Cromatografia Apostila aula de biofísica UFPE

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TÉCNICAS DE PURIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO
DE COMPOSTOS ORGÂNICOS 
CROMATOGRAFIA
 
·        Efetua a separação, identificação e quantificação de compostos orgânicos
Separação – distribuição dos componentes da mistura em duas fases, que estão em contato
  Uma fase permanece estacionária, outra fase move-se através dela 
 cada um dos componentes da mistura é seletivamente retido pela fase estacionária.
 
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CROMATOGRAFIA
Histórico
M. TSWEET (1903): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
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CROMATOGRAFIA - Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
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Classificação:
 
a)     Considerando a forma física do sistema de cromatografia (TIPO DE SUPORTE), define-se a técnica geral:
·      Cromatografia planar – A fase estacionária disposta sobre uma superfície plana.
·	Cromatografia em coluna - A fase estacionária colocada em tubo cilíndrico.
 
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b)     Considerando o estado físico da fase móvel:
Cromatografia gasosa
A fase móvel é um gás. 
Permite a separação de substâncias volatilizáveis.
Cromatografia líquida 
A fase móvel é um líquido. 
Separa componentes (espécies iónicas, macromoléculas, constituintes termolábeis, …) de soluções líquidas.
 Cromatografia em Fluido supercrítico - A fase móvel é um fluido supercrítico.
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c)     Considerando a polaridade relativa das fases:
Cromatografia gasosa – a fase móvel é um gás inerte e a separação ocorre devido as interações das moléculas da amostra com a fase estacionária.
Cromatografia líquida – a polaridade de ambas as fases é importante:
-Cromatografia líquida com fase normal quando a fase estacionária é mais polar que a fase móvel;
Ex: Sílica, alumina, substâncias polares quimicamente ligadas, tendo como grupos funcionais cadeias com terminações do tipo ciano, diol, nitro , amino.
Cromatografia com fase reversa quando se tem o inverso, ou seja, a fase móvel é mais polar e a fase estacionária é mais apolar. 
Ex:Substâncias polares quimicamente ligadas, tendo como grupos funcionais cadeias com terminações apolares (fenil e N-aquil – C18, C8 e C4).
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Fase normal : Sílica – SiO2.xH2O
												 Si-OH – grupo silanol
					
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Fase reversa: Sílica de fase ligada
Reação do grupo silanol:
Com um álcool – forma éster silicato; 
Com organoclorossilano – forma ligação siloxano;
Com cloreto de tionila, seguido de reação com organometálico – forma ligação silício –carbono (sílica diretamente ligada a um grupo carbônico)
Si-OH + ROH SiOR + H2O
Si-OH + RSiCl  Si-O-SiR
Si-OH + SiCl2  SiCl + HCl +SO2
SiCl + LiR  Si-R + LiCl
		
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d) Considerando o modo de separação
Adsorção - interações electrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás).
Partição - diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (fluido).
Troca Iônica - diferentes tendências dos componentes iónicos ou ionizados permutarem com íons da fase estacionária, que, assim, são deslocados para a fase móvel.
Exclusão - separa os componentes segundo o tamanho efetivo das moléculas.
Bioafinidade -  ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. 
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e) Objetivo da Separação
- Analítica 
- Preparativa
f) Composição da Fase Móvel
- Isocrática (Composição constante)
- Gradiente (Composição variável)
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD
 
- Separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.  Adsorção.
  Método prático e rápido
·        Placa cromatográfica/Escolha da fase móvel
·   Separação pela diferença de partição dos componentes químicos em duas fases: Fase estacionária (alumina – Al2O3 ou SiO2.xH20) e Fase móvel (solvente de eluição)
·        Câmara cromatográfica
·        Semeio da amostra na placa cromatográfica
·        Corrida do solvente (Solubilidade/Eluição)
·        Revelação do cromatograma / Rf
 
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CCD - exemplos
Requerimento da amostra::
detectável no cromatograma
solúvel na FM
estável à luz, oxigênio, solvente, não ser volátil
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Os adsorventes:
Sílica (SiO2) – alto poder adsorvente – muito polar.
 Alumina (Al2O3)
Terra diatomácea – Adsorvente neutro. Pouco usada. Para separações por partição. Adicionada à sílica para diminuir seu poder adsorvente.
 Celulose
Poliamida – maior dificuldade em se aderir ao suporte
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
 (ADSORÇÃO)
- Usa-se uma coluna recheada com um 
sólido (fase estacionária) e uma fase móvel líquida.
 Adsorção - refere-se a um aumento da concentração do material (que está em excesso na fase móvel) entre as superfícies das fases móvel e estacionária
 
·        A Coluna
·      Escolha do Eluente – Em função da CCD, baixo ponto de ebulição, série eluotrópica; Monitoramento - CCD
·        Enchimento da Coluna
·        Eluição
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Processo de adsorção na coluna:
A atividade cromatográfica do sólido, tendo grupos polares, aumenta sobre substâncias polares;
Ativação dos adsorventes: aquecimento para dessorção da água e de outros materiais adsorvidos.
Escolha dos eluentes: 
Funções da fase móvel na cromatografia por adsorção:
- Realizar sua função de solvente, solubilizando os componentes da amostra;
-  - Realizar o desenvolvimento dos componentes da mistura na coluna;
- -  Dessorver os componentes do adsorvente  eluição.
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	CROMATOGRAFIA GASOSA
 SEPARAÇÃO DE COMPONENTES VAPORIZADOS;
COMBINAÇÃO DOS PRINCÍPIOS DE PARTIÇÃO, ADSORÇÃO E VOLATILIDADE;
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO:
 – MESMOS DE OUTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA
 _ DIFERENTE NA MECÂNICA COMO AS SEPARAÇÕES OCORREM.
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CROMATOGRAFIA GASOSA
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
Para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás.
DE FORMA GERAL:
	CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC	e que sejam termicamente estáveis.
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O Cromatógrafo a Gás
1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
Observação: em vermelho: temperatura controlada
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INSTRUMENTAÇÃO – Gás de arraste
Fonte de gás de arraste em cilindro de alta pressão;
Gases usados: Hélio, nitrogênio, hidrogênio ou argônio;
Fatores de escolha: disponibilidade, pureza exigida, consumo, tipo de detector empregado;
Reguladores de pressão/Medidores de vazão – controlam e monitoram o escoamento do gás;
Cromatografia convencional – nitrogênio;
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INSTRUMENTAÇÃO - Parâmetros de Injeção
TEMPERATURA DO INJETOR - Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra
Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
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INSTRUMENTAÇÃO
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
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INSTRUMENTAÇÃO - Colunas - Fase estacionária
Colunas – Material : sílica fundida, vidro pirex, aço
inox, nylon, cobre.
Cromatografia gás –sólido: Fase estacionária é um sólido: polímeros porosos, carvão grafitinizado, sílica, alumina.
Cromatografia gás-liquido: Fase estacionária é um líquido: Líquidos poliméricos - polímeros de polietilenoglicol ou polissiloxano (silicones), não voláteis,
Com recheio – colunas empacotadas (  2 a 4 mm; comp =0,5 a 10m);
Sem recheio – Filmes poliméricos – colunas capilares. – T até 450°C. (  0,1 a 0,5 mm; comp = 5 a 100m);
 Suporte inerte – Terra diatomácea, Teflon 
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Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:
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INSTRUMENTAÇÃO - Temperatura da Coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0).
ANALITO ELUI MAIS RAPIDA-MENTE (MENOR RETENÇÃO)
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INSTRUMENTAÇÃO - Colunas: Definições Básicas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com um filme fino (fra-ção de  m) de FE líquida ou sólida
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INSTRUMENTAÇÃO - Temperatura da Coluna
TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG
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INSTRUMENTAÇÃO - Programação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
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INSTRUMENTAÇÃO
Programação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
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FATORES QUE AFETAM A RESOLUÇÃO:
Cromatograma ideal: Picos separados e simétricos;
Temperatura da coluna: Programação da temperatura - Evita picos tardios, melhora a separação;
T   P°   tR
Tamanho da coluna: varia em função da(s) substância(s) a ser(em) analisada(s)  Picos assimétricos;
Colunas empacotadas -  Pressão do gás de arraste;
Colunas capilares - facilitam o fluxo;
Fluxo de gás -  Velocidade   Dispersão (independe da interação)
Volume da injeção -  Volume  Picos largos, picos assimétricos;
Natureza da Fase estacionária  sobreposição de picos.
Ruído: linha de base; 
Pico detectado  Mínimo: h = 2x ou + o ruído.
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INSTRUMENTAÇÃO - Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo =
CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
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INSTRUMENTAÇÃO- Detectores
Mais Importantes:
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Detector por ionização de chamas
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DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas
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Registradores:
Análise Qualitativa (Identificação) - A identificação pode ser feita comparando-se o tempo de retenção de um padrão com o da amostra. 
Análise Quantitativa - Após obtenção do cromatograma, faz-se a integração dos sinais, que tem por finalidade transformar a intensidade do sinal emitido pelo detector em uma medida relacionada com a quantidade da substância analisada na amostra. A integração dos sinais pode ser feita usando-se os seguintes métodos: 
Altura do Pico ou Área do Pico
 
A = a x wb	 %A = área A x 100 	 
 2 		 	área total	
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ANÁLISE QUALITATIVA
Tempos de Retenção
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
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ANÁLISE QUALITATIVA - ESPECTROMETRIA DE MASSAS
3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:
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ANÁLISE QUALITATIVA - Espectrômetro de Massas
1 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético.
2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm).
3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento.
4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento.
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CH3OH + e  CH3OH (m/e 32) + 2e
CH3OH  CH2OH+ (m/e 31) + H.
CH3OH  CH3+ (m/e15) + .OH
CH2OH+  CHO+ (m/e 29) + H2
 
ANÁLISE QUALITATIVA - ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Fragmentações da molécula do metanol:
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O Espectro de Massas
m/z = 90
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