EXTRAÇAO DO DNA

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA- UNEB
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS EXATAS E DA TERRA
COLEGIADO DE CIENCIAS BIOLOGICAS
COMPONENTE CURRICULAR: BIOTECNOLOGIA
DOCENTE: EMANUEL
DIESCENTES: DIELE GONÇALVES E JUMA GOMES.
RELATÓRIO SOBRE A EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DE DNA DE BACTERIAS
ALAGOINHAS- 2017
INTRODUÇÃO 
 
 Desde que James Watson e Francis Crick propuseram que o material genético era o ácido desoxidorribonucléico – DNA, sendo este uma dupla hélice, constituída por uma estrutura com duas fitas mantidas principalmente por pontes de hidrogênio (GLICK; PASTERNAK, 2003) houve um grande avanço na biologia molecular, ganhando novos espaços e novas formas de conhecimento. A molécula de DNA é considerada o elemento base deste ramo da Biologia, pois neles está todas as informações existentes sobre determinado ser vivo.
 A partir disso, surgiu a engenharia genética que acabou proporcionou a possibilidade de amplificar sequências individuais de DNA, com a reação em cadeia da polimerase, ou PCR (Polimerase Chain Reaction), desenvolvida na década de 1980 (MULLIS; FALOONA, 1987), também foi possível caracterizar as suas propriedades, com a determinação da sequencia de nucleotídeos de precisão pertencente. 
 Na técnica realizada com PCR de extração de DNA, principalmente DNA bacteriano, os processos utilizados visam, em um primeiro passo, a quebra da parede celular. As etapas seguintes a desnaturação da molécula de DNA, a separando de outros componentes celulares, como proteína e organelas, de forma a purificar essa molécula. 
 A realização da reação sequenciado em cadeia da polimerase constitui um método in vitro que aceita a amplificação de sequências específicas de DNA. Segundo MESQUITA, 2001 e SANTOS, 2011, o PC R utiliza-se de desoxinucleotideos como manômeros ate um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substancias.
 Inicialmente faz-se necessário determinar a região do gene que será estudada para a amplificação. Após são desenhados e sintetizados um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) complementares às regiões flanqueadoras da sequência a ser amplificada em cada fita do DNA. Os primers específicos podem ter tamanhos entre 17 a 30 nucleotídeos, teor GC entre 40% e 60%, não sendo auto-complementares entre eles mesmos. 
 Quanto à classificação da cadeia polimerase ela pode acontecer em até três etapas: desnaturação (ocorre quando há separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), anelamento (incide na ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e por fim e extensão ( polimerização propriamente dita).
 A Eletroforese em gel de Agarose é uma técnica que permite a visualização de moléculas de acordo com seu tamanho e carga elétrica (SANDOVAL, 2009). Essa técnica e bastante precisa na realização do procedimento e é bem simples de ser realizada, ainda é muito utilizada entre as técnicas de análise molecular. A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina. 
 O estudo realizado nas bactérias é considerado um fator suplementar permitindo a complexidade da extração do DNA, presente nas diferenças das de composição da parede celular das mesmas. Por isso, os diferentes tipos de protocolos relacionados a extração de DNA precisam levar em consideração a diferença estrutural bacteriana, sobretudo ao esquematizar a estratégia de aquisição de ácidos nucléicos celulares. Logo, diversos procedimentos são descritas no tentamento do alcance de grande quantidade de DNA a partir de bactérias Gram-positivas (G+) e Gram-negativas (G-), com maior ou menor sucesso (NOGUEIRA et al., 2004).
Quando é realizado a comparação de protocolos nas bactérias em relação às características diferentes acaba propondo uma otimização da obtenção do DNA extraído, investigando um protocolo de extração que servirá para ser usada nas bactérias estudadas, sem ocorrer prejuízos á amplificação em PCR, e ao mesmo tempo rápida e eficiente.
Com base nestes conceitos da literatura, foi proposta uma aula prática no intuito de que fossem observados todos os procedimentos relacionados à extração e amplificação do DNA das bactérias. Servindo como fonte geradora de conhecimento para os discentes da disciplina de Biotecnologia, da Universidade do Estado da Bahia- Campus II, Alagoinha-BA. 
OBJETIVO
 Após discussões sobre o assunto de extração e amplificação do DNA na sala de aula, foi proposto pelo professor visita de campo a Universidade de Santa Cruz para extração de DNA e amplificação do mesmo. Promovendo um amadurecimento dos alunos quanto à temática estudada. 
MATERIAS E METODOS
3.1 Para extração do DNA
Foi utilizado tubos de microcentrifuga (1,5 e 2 ml), kit para extração de DNA(Qiagen). Vortex, banho-maria ou estufa, pipetas automáticas, microcentrífugas, proteínas K, etanol (96-100%).
Procedimento: Foi colocado 180/220 mg de amostra da solução em um tubo de 2ml, em seguida foi acrescentado 1,5 ml de tampão ASL a cada amostra e colocado no VORTEX por 1 minuto. A suspensão foi aquecida por 5 minutos a 70ºC, depois voltou para o VORTEX por 15 segundos e a centrifuga a velocidade máxima por 1 minuto. Foi pipetado 1,2 ml do sobrenadante em um novo tubo de 2 ml e descartado o pellet. Acrescentamos um tablete de inibitex em cada uma das amostras do vortexe imediata e continuamente por 1 minuto até que o tablete alcançou a suspensão. Em seguida ela foi incubada por 1 minuto á temperatura ambiente para que os inibidores fossem adsorvidos á matriz inibitex. Em seguida a amostra foi submetida a centrifuga novamente a velocidade máxima de 3 minutos. Em um novo tubo, foi pipetado 1,5 ml do sobrenatante e o pellet foi descartado. Mais uma vez o conteúdo foi centrifugado á máxima de 3 minutos. Em um novo tubo de 1,5 ml foi pipetado 15 microlitros de proteínase K, nele foi acrescentado 200 microlitros do sobrenadante adquirido no inicio do procedimento, para este entrar em contato com a preteinase. ( Falta)
3.2 Para amplificação de DNA ( protocolo para primers V6/V8)
Termociclador, tubos de PCR, PCR Mix, amostras de DNA, recipiente (tipo para sorvete) com gelo, micropipetas automáticas, rack para tubos PCR.
Resultados 
A extração e a purificação de ácidos nucléicos a partir de diversas amostras experimentais (bactérias, fungos, tecidos vegetais e tecidos animais) é uma etapa fundamental para se obter alta eficiência de amplificação nos protocolos que usam a reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica tem sido amplamente empregada em estudos moleculares, em razão da facilidade relativa com que é possível amplificar in vitro regiões específicas do genoma de qualquer organismo. A PCR possibilita a amplificação de seqüências de DNA que estejam presentes em misturas complexas e permite estudos de natureza variada, tais como desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensíveis e específicos, obtenção de grandes quantidades de DNA para seqüenciamento e análises sobre a diversidade genética de populações. Apesar da facilidade de amplificação de DNA possibilitada pela técnica de PCR, existe a necessidade da adequada padronização dos protocolos a serem utilizados em todas as fases dos procedimentos, desde a obtenção do ácido nucléico até a reação de amplificação propriamente dita. O DNA, em sua forma original de dupla fita, apresenta alta estabilidade e é muito resistente e se mantém inalterado em várias condições de meio. No entanto, alguns cuidados são aconselháveis, para que seja evitada a degradação das amostras obtidas em laboratório. A extração de DNA inclui basicamente dois procedimentos principais: a lise das células presentes na amostra e a purificação do DNA. Apósa lise das células, o DNA deve ser separado dos restos celulares e das proteínas, precipitado e suspenso em volume adequado de água ultrapura ou soluções-tampão adequadas. As amostras de DNA podem também ser submetidas a processos de concentração e de purificação, com a finalidade de se obter melhores resultados nas amplificações. Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade. Neste manual apresentam-se, de maneira simples, alguns fundamentos da análise de DNA.