. 
Marcador contra-seletivo - permite a seleção de células de levedura que perdem a cassete CORE 
pela integração do oligonucleotídeo mutado (sensibilidade a um composto). 
 
O processo de Delitto Perfetto: 
1. Inserção da cassete CORE no locus a ser alterado. 
2. Remoção completa (por remoção homóloga) da cassete com oligonucleotídeos e/ou 
outro material genético e transferência de as modificações genéticas esperadas para o 
locus de DNA escolhido. 
 
Gene knockout em camundongos (ratos) 
Estuda: 
➢ Desenvolvimento 
➢ Comportamento 
➢ Fisiologia 
➢ Doenças genéticas 
Três métodos principais desenvolvidos para a produção de camundongos transgénicos: 
 
As células-tronco embrionárias (ES) são linhas celulares pluripotentes com capacidade de 
autorrenovação e ampla plasticidade de diferenciação. 
As células ES de camundongo são capazes de se reintegrar totalmente em embriões viáveis 
quando injetadas em um hospedeiro blastocisto ou agregado a uma mórula hospedeira. 
Depois que esses embriões pré-implantação são implantados em uma mãe substituta, eles se 
desenvolvem em descendência de mosaico conhecida como quimeras. 
 
 
(a) O DNA exógeno é introduzido nas células ES e a inserção aleatória ocorre com muito mais 
frequência do que o gene direcionado inserção. 
neor (rosa) - gene de resistência à neomicina; inserido no cromossoma de recombinação 
homóloga e não homóloga. 
tkHSV (roxo) - gene da timidina quinase do vírus herpes simples; modifica o ganciclovir 
num composto tóxico, inserido no cromossoma apenas na recombinação não homóloga. 
(b) As células recombinantes são selecionadas por tratamento com neomicina; as células 
sobreviventes são tratadas com ganciclovir. 
Procedimento para gerar camundongos transgênicos usando células ES transformadas 
As células ES são manipuladas em cultura e contribuir para todos os tecidos do embrião, 
incluindo a linha germinativa. 
A transmissão do transgene pode ser confirmada por verificar se a prole de embriões quiméricos 
carrega ES marcadores de cor de revestimento celular. 
 
1. Alelos mutantes são introduzidos por recombinação homóloga em células-tronco 
embrionárias (ES). 
2. Células ES contêm uma mutação knockout num alelo do gene que está a ser estudado e são 
introduzidos no início embriões de camundongo. Os ratos resultantes serão quimeras que 
contêm tecidos derivados de ambas as células ES e as células hospedeiras. Essas células podem 
contribuir para as populações de células germinativas e somáticas. 
3. Camundongos quiméricos são acasalados para avaliar se o a mutação é incorporada na linha 
germinal. 
4. Cada camundongo heterozigótico para a mutação knockout é acasalado para produzir 
camundongos knockout homozigóticos. 
O sistema Cre-lox (no bacteriófago P1) 
É um sistema poderoso e específico para controlar a expressão génica. 
Foi aplicado com sucesso em leveduras, plantas, culturas de células de mamíferos e 
camundongos, com base na capacidade da recombinação 
de ciclização do bacteriófago P1 (Cre) - gene da 
recombinase para efetuar a recombinação entre pares de 
locais loxP. 
A Cre recombinase reconhece sítios loxP de 34 bp e a 
orientação e localizaçãodos sites loxP determinam como 
o material genético será reorganizado. 
Esta recombinação num camundongo, "Cre-lox", pode 
ativar ou inativar um gene de interesse. 
Geralmente, as estirpes Cre e loxP são desenvolvidas separadamente e, em seguida, cruzadas. 
 
Inversão: Se os locais loxP flanqueiam o segmento de DNA num arranjo cis e estão orientados 
em direções opostas. 
Deleção: Se os locais loxP flanqueiam um segmento de DNA num arranjo cis e estão orientados 
na mesma direção. 
Translocação: Se os sítios loxP estiverem localizados em diferentes cadeias de DNA e estiverem 
orientados na mesma direção. 
Gene Knockout específico do tipo de célula 
1. Os locais loxP são inseridos em cada lado do gene de interesse, gene X (azul) (a função do 
gene não é interrompida) 
2. O rato loxP é cruzado com um rato que tem um tipo de célula que controla um promotor 
específico da expressão da recombinase Cre, que induz a recombinação entre locais loxP. 
3. No rato Cre-loxP resultante, a proteína Cre é produzida apenas nas células em que o 
promotor está ativo (deleção do exão 2).