Replicação do DNA

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Replicação de DNAReplicação de DNA
DuplaDupla--hélice composta hélice composta 
de de nucleotídeos ligados nucleotídeos ligados 
entre si entre si e e cujascujas bases bases 
nitrogenadas nitrogenadas de de uma uma 
hélice fazemhélice fazem pontes de pontes de 
hidrogênio hidrogênio com bases com bases 
nitrogenadas nitrogenadas de de outra outra 
hélicehélice, , numa direção numa direção 
antianti--paralelaparalela..
DNADNA
Replicação do DNA
Processo que precede a divisProcesso que precede a divisãão celular e atravo celular e atravéés do qual ss do qual sãão o 
geradas cgeradas cóópias pias ididêênticasnticas das moldas molééculas de DNA presentes culas de DNA presentes 
na cna céélulalula--mmããe, a seguir herdadas pelas duas ce, a seguir herdadas pelas duas céélulaslulas--filhasfilhas
Duplicação dos 
cromossomos
Divisão celular
Separação dos 
cromossomos 
Cada vez que uma Cada vez que uma 
célula divide a célula divide a 
informação informação 
genética precisa genética precisa 
ser transmitida às ser transmitida às 
células filhascélulas filhas
formação de formação de 
gametas para gametas para 
transmissão da transmissão da 
informação informação 
para a próxima para a próxima 
geraçãogeração
Ciclo CelularCiclo Celular
Antes de iniciar a Antes de iniciar a 
condensação dos condensação dos 
cromossomos o DNA cromossomos o DNA 
necessita ser duplicado : necessita ser duplicado : 
é a fase S é a fase S 
ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958
A perguntaA pergunta
Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias 
em meio contendo em meio contendo 
1515NHNH44Cl,Cl,
IsótopoIsótopo pesado de Npesado de N
Transferência para Transferência para 
meio contendo meio contendo 1414NHNH44ClCl
Extração e purificação do DNA Extração e purificação do DNA 
seguida de centrifugação em seguida de centrifugação em 
gradiente de gradiente de CsClCsCl
Molécula parental
Primeira geração de 
moléculas “filhas”
Segunda geração de 
moléculas “filhas”
ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958
A respostaA resposta
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
•• Síntese de DNA é Síntese de DNA é 
semisemi--conservativaconservativa
Fita 1 parental
Fita 2 parental
Fita 1
parental
Fita 2
parental
Fita 2
“filha”
Fita 1
“filha”
ReplicaçãoReplicação do do cromossomocromossomo bacterianobacteriano
ExperimentoExperimento de J. Cairns, 1963de J. Cairns, 1963
Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias 
em meio contendo em meio contendo 
Trítio (Trítio (33H),H), isótopoisótopo
radioativo de Hradioativo de H
Isolamento do DNA, Isolamento do DNA, 
espalhamento em espalhamento em 
emulsão fotográficaemulsão fotográfica
Observação em Observação em 
microscópio eletrônicomicroscópio eletrônico
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
••Começa numa Começa numa 
origem de origem de 
replicação (replicação (OriOri) e é ) e é 
bidirecionalbidirecional
O genoma bacteriano circular constitui um O genoma bacteriano circular constitui um únicoúnico repliconreplicon
•• A velocidade da forquilha de replicação A velocidade da forquilha de replicação 
bacteriana é bacteriana é 50.00050.000 pb/minpb/min
•• Um única origem de replicação em Um única origem de replicação em E.E.colicoli
((OriCOriC, 245 pb), 245 pb)
Forquilha de replicaçãoForquilha de replicação
Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita duplaRegião do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as para as 
novas fitas filhas duplasnovas fitas filhas duplas
O genoma eucariótico possui O genoma eucariótico possui váriosvários repliconsreplicons
•• A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é 2.0002.000 pb/minpb/min
•• Os Os repliconsreplicons eucarióticos tem 40eucarióticos tem 40--100 kb e são iniciados em tempos diferentes100 kb e são iniciados em tempos diferentes
•• Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somáticaFase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
RepliconReplicon
Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicaçãoUnidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
•• Origem + TérminoOrigem + Término
•• Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celularAtivados apenas uma única vez em cada ciclo celular
•• O genoma de uma O genoma de uma célula procarióticacélula procariótica possui um possui um único único repliconreplicon
•• Cada Cada cromossomo eucarióticocromossomo eucariótico possui possui vários vários repliconsreplicons e todos são e todos são 
ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não 
simultaneamentesimultaneamente
Primeiro passoPrimeiro passo: : abrir abrir o DNA (o DNA (forquilha forquilha de de replicaçãoreplicação) e ) e 
manter manter as as fitas separadasfitas separadas
O que dirige a escolha do nucleotídeo a ser adicionado à fita é a 
especificidade A-T/C-G e o alongamento ocorre somente no 
sentido 5’ – 3’, devido à necessidade de um grupamento 3’OH 
livre para formação da ligação fosfodiéster
DNA ou 
iniciador RNA
DNA polimerase
Fita de DNA
molde
DesoxiribonucleosídeoDesoxiribonucleosídeo
5´trifosfato 5´trifosfato 
(substrato)(substrato)
Fita sendo Fita sendo 
polimerizadapolimerizada
Fita moldeFita molde
Síntese da cadeia de DNA envolve a formação Síntese da cadeia de DNA envolve a formação 
das ligações das ligações fosfodiésterfosfodiéster
A ligação fosfodiéster se dá entre o grupamento 3’OH de um 
nucleotídeo já existentes na fita e o grupamento 5’P do 
nucleotídeo livre
iniciador
trifosfato
de guanosina
Fita de DNA molde
Fita de DNA molde
iniciador
Na formação da ligação fosfodiéster é liberado um grupo 
pirofosfato rico em energia
Fita de DNA molde
iniciador
Liberação de pirofosfato
DNA é sintetizado porDNA é sintetizado por DNA DNA 
polimerasespolimerases
•• DNA DNA polimerasepolimerase I foi isolada a I foi isolada a 
partir de E.partir de E.colicoli em 1955 por A. em 1955 por A. 
KornbergKornberg
•• As DNA As DNA polimerasespolimerases necessitam necessitam 
sempre de um sempre de um DNA moldeDNA molde e uma e uma 
sequênciasequência iniciadora.iniciadora.
•• O substrato da síntese é o O substrato da síntese é o 
desoxiribonucleosídeodesoxiribonucleosídeo 5´5´--trifosfato.trifosfato.
•• A síntese de DNA ocorre pela A síntese de DNA ocorre pela 
adição de nucleotídeos aadição de nucleotídeos a
extremidade 3´OHextremidade 3´OH da cadeia em da cadeia em 
crescimento.crescimento.
••Sentido da síntese Sentido da síntese sempre sempre éé
5’ 5’ →→ 3’.3’.
Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas
•• Síntese de DNA procede Síntese de DNA procede 
na direção 5´na direção 5´--3´3´
A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém 
em sentidos opostosem sentidos opostos
DNA parental
Fita contínua 
Fita descontínua 
No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA 
são produzidos ao longo de todo o processo pela são produzidos ao longo de todo o processo pela primaseprimase
Fita contínua 
Fita descontínua
Iniciador Iniciador 
dede RNARNA
Observe o alongamento das duas fitas em sentidos opostosObserve o alongamento das duas fitas em sentidos opostos
Fita contínua 
Fita descontínua
Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são 
chamados de fragmentos de chamados de fragmentos deOkazaki Okazaki e são ligados e são ligados 
enzimaticamente enzimaticamente para gerar uma fita contínuapara gerar uma fita contínua
Fita contínua 
Fita descontínua
Fragmento de
Okazaki
Fita com síntese contínua
Fita com síntese descontínua
Fragmentos de Fragmentos de OkazakiOkazaki::
Bactéria: Bactéria: 1.000 a 2.0001.000 a 2.000 pbpb
EucariotosEucariotos: : 150 a 200150 a 200 pbpb
Síntese de DNA ocorreSíntese de DNA ocorre sempresempre na direçãona direção
5’ 5’ →→ 33’’ e e éé semisemi--descontdescontíínuanua
As subAs sub--unidades Beta da DNAunidades Beta da DNA--polimerasepolimerase envolvem a envolvem a 
dupla hélice formada durante a replicaçãodupla hélice formada durante a replicação
Dupla - hélice
nascente
Sub-unidades beta da Pol
PRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃOPRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃO
DNA polimerase 
DNA polimerase 
proteína ligante 
de DNA
Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli
DnaA Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em sítios 
específicos
DnaB (helicase) Desenrola o DNA
DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem
HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação
Primase (DnaG) Sintetiza os iniciadores de RNA
Single strand binding
(SSB)
Liga a fita simples de DNA
RNA polimerase Facilita a ação da DnaA
DNA girase
(topoisomerase)
Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita
Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC
Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
Pol I Pol II Pol III
Polimerização 5’ → 3’ + + +
Exonuclease 3’ → 5’ + + +
Exonuclease 5’ → 3’ + - -
Número de subunidades 1 ≥4 ≥ 10
Velocidade de 
Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1.000
Processividade 3-200 1.500 ≥ 500.000
(nt adicionados antes
da dissociação da fita-molde)
Reparo (Pol IV e V) Principal enzima de
replicação em E.coli
Atividade exonuclease 5’ → 3’,
responsável pelo processo de remoção dos iniciadores de RNA
A DNAA DNA--polimerasepolimerase III é III é multiméricamultimérica, formada por mais , formada por mais 
de 10 cadeias, com uma simetria de 10 cadeias, com uma simetria diméricadimérica
Fita na qual ocorreFita na qual ocorre
a síntese contínuaa síntese contínua
Fita na qual ocorre aFita na qual ocorre a
síntese descontínuasíntese descontínua
As subAs sub--unidades unidades ττ mantmantéém a m a 
estrutura estrutura dimdimééricarica
6 sub6 sub--unidadesunidades6 sub6 sub--unidadesunidades
IniciaIniciaçãção o -- 11ºº estestáágiogio dada replicareplicaçãçãoo emem E.E.colicoli
Estrutura da origem de replicação bacteriana Estrutura da origem de replicação bacteriana orioriCC
•• A origem de replicação A origem de replicação OriOriCC é é extremamente conservadaextremamente conservada..
•• sequênciassequências repetidas com 9 e 13 bases, repetidas com 9 e 13 bases, ricas em Aricas em A--TT são são 
reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.
•• enriquecidaenriquecida na na sequênciasequência palindrômicapalindrômica GATC, alvo de GATC, alvo de metilaçãometilação
enzimática enzimática na adenina .na adenina .
Origem de Replicação em bactériasOrigem de Replicação em bactérias
Somente origens completamente Somente origens completamente metiladasmetiladas podem iniciar a replicaçãopodem iniciar a replicação
Elongação Elongação -- 22º º estágioestágio dada replicaçãoreplicação
Replicação do DNA Replicação do DNA -- ResumoResumo
• Replicação do DNA é semi-conservativa
• Replicação é bi-direcional.
• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 replicon, 
cromossomos eucariotos possuem vários amplicons.
• O DNA é sintetizado por DNA polimerase, uma enzima multimérica, 
• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ - 3’, com atividade revisora 
3´- 5´.
• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita oposta
• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação, 
elongação e terminação da replicação.
•• Replicação do DNA é semiReplicação do DNA é semi--conservativaconservativa
•• Replicação é biReplicação é bi--direcional.direcional.
•• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 repliconreplicon, , 
cromossomos cromossomos eucariotoseucariotos possuem vários possuem vários ampliconsamplicons..
•• O DNA é sintetizado por DNA O DNA é sintetizado por DNA polimerasepolimerase, uma enzima , uma enzima multiméricamultimérica, , 
•• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ A síntese ocorre sempre no sentido 5´ -- 3’, com atividade revisora 3’, com atividade revisora 
3´3´-- 5´.5´.
•• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opA síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opostaosta
•• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação, Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação, 
elongação e terminação da replicação.elongação e terminação da replicação.
Geometria do pareamento das Geometria do pareamento das 
bases contribui para a fidelidade bases contribui para a fidelidade 
da replicação do DNAda replicação do DNA
Pareamento correto
Pareamento incorreto
TT
AA
CC GG
TT
AA
AA
CC
GG
GG
Atividade revisora (atividade Atividade revisora (atividade exonucleaseexonuclease 3’ 3’ →→ 5’) 5’) 
garante a fidelidade da replicaçãogarante a fidelidade da replicação
ReparoReparo do DNAdo DNA
-- ““Mismatch repairMismatch repair””
-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Baseso de Bases
-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Nucleoto de Nucleotíídeosdeos
-- Reparo DiretoReparo Direto
-- Reparo por RecombinaReparo por Recombinaçãçãoo
““Mismatch repairMismatch repair”” ::
Corrige erros de replicaCorrige erros de replicaçãçãoo
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo por ExcisReparo por Excisãão o 
de Bases:de Bases:
Remove a UracilaRemove a Uracila
(citosina alterada)(citosina alterada)
ReparoReparo do DNAdo DNA
UracilaUracilaCitosinaCitosina
Reparo por Reparo por 
ExcisExcisãão de o de 
NucleotNucleotíídeos :deos :
Remove o Remove o 
nucleotnucleotíídeodeo
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo Direto :Reparo Direto :
NNãão ho háá remoremoçãção de nucleoto de nucleotíídeosdeos
ReparoReparo do DNAdo DNA
Reparo por Reparo por 
RecombinaRecombinaçãção :o :
UsaUsa--se uma outra se uma outra 
molmoléécula de DNA cula de DNA 
ReparoReparo do DNAdo DNA
Célula Célula 
NormalNormal CâncerCâncer
estimaestima--se que 6se que 6--7 eventos devem ocorrer (em ~207 eventos devem ocorrer (em ~20--
40 anos) para indução do câncer 40 anos) para indução do câncer 
em certos casos a propensão ao câncer é hereditáriaem certos casos a propensão ao câncer é hereditária
Recombinação
??constitui na troca ou constitui na troca ou 
incorporação de uma incorporação de uma 
seqüência de DNA com seqüência de DNA com 
(à) outra(à) outra
??na meiose ocorre a na meiose ocorre a 
recombinação homóloga recombinação homóloga 
(troca de trechos)(troca de trechos)
??a recombinação a recombinação 
somática é responsável somática é responsável 
pelo rearranjo de BCR e pelo rearranjo de BCR e 
TCRTCR
??DNA de bactérias e DNA de bactérias e 
virus virus também sofrem também sofrem 
recombinaçãorecombinação
recombinase RecA recombinase RecA e e Rec Rec BCDBCD
recombinação homólogarecombinação homóloga
cadeia leve cadeia leve λλ
cadeia leve cadeia leve κκ
cadeia pesadacadeia pesada
Recombinação SomáticaRecombinação Somática
recombinase recombinase RAG1 e RAG2RAG1 e RAG2
RSS: a regra de recombinaçãoRSS: a regra de recombinação
há a formação há a formação 
de alças durante de alças durante 
o rearranjoo rearranjo
e parte do e parte do 
DNA DNAgenômico genômico é é 
perdidoperdido
Repertório ImunológicoRepertório ImunológicoRepertório Imunológico
EventosEventos
VV
DD
JJ
inserções inserções 
TOTALTOTAL
HH
5151
3030
55
22
κκ + + λλ
6969
00
55
(1)(1)
10101616
ImunoglobulinasImunoglobulinasDNA germinativoDNA germinativo
DNA DNA rearranjadorearranjado
mRNAmRNA maduromaduro
proteínaproteína
A A hipermutaçãohipermutação somática ocorre após a somática ocorre após a 
ativação do linfócito B no centro ativação do linfócito B no centro 
germinativo e leva a maturação por germinativo e leva a maturação por 
afinidade. afinidade. 
taxa de mutação neste processo : 1/1000 taxa de mutação neste processo : 1/1000 
bpbp
(normal : 1/ 10(normal : 1/ 106 6 ou menos)ou menos)
a cada divisão 1/2 linfócitos modificam suaa cada divisão 1/2 linfócitos modificam sua
seqüênciaseqüência
mutação ocorre nas regiões V mutação ocorre nas regiões V rearranjadasrearranjadas
conseqüência da grande proliferação e conseqüência da grande proliferação e hipermutaçãohipermutação
na fase após infecção de uma bactéria pode ocorrer a 
recombinação (integração) do DNA do fago no DNA da bactéria 
Ciclo de vida de um bacteriófago lambdaCiclo de vida de um bacteriófago lambda
na fase após infecção de uma bactéria ocorre a recombinação 
(integração) sítio-específica (att) do DNA do fago no DNA da 
bactéria 
Há replicação do DNA do fago, formação de novas 
partículas e o ciclo de fecha 
os fagos permanecem dentro das bactérias e assim 
podem ser usados para formar bibliotecas de DNA