Cromatografia I

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Universidade Federal Fluminense
Instituto de Química
Departamento de Química Orgânica
Aluna: Isabele Policarpo
Professora: Márcia narcizo
Turma: FE
Relatório de Química Orgânica Experimental
Prática : Cromatografia 
1.1Introdução ....................................................................................2
1.2 Objetivo........................................................................................6
1.3Resultados e discussão ...............................................................6
1.4 Conclusão....................................................................................9
1.5 Parte Experimental ...................................................................10
1.6 Bibliografia.................................................................................13
Introdução 
	A cromatografia foi utilizada pela primeira vez por um botânico russo em torno de 1900 com suas pesquisas sobre a clorofila, a qual recebeu esse nome em 1906 numa publicação no jornal de botânica alemão, e demonstrou sua técnica para a sociedade alemã em 1907.
Existem 3 aplicações fundamentais para as técnicas cromatográficas: identificação de substâncias desconhecidas, separação dos componentes de uma mistura e purificação de amostras.A cromatografia é um método físico-químico de separação e está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, uma estacionária e a outra móvel. A fase estacionária, que é a parte fixa, pode ser um sólido, um líquido retido sobre um sólido, ou um gel. A fase móvel, o eluente, pode ser líquida ou gasosa.
Há diversos modos de classificar os tipos de cromatografia, a Figura 1 apresenta o esquema de um desses modos, sob um panorama geral e mais amplo.
Figura 1 – Esquema de divisão da cromatografia
1.1 – CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
	A dentro da cromatografia planar tem-se a cromatografia em camada delgada (CCD), também conhecida como cromatografia em camada fina (CCF), que é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Neste método a separação se dá pelo fenômeno de capilaridade através da diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária. Por ser um método simples, econômico e rápido é muito utilizado para o acompanhamento de reações orgânicas, para a purificação de substâncias e para a identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica.
	O parâmetro mais relevante a ser levado em conta na CCD é o fator de retenção (Rf), que consiste na razão entre a distância percorrida pela amostra em questão e a distância percorrida pela fase móvel, conforme esquematizado na Figura 2. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. A fase estacionária mais utilizada nesta técnica é a sílica gel, sendo seguida pela alumina, pela terra diatomácea e pela celulose (vide Figura 3). A fase móvel geralmente é constituída por um ou mais solventes, uma vez que as fases estacionárias mais usadas são extremamente polares, as fases móveis a serem utilizadas devem solventes pouco polares, que não iriam remover os compostos do ponto de aplicação, nem solventes muito polares, que arrastariam os componentes da amostra até o topo da placa. Por conta disso, melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em relação à polaridade dos componentes da amostra.
Figura 2 – Simulação de uma placa cromatográfica após eluição completa
Figura 3 – Estruturas da sílica e da celulose, respectivamente
	A determinação inexata do Rf(uma vez que ao repetir o procedimento outras vezes, a eluição não será a mesma) representa a maior desvantagem da cromatografia em camada delgada. Contudo, há algumas vantagens como fácil execução, maior rapidez, versatilidade, boa resolução e manchas pouco difusas.
Técnicas para revelação de placas
Quando os componentes da mistura a ser separada são coloridos, não é preciso o emprego de técnicas de revelação, porém, na maioria dos casos, esses componentes são incolores, o que torna necessária a realização de procedimentos:
Físicos: onde é utilizada uma câmara ultravioleta, cuja revelação se dá através do fenômeno de fluorescência. Normalmente, há um aditivo misturado a sílica chamado F-254 que é excitado no comprimento de onda 254 nm, revelando manchas incolores. Caso haja na amostra algum componente que absorva UV , é utilizado o comprimento de onda 365 nm, onde o indicador da sílica fica “escuro” é só as manchas ficam excitadas.
Biológicos e enzimáticos: são utilizadas reações enzimáticas ou bacterianas para tornar as manchas visíveis, sendo os reveladores mais comuns: antibióticos, enzimas e substratos.
Químicos: há a aplicação de reagentes químicos para tornar as manchas coloridas ou fluorescentes. Vários reveladores são utilizados, porém o universal é através de vapores de iodo, onde este forma complexos de cor marrom com os compostos insaturados.
Objetivos 
	Tem-se como objetivo geral observar os fatores que influenciam a separação dos componentes por meio do método realizado e o domínio da técnica apresentada, além de desenvolver a capacidade de escolha do melhor eluente frente a cada situação.
1.1 Experimento I (Cromatografia por camada delgada )- Os objetivos desse experimento são aplicar a fase estacionária placa de sílica , utilizar a câmara Ultravioleta como técnica de revelação de placas e, principalmente, separar a mistura de indicadores.
1.2 Experimento II (Cromatografia em coluna ) - Os objetivos desse experimento são utilizar a sílica como fase estacionária dentro de uma coluna e por meio disso separar os componentes da tinta de caneta preta .
1.3 Experimento III ( Cromatografia de alta eficiência ) - Os objetivos desse experimento é a análise de compostos não voláteis ou instavéis termicamente.Os compostos utilizados foram naftaleno ,bifenila ,metanol 90% e água 10 %.
Resultados e Discussão
	Para melhor compreensão deste item do relatório, o mesmo será subdivido de acordo com os itens anteriores, isto é, em 3 experimentos.
1.Experimento I - Algumas observações importantes:
A papa cromatográfica foi preparada pela mistura da sílica (figura 3) com o hexano(figura 8).
A fase estacionária (sílica) foi adicionada ao suporte de vidro (lâmina) por meio de uma técnica específica, que consiste na inserção da lâmina ao recipiente que contem a papa cromatográfica e aguardou-se a evaporação do solvente;
Amostra: mistura qualitativa de curcumina (figura 7) depois de misturada a cetona na extração por soxhlet sofreu uma separação novamente no evaporador giratório voltando ao seu estado inicial.
Foram disponibilizados os seguintes solventes orgânicos para que a dupla escolha a fase móvel : hexano,acetato de etila e metanol.
A dupla escolheu o C6H14
O eluente escolhido não foi capaz de “arrastar” os componentes da mistura com eficiência, isto é, de separá-los, pois apareceu uma mancha bem minuciosa ao final da eluição, sob a luz Ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 nm e 365 nm em comparação com as outras duplas que tiveram êxito em seus resultados. 
 
 Figura 7 - Estrutura da amostra 
 
 
Figura 8 – Estruturas dos solventes orgânicos mencionados no texto.
A dupla escolheu o hexano como fase móvel, deduziu-se que o C6H14 interagiria com a amostra porém, a escolha não foi bem-sucedida, talvez por conta da baixa polaridade do solvente. A escolha de um eluente de média polaridade como acetona ou acetato de etila talvez apresentasse um resultado satisfatório, visto que faria interações mais fortes com os componentes da mistura (do tipo dipolo-dipolo), além de poder fazer ligação de hidrogênio, devido aos átomos de nitrogênio, oxigênio e hidrogênio existentes nas estruturas das moléculas envolvidas. Entretanto, quando a amostra em contato com outros eluentes das outras duplas o resultado foi satisfatório. Emexperimentos cromatográficos é necessário que o solvente não tenha um caráter muito polar nem muito apolar pois muito polar tem uma capacidade enorme de adsorção já apolar tem muito apolar tem pouco poder de eluição ,isso tudo compromete a eficiência do resultado final .
 
 Imagens comparativas do experimento com o diclorometano a esquerda e Hexano a direita 
 Laboratório de química orgânica experimental -UFF
Experimento II - Dentro de um bécher foi colocada a fase estacionária (SiO2) e em seguida o metanol formando assim uma mistura . Essa mistura foi jogada na coluna e a medida que ia batendo e controlando o nível de etanol escorrendo a sílica ia criando determinada altura. Em uma pipeta, foi feita a aplicação de tinta preta juntamente com o eluente a coluna na primeira análise permitiu a separação das duas cores que formavam a cor principal. A medida que o composto da mistura foi sendo separado, foi formado 2 compostos, chamados de zonas móveis, em geral compostos apolares descem mais rápido na coluna, porque tem menos afinidade na fase estacionária Houve o aparecimento de três bandas, “amarelo” e “violeta”. Metanol e sílica possuem interações muitos marcantes com hidrogênio e oxigênio por isso pode-se concluir que são polares.Ao longo do experimento apareceram duas cores o amarelo e violeta.A cor violeta se aderiu ao álcool e sílica visto nitidamente nas paredes da coluna pois em nenhum momento houve um caimento dessa cor .Já o amarelado desceu rapidamente na coluna por essa questão é possível concluir que como o álcool e a sílica são extremamente polares a cor amarela é apolar pois ao entrar em contato com a fase estacionária e o eluente sentiu uma repulsão.Esse tipo de cromatografia foi importante também para identificar que outros tipos de cores estão contidas na tinta de cor preta e a separação das mesmas.
Experimento III- A técnica utilizada foi a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluição .Utilizada por químicos para separar e determinar espécies em uma grande variedade de materiais orgânicos ,inorgânicos e biológicos.A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à bomba ,injetor e coluna ,logo é necessário filtrá-las antes de armazená-las no reservatório.O método mais comum,para eliminar as partículas da fase móvel,consiste no uso de um filtro de aço adaptado diretamente na extremidade do capilar que capta o eluente do reservatório e o leva até a bomba. As fases móveis ,principalmente as plares,tem tendência a dissolver oxigênio e outros gases.Quando esses gases são liberados ,dentro do equipamento ,formam bolhas que podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna.Dessa forma é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel.Foram dissolvidas três amostras a primeira com naftaleno,segunda bifenila e terceira anfraceno (metanol e água) (figura 1) .Ambas introduzidas na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária.
Como esse método consiste no desenho cromatográfico cada pico indicou a separação das substâncias.O tempo em que o naftaleno demorou para demonstrar seu primeiro pico foi de 2,7 min.A bifenila durou aproximadamente 3,4 min e a mistura de metanol e água divididos em 4 cromatografias resultou em tempos anotados de 4,7 min;2,7min;2,5min e 4,7 min.
Analisando as 4 substâncias a mistura água e metanol foi a que obteve maior valor no tempo.Ao analisar as amostras conclui-se que quanto mais demora o tempo significa que ele tem mais afinidade pelo apolar ou seja a primeira amostra tem mais afinidade pelo solvente polar pois quem é mais polar tende a sair mais rápido.
 
 Formula estrutural das fases estacionarias (figura 1)
Conclusão 
Experimento I- Foi possível observar que o solvente hexano é menos polar pois não houve o deslocamento, porém o mesmo processo foi observado na placa dos nossos colegas com outros eluentes como diclorometano e metanol e no dicloro apareceu manchas isso significa que ele possui um caráter polar entretanto com o metanol não apareceu sendo que ele possui um caráter polar.Diante disso pode-se concluir que outros fatores como na amostra não ter curcumina ou ela não ser totalmente pura contendo algumas substâncias.
Experimento II - Essa separação em coluna foi eficiente pois além de mostrar que outros tipos de cores dentro da tinta preta utilizada como amostra além disso esse método é eficiente para identificação de polaridade entre as substâncias da amostra por meio da interação que elas possuem com a fase estacionária e móvel.
Experimento III- Com esse método a separação de substâncias se torna muito mais precisa através de imagens gráficas. Com a utilização de uma coluna reversa ou seja a fase móvel é menos polar que a fase estacionária .E tem como fator o tempo de retenção de acordo com a substância e por meio disso a identificação da polaridade .
Parte Experimental 
Cromatografia I - 
Materiais :
-Becher
-curcumina
-hexano 
-placa de sílica 
-capilar
-espectro UV
-vidro de relógio 
-papel de filtro
 
O experimento iniciou-se com 8 bécher numerados e colocados sobre a bancada.Por meio de um capilar, aplicou-se uma gota de cucumina. A gota quando colocada tem aproximadamente 1 a 3 cm do fim da placa onde possui adsorvente. Ela também deve estar na mesma linha, se fosse calcular o Rf (razão de fracionamento) para ver a diferença entre a distância percorrida pelo solvente e a distância percorrida pelo componente. Preparou-se também o eluente. Para este colocou-se uma quantidade mínima dentro de um bécher de hexano (menos polar). Colocou-se um relógio de vidro em cima do bécher para que houvesse saturação do sistema. 
Já para as placas cromatográficas foram preparadas cortando-se cuidadosamente, com tesoura, tiras de cromato folha de 2,5x5 cm. Foi feita uma linha com lápis na parte inferior (que serviu de base para aplicar a amostra) e superior (para constatar em que momento o eluente alcançaria a região limite de cada placa). Pegou-se 1 bécher e cortou-se com auxílio de uma tesoura, 1 pedaço de papel de filtro baseando-se no tamanho do béquer e deixando um espaço para melhor observação do procedimento. 
Com o uso de um tubo capilar, o extrato é aplicado na parte inferior central da placa, a aproximadamente 0,5 cm da borda inferior. Posteriormente, a placa foi submetida à eluição em béquer contendo o hexano com o auxílio de uma pinça, colocou-se a placa no primeiro béquer e rapidamente fechou-se com um vidro de relógio. Aguardou-se o eluente alcançar a linha superior feita na placa para retirá-la do béquer. Ao ser retirada, a placa foi colocada para secagem e posteriormente inserida em uma Câmara Escura para Análise Ultravioleta. 
Cromatografia II 
Materias:
-coluna
-sílica
-tinta de caneta
-metanol
-becher
 
Primeiramente para que fosse possível o empacotamento da coluna com a sílica sólida ,foi dissolvida a mesma em um bécher com metanol agitando-se com um bastão de vidro e adicionando-se solvente,até atingir maleabilidade suficiente para poder ser manejada e introduzida na coluna .Foi utilizada como coluna cromatográfica uma bureta graduada ,adicionando-se um chumaço de algodão na parte inferior da bureta antes do registro de escoamento ,logo acima do algodão adicionou-se a pasta fluida com o auxílio do bastão de vidro a bureta ,deixando-se escorrer pela parede parede da coluna ,tomando os cuidados necessários para que não se formassem bolhas de ar,nem mesmo a sílica se cristalizasse no interior da coluna.Como foi preciso a adição de bastante solvente até o acondicionamento ideal da sílica no interior da bureta ,o nível da mesma precisou ser ajustado com pequenos toques e torno da coluna .Logo em seguida ao ser adicionado a tinta de caneta preta e metanol formou-se uma divisão bem precisadas cores sobre a coluna nas cores amarela e violeta.
Cromatografia III
Material : Cromatógrafo liquido de alta eficiência PerkinElmer.
A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária(FE).Em seguida,um liquido (fase móvel) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna.Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades.As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente.Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.Ao sair da coluna,os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado ,constituindo um cromatograma.
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Bibliografia 
[1]. B.G. Soares, Química Orgânica. Teoria e Técnicas de Preparação, Purificação e Identificação de Compostos Orgânicos, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1982. 
[2]. Eugênia Cristina Souza Brenelli. Apostila de Química Orgânica Experimental – UFF, 2006. 
[3] Collins, C.H; Braga, G.L e Bonato, P.S. Introdução a métodos cromatográficos 5ª ed. Campinas. Editora da Unicamp, 1993