Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral

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Avaliação da Aplicação de 
Biomarcadores Salivares no 
Contexto do Diagnóstico 
Precoce do Cancro Oral 
Artigo de Revisão Bibliográfica 
 
MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA DENTÁRIA 
 
 João Cabral Morgado 
 
 
 
Porto, 2015 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
I 
 
 
 
 
MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA DENTÁRIA 
ARTIGO DE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 
 
“AVALIAÇÃO DA APLICAÇÃO DE BIOMARCADORES SALIVARES NO 
CONTEXTO DO DIAGNÓSTICO PRECOCE DO CANCRO ORAL” 
 
JOÃO CABRAL MORGADO 
Estudante do 5º ano do Mestrado Integrado em Medicina Dentária 
mimd09002@fmd.up.pt 
 
Monografia apresentada à Faculdade de Medicina Dentária da 
Universidade do Porto no âmbito da UC “Monografia de Investigação ou 
Relatório de Atividade Clínica” 
 
Orientador 
João Miguel Silva e Costa Rodrigues 
Professor Auxiliar Convidado com Agregação da Faculdade de Medicina 
Dentária da Universidade do Porto 
 
Co-Orientador 
 
Maria Helena Raposo Fernandes 
Professora Catedrática da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do 
Porto 
 
 
 
Porto, 2015 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
II 
 
Resumo 
 
 O desenvolvimento de novas ferramentas na área biomédica tem permitido 
estudar diferentes formas de diagnosticar precocemente o desenvolvimento do 
cancro oral. Tendo aumentado a incidência desta patologia ao longo dos 
últimos anos, de carácter invasivo e com rápida progressão e, passando 
maioritariamente despercebida ao exame clínico em estadios muito iniciais do 
seu desenvolvimento, tornou-se imperativo a criação de meios complementares 
de diagnóstico mais rápidos, preditivos, informativos e com níveis de 
especificidade e sensibilidade aceitáveis para detetar estas lesões em fases 
precoces da sua evolução. Neste contexto, têm sido estudados alguns 
componentes salivares como proteínas e elementos genéticos, avaliando o seu 
potencial e aplicabilidade como biomarcadores tumorais em lesões pré-
malignas ou potencialmente malignas como, por exemplo, as leucoplasias 
orais. Deste modo, o diagnóstico e intervenção médica numa etapa primária 
da patologia, possibilitará o acesso a mais opções de tratamento e, 
consequentemente, a maior sucesso terapêutico reduzindo significativamente a 
taxa de mortalidade. 
 Como meio de pesquisa foram consultados variados artigos científicos 
indexados à base de dados online Pubmed® e alguma literatura disponível. 
 
Palavras-chave: “cancro oral”, “proteinas salivares”, “biomarcadores”, 
“carcinoma oral escamoso”, “saliva”, “leucoplasia oral”, “microRNA”, “ lesão pré-
maligna”, “diagnóstico”, “displasia”. 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
III 
 
Abstract 
 
 The development of new tools in the biomedical field is allowing the study 
of different ways to early diagnose the development of oral cancer. Having an 
increased incidence of this disease over the past years, and due to its invasive 
nature and fast progression, well as the fact that it is largely unnoticed by the 
clinical examination in very early stages of its development, it has turned 
imperative to create faster complementary diagnostics, predictive, informative 
and with acceptable levels of specificity and sensitivity to detect these lesions at 
early stages of development. In this context, has been studied some salivary 
components such as proteins and genetic elements are being studied to 
evaluate their potential and applicability in pre-malignant tumors as well on 
potentially malignant lesions, for example, oral leukoplakia. Thus, diagnosis and 
medical intervention in a primary level of the disease may enable access to 
more treatment options providing in this way, more successful treatments which 
will reduce mortality rate. 
 As a mean of research were consulted several scientific articles indexed to 
the online database Pubmed® and some available literature. 
 
Keywords: “oral cancer”, “salivary proteins”, “biomarkers”, “oral squamous 
carcinoma”, “saliva”, “oral leukoplakia”, “microRNA”, “pre-malignant lesion”, 
“diagnosis”, “dysplasia”. 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
IV 
 
Agradecimentos 
 
 
 
Ao meu orientador, 
o Professor Dr. João Rodrigues, dirijo o meu enorme reconhecimento por toda 
a paciência, atenção, disponibilidade, ajuda e orientação que me concedeu no 
decorrer da realização deste trabalho, 
 
À minha família, 
em especial á minha avó Helena Morais, à minha mãe Helena Cabral e ao meu 
irmão Rui Morgado pelo apoio incondicional que me deram na luta pela 
concretização dos meus objectivos e por estarem sempre presentes em todos 
os momentos da minha vida, 
 
 
 
 Á minha cara-metade, 
 
Tânia Pereira, por toda a força, compreensão e carinho que sempre me 
transmitiu, 
 
 
 
Aos meus amigos, 
especialmente à Mariana Silva e à Ana Torres, que ao longo do meu percurso 
académico sempre demonstraram a sua grande amizade para comigo, por todo 
o apoio que me deram nos momentos mais dificeis e pelas gargalhadas que 
me proporcionaram. 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
V 
 
Índice 
 
 
 
1. Introdução.................................................................................................2 
2. Materiais e Métodos..................................................................................5 
3. Biofluído Salivar........................................................................................6 
4. Identificação de um Biomarcador.............................................................9 
5. Micro-RNAs como Biomarcadores no Cancro Oral................................11 
 5.1. Deteção de Lesões Orais Potencialmente Malignas.......................14 
6. Actina e Miosina como Biomarcadores em Lesões Pré-Malignas e 
Malignas.......................................................................................................20 
7. DNA Mitocondrial como Biomarcador em Lesões Orais Pré-malignas e 
Malignas.......................................................................................................25
8. Conclusão................................................................................................30 
 9. Referências Bibliográficas........................................................................31 
 10. Anexos......................................................................................................34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
VI 
 
Índice de Tabelas 
 
 
Tabela I - Fluídos biológicos utilizados como ferramenta de estudo nos 
diversos tipos de cancro......................................................................................6 
Tabela II - Componentes salivares com potencial de diagnóstico......................7 
Tabela III - Mecanismos que determinam a presença de marcadores 
genotípicos e fenotípicos na saliva......................................................................8 
Tabela IV -Expressão de alguns miRNAs em amostras salivares de indivíduos 
portadores de leucoplasia oral com progressão maligna e sem progressão 
maligna em comparação com o observado em amostras salivares de indivíduos 
saudáveis...........................................................................................................18Tabela V- Dados estatísticos sobre os níveis médios de Cox I e Cox II 
identificados em meio salivar no grupo controlo e no grupo com carcinoma 
oral.....................................................................................................................27 
Tabela VI- Comparação estatística entre os níveis de Cox I e Cox II salivar em 
estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do carcinoma oral.....................27 
Tabela VII – Correlação entre os níveis de Cox I e Cox II identificados na saliva 
e no tecido do tumor primário............................................................................29 
 
 
Índice de Figuras 
 
Fig.1 - Métodos de investigação que permitem o estudo e a identificação de 
novos biomarcadores cancerígenos.................................................................10 
Fig.2 - Estadios da transformação cancerígena de uma lesão do ponto de vista 
histológico..........................................................................................................15 
Fig.3 - Cortes histológicos da evolução de uma leucoplasia oral até à formação 
de um carcinoma de células escamosas..........................................................15 
Fig.4 - Nível relativo de expressão salivar de alguns miRNAs em 3 grupos de 
estudo (controlo, leucoplasias não progressivas e leucoplasias 
progressivas).....................................................................................................17 
Fig.5 - Relação entre o aumento da expressão de mIR-181b, mIR-21 e mIR-
345 com o grau de transformação maligna de uma lesão oral........................19 
Fig.6 - Diagramas de caixa com os dados obtidos da análise dos níveis 
relativos de actina e miosina encontrados em lesões orais pré-malignas e 
malignas.............................................................................................................22 
Fig.7 - Percentagem de expressão de CapG por imunoreação nas diversas 
amostras estudadas...........................................................................................23 
Fig.8 – DNA mitocondrial.............................................................................,....25 
Fig.9 - Diagrama de Pontos com a dispersão de valores registados para os 
níveis de Cox I salivar nos estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do 
desenvolvimento de carcinoma oral..................................................................28 
Fig.10 - Diagrama de Pontos com a dispersão de valores registados para os 
níveis de Cox II salivar nos estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do 
desenvolvimento de carcinoma oral..................................................................28 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
VII 
 
 
Lista de Abreviaturas 
 
 
o Atc-Atg – Anticorpo-Antigénio 
o ATP – (Adenosine triphosphate) – Trifosfato de adenosina 
o cDNA – (complementary DNA) - DNA complementar 
o CapG – (gelsolin-like actin-capping protein) – Proteína de ligação à actina. 
o Cox I - Citocromo c oxidase I 
o Cox II – Citocromo c oxidase II 
o DNA – (Deoxyribonucleic acid) - Ácido desoxirribonucleico 
o HIV – (Human Immunodeficiency Virus) – Vírus da Imunodeficiência 
Humana 
 HIV-1 – Tipo 1 
 HIV-2 – Tipo 2 
o mRNA – (messenger RNA) - RNA mensageiro 
o miRNA – micro-RNA 
o mtDNA – (mitochondrial DNA) - DNA mitocondrial 
o non-pro-LK – (non-progressive leukoplakia) – Leucoplasia sem progressão 
maligna 
o NIH – National Institutes of Health 
o OPL – (Oral premalignant lesion) – Lesão oral pré-maligna 
o OSCC – (Oral squamous cell carcinoma) – Carcinoma Oral Escamoso 
o pro-LK – (progressive leukoplakia)- Leucoplasia com progressão maligna 
o PCR – (Polymerase Chain Reaction)- Reação de Polimerização em Cadeia 
o RNA – (Ribonucleic acid) - Ácido ribonucleico 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
2 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
 O cancro oral é uma condição definida pela Classificação Internacional de 
Doenças como o conjunto de neoplasias malignas que acometem qualquer 
região da cavidade oral, desde os lábios à garganta, incluíndo as amígdalas e a 
faringe. Mais de 90% destes tumores são designados de carcinomas, afetando 
predominantemente o epitélio da mucosa oral. Os restantes estão associados a 
outras formas mais raras de tumores, como é o caso dos linfomas, sarcomas e 
melanomas. Adicionalmente, algumas neoplasias sistémicas como as que 
ocorrem no pulmão ou mama, por exemplo, apresentam um elevado potencial 
de metastização para a mandíbula, pelo que o papel do Médico Dentista se 
demonstra essencial e priveligiado no diagnóstico desta condição. Atualmente, 
o cancro oral encontra-se associado a elevados índices de mortalidade que se 
devem, sobretudo, a um diagnóstico tardio devido a fatores associados quer ao 
paciente, quer à sensibilidade do Médico Dentista na deteção e diagnóstico 
destas lesões, bem como factores relacionados com a especificidade clínica 
deste grupo de patologias. De acordo com alguns dados estatísticos 
disponíveis, podemos constatar que o carcinoma da cabeça e do pescoço é o 
sexto (6º) tipo de cancro mais comum e prevalente em todo o mundo, 
correspondendo a aproximadamente 2,8% de todos os cancros detetados. Este 
tipo de tumores tem maior incidência em indivíduos do sexo masculino, no 
grupo etário acima dos 45 anos de idade, aumentando consideravelmente a 
partir dos 65 anos. Como principais fatores de risco apontados para o 
desenvolvimento desta condição patológica, podem ser citados alguns hábitos 
como o alcoolismo e o tabagismo. Ambos possuem um efeito carcinogénico 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
3 
 
marcado sobre as células epiteliais da mucosa oral, levando a transformações 
celulares e tecidulares como são o caso das displasias, hiperplasias, 
ulcerações e outras atipias celulares. Deste modo, é estimado que 8 em cada 
10 doentes diagnosticados com cancro oral consumam ou tenham consumido 
tabaco, tendo estes indivíduos um risco acrescido (5 a 7 vezes superior) de 
virem a desenvolver esta patologia quando comparados com os não 
fumadores. [1] 
 Apesar dos avanços conseguidos nos últimos anos no que concerne ao 
diagnóstico e tratamento do cancro oral, este continua a demonstrar uma taxa 
de mortalidade bastante elevada, sendo que 6 em cada 10 doentes portadores 
desta condição patológica morrem nos 5 anos seguintes após a data do seu 
diagnóstico. Este insucesso prende-se como já foi referido anteriormente com 
um diagnóstico pouco precoce. Para contrariar esta tendência há que 
sensibilizar os pacientes para uma ida periódica ao Médico Dentista, pelo 
menos uma ou duas vezes por ano, bem como criar rastreios para a promoção 
da saúde oral, e desenvolver ferramentas de diagnóstico mais eficazes.[2] 
 Segundo o National Institutes of Health (NIH), um biomarcador é um 
indicador avaliado e quantificado, presente em mecanismos biológicos normais, 
estando patentes também em processos patológicos ou através da resposta 
farmacológica a uma terapêutica instituida. Através destas entidades, é 
possível obter informação sobre o estado fisiológico de um organismo vivo. 
Desta forma, os biomarcadores são considerados ferramentas valiosas na 
deteção, avaliação do risco, diagnóstico, prognóstico e monitorização de uma 
doença. Um biomarcador pode apresentar-se de diversas formas tais como 
anticorpos, microrganismos, DNA, RNA, lípidos, metabolitos ou proteínas.[3] 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do DiagnósticoPrecoce do Cancro Oral 
4 
 
 Diversos estudos têm demonstrado que a saliva possui diversos 
compostos moleculares e microbianos bastante indicativos do desenvolvimento 
de patologias locais e sistémicas. Na sua composição 99% é água, 0,3% 
proteínas e 0,2% substâncias inorgâncias. É um biofluido heterogéneo com um 
pH levemente ácido (6.0-7.0). Além das muitas funções desempenhadas pela 
saliva, esta contém inúmeras vantagens na sua utilização como potencial fonte 
de biomarcadores quando comparada com o sangue, nomeadamente no seu 
processo de recolha/colheita que é um processo não invasivo, não doloroso, de 
fácil aplicação a quase todos os indivíduos em exames médicos que requeiram 
a extração salivar. Adicionalmente, as amostras salivares são mais facilmente 
manuseadas e armazenadas, não coagulam (como o sangue), é um 
procedimento económico e pode ser efetuado por qualquer pessoa, 
inclusivamente por auto-colheita. [3] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5 
 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 
 A Pubmed® foi a base de dados online selecionada para pesquisar os 
artigos de interesse para a realização desta revisão bibligráfica. Como critérios 
de inclusão foram validados os artigos publicados ao longo dos últimos 10 anos 
que estabelecessem ligação entre a presença de lesões orais pré-malignas e 
malignas e a aplicação de biomarcadores salivares no seu diagnóstico precoce. 
Numa segunda fase da pesquisa, a procura da informação foi direcionada de 
forma mais específica aos biomarcadores que neste trabalho são abordados 
mais detalhadamente. Outras fontes de informação foram consultadas tais 
como livros e trabalhos académicos abordando tópicos de interesse bem como 
artigos publicados online pela revista de Medicina Dentária “Journal of 
Dentistry”. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
6 
 
 
3. BIOFLUÍDO SALIVAR 
 
 
 O estudo de biomarcadores presentes nos fluídos orgânicos (saliva, 
plasma sanguíneo, sémen e urina) de pacientes portadores de patologia 
neoplásica bem como a sua aplicação para estabelecimento de um diagnóstico 
clínico, tem-se revelado bastante útil e promissor pois revela a capacidade de 
se poder identificar a partir destes a presença de alterações neoplásicas e, 
sobretudo, de modo pouco ou mesmo não invansivo. A utilização destes 
componentes com o intuito de detetar e diagnosticar precocemente lesões 
neoplásicas surge, também, como uma alternativa à técnica da biópsia, que 
constitui uma abordagem mais invasiva.[4] 
 
 
Tabela I – Fluídos biológicos utilizados como ferramenta de estudo nos 
diversos tipos de cancro. (Kulasingam, 2008)[5] 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
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 Atualmente, tendo em conta a tecnologia disponível, é possível obter 
diversa informação clínica quanto ao estado de saúde oral e sistémica de um 
indivíduo através da análise e avaliação de determinados componentes 
biológicos presentes no fluído salivar. Como exemplo, já conseguiram ser 
identificados em meio salivar uma quantidade considerável de analitos, desde 
hormonas esteróides a anticorpos contra o HIV[6,7]. Desta forma, a saliva 
apresenta-se como um biofluído com um elevado potencial de diagnóstico para 
inúmeras condições patológicas, de entre as quais se podem destacar as 
infeções provocadas pelos agentes víricos HIV-1, HIV-2, vírus da Hepatite A, B 
e C.[8] 
 
 
Tabela II – Componentes salivares com potencial de diagnóstico. 
(Sandhu et al., 2011) [7] 
 
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8 
 
 
 A Tabela III a seguir apresentada resume o conjunto de mecanismos que 
conduzem ao aparecimento de marcadores biológicos na saliva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Marcadores Genéticos e Proteicos em Meio Salivar 
De Origem Plasmática De Origem Local 
 
o Secreção Salivar 
o Difusão Passiva 
o Transporte Activo 
o Ultrafiltração ao nível das Junções 
Celulares 
o Fluído Crevicular 
 
o Lise e Necrose Celulares 
o Apoptose 
o Factores Traumáticos 
o Secreção Celular Activa 
Tabela III – Mecanismos que determinam a presença de marcadores genotípicos e 
fenotípicos na saliva. (Markopoulos et al., 2010) 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
9 
 
4. IDENTIFICAÇÃO DE UM BIOMARCADOR 
 
 
 A aplicação na prática clínica de biomarcadores salivares como ferramenta 
de diagnóstico precoce, isto é, para detetar uma lesão neoplásica de forma 
atempada e que permita ao profissional estabelecer um quadro clínico correto e 
assertivo com vista a oferecer ao paciente uma terapêutica mais ajustada e 
com maior probabilidade de sucesso, exige que sejam desenvolvidos os meios 
que permitam conhecer os marcadores específicos para a patologia em 
questão. Assim sendo, estão atualmente em prática duas importantes correntes 
de investigação nesta área, a proteómica e a genómica que estudam 
respetivamente a utilização de proteinas e componentes genéticos salivares 
como biomarcadores de interesse.[8,9] Estas análises têm por base a 
interpretação inicial da expressão de uma proteina e do mRNA, para que se 
possa observar as suas variações e inferir sobre a sua relevância para 
determinar estados de saúde ou de patologia. Ambos os marcadores proteicos 
e genéticos são úteis no fornecimento de informação, embora os proteicos, 
sendo produtos finais de expressão genética têm maior potencial informativo 
quanto ao efeito e progressão da doença.[10] Independentemente do tipo de 
biomarcador que utilizemos, para este apresentar validade em termos de 
diagnóstico deve cumprir um conjunto de pré-requisitos, entre os quais: 
elevada especificidade e sensibilidade, fácil aplicação, capacidade de ser 
incluido em protocolos estandardizados e ser informativo sobre os seus 
resultados para o clínico.[11] 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
10 
 
 Para a deteção de biomarcadores proteicos, existem alguns métodos 
conhecidos à disposição, entre os quais se podem destacar técnicas de 
imunofluorescência, em que se associa um antigénio sinalizado com 
fluorescência a um anticorpo formando um complexo (Atc-Atg), que ao ligar-se 
à proteina de interesse, emite um sinal luminoso detetável. Outras alternativas 
passam pelo uso da espectrometria de massa ou pela técnica de eletroforese 
em gel de agarose. [12] Na análise que permite determinar o nível de expressão 
dos genes salivares, poder-se-à recorrer à técnica de microarrays, técnica de 
PCR (reação de polimerização em cadeia) aplicando a transcriptase reversa, 
assim como a análise de DNA complementar (cDNA). [13] 
 
 
 
 
Figura 1 – Métodos de investigação que permitem o estudo e a identificação de novos 
biomarcadores cancerígenos. (Kulasingam, 2008) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
11 
 
5. MICRO-RNAS COMO BIOMARCADORES NO CANCRO ORAL 
 
 
 De uma forma genérica, os micro-RNAs (miRNAs) constituem uma 
subclasse de pequenos RNA não codificantes que podem possuir em média 
cadeias de 18 a 25 nucleótidos de extensão. Estes elementos participam na 
regulação da expressãogénica através da sua ligação e afinidade a mRNAs 
(RNAs mensageiros) específicos. Intervêm não só em processos 
fisiológicos, mas também em processos patológicos como no caso da 
carcinogénese, através de mecanismos de regulação da tradução de 
oncogenes e genes supressores tumorais. De acordo com estudos 
desenvolvidos e publicados ao longo dos últimos anos, tem-se vindo a 
constatar o seu papel nos processos de proliferação celular, diferenciação 
e regulação da apoptose. Desta forma, sabe-se que estes componentes 
genéticos vão ser capazes de regular e controlar a tradução proteica 
promovendo a degradação dos mRNA alvo. Em adição, segundo 
Vasudevan et al., 2007 é conhecido um grupo considerável de micro-RNAs 
que vão estimular a tradução de mRNAs quando determinados requisitos e 
condições celulares estejam reunidos.[14] 
 No que respeita ao cancro oral, foi demonstrado que os miRNAs 
controlam tanto o seu processo de proliferação celular (Selcuklu et al., 
2009) como o seu mecanismo de apoptose celular (Wong et al., 2008). 
Além disso, consoante o tipo de tecido celular em que se encontra, pode 
apresentar alterações no que concerne ao seu armazenamento ou grau de 
expressão (Jiang et al., 2005). Quanto à sua deteção no fluído salivar, esta 
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12 
 
é possível pois os miRNAs podem passar diretamente para a saliva a partir 
do microambiente tumoral local ou, por outro lado, contidos em vesículas 
exossomais a partir da lesão tumoral, as quais impedem a sua degradação 
enzimática pelas RNAses ao longo do transporte extracelular (Valadi et 
al.,2007; Palanisamy et al.,2010). Em tumores distantes, a saliva constitui 
também um bom meio para se isolar os miRNAs tumorais pois estes são 
enviados para a corrente sanguínea que por sua vez os conduz para as 
glândulas salivares, sendo posteriormente enviados para o meio salivar 
através dos ácinos. Os miRNAs devem ser encarados como oncogenes 
quando a sua expressão estiver manifestamente aumentada num dado 
tumor e sempre que este aumento se traduza num 
aceleramento/progressão do processo carcinogénico. Estes micro-RNAs 
oncogénicos promovem o desenvolvimento tumoral intervindo de 2 formas: 
inibição de genes supressores tumorais ou inibição de genes que controlam 
a diferenciação celular ou apoptose.[15,16,17] 
 No caso do carcinoma oral de células escamosas, estão envolvidos 
determinados tipos específicos de miRNAs, entre os quais o miR-125a, o 
miR-200a e o miR-31, sendo que os dois primeiros são observados em 
níveis mais baixos e o último com expressão acentuada nesta condição 
patológica (Park et al.,2009; Liu et al.,2010). A sobreexpressão de mIR-31 
na saliva está patente inclusivamente em pequenos tumores e pode ser 
detetada em todos os estadios clínicos em pacientes portadores de 
carcinoma oral. Em comparação com outros fluidos orgânicos como o 
plasma sanguíneo, verificou-se que é um biomarcador com maior 
sensibilidade para o diagnóstico de condições orais malignas pois está 
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13 
 
presente de forma mais abudante na saliva que no plasma. Foi possível 
notar igualmente que a quantidade de mIR-31 na saliva diminuiu 
significativamente após recorrer à cirurgia de excisão do carcinoma, o que 
sugere que a sua expressão é regulada essencialmente pelos tecidos 
tumorais.[10,13] Segundo testes levados a cabo por Momen-Heravi et al., 
foram avaliados mais de 700 tipos de miRNAs de amostras salivares de 
indivíduos portadores de carcinoma oral, em que 13 desses estavam 
diferencialmente expressos em comparação com grupos controlo que não 
possuiam a referida patologia. Nos 13 miRNAs com alteração da sua 
expressão, 11 deles estavam inativos e os restantes 2 estavam 
significativamente expressos ( miRNA-24, miRNA-27b).[18] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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5.1. DETEÇÃO DE LESÕES ORAIS POTENCIALMENTE MALIGNAS 
 
 
 De entre as neoplasias malignas mais conhecidas e que afetam a região 
da cabeça e pescoço podemos referenciar o carcinoma oral de células 
escamosas, conhecido por causar uma marcada morbilidade e de 
características agressivas. Aproximadamente 16 a 62% destes carcinomas 
desenvolvem-se a partir de lesões consideradas potencialmente malignas 
como é o caso das eritroplasias e das leucoplasias[19]. As eritroplasias 
apresentam-se clinicamente segundo um padrão avermelhado enquanto que 
nas leucoplasias este padrão é esbranquiçado.[19] Normalmente a avaliação do 
risco de progressão, isto é, de malignização de uma leucoplasia da cavidade 
oral, é estabelecido por observação clínica por parte do Médico Dentista e 
através de testes histopatológicos ao material biopsado. Para caracterizar o 
grau de alteração morfológica de um tecido, ou seja, o grau de displasia celular 
numa dada lesão, podemos categorizar segundo quatro estadios por ordem 
crescente de atipia, e são estes: Displasia Epitelial de Grau Baixo, Displasia 
Epitelial de Grau Moderado, Displasia Epitelial de Grau Elevado e Carcinoma in 
Situ. Estas duas últimas formas são as que constituem maior risco de progredir 
para patologia invasiva (metastização), por outro lado, as displasias de baixo 
grau podem manter-se estáveis durante anos ou até mesmo desaparecer. No 
entanto, uma pequena proporção delas evolui para carcinoma. 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
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 Num estudo levado a cabo por Yang et al com o propósito de compreender 
a importância dos miRNAs salivares como biomarcadores no processo de 
transformação maligna de leucoplasias orais, recorreu-se à análise de 
Figura 2 – Estadios da transformação cancerígena de uma lesão do ponto de vista histológico. 
Mucosa Normal, Hiperplasia (aumento do número celular), Displasia (alteração da arquitetura tecidular), 
Carcinoma in Situ e Carcinoma Invasivo (metastização), respetivamente. (Franky et al., 2011) 
Figura 3 – Cortes histológicos da evolução de uma leucoplasia oral até à formação de um 
carcinoma de células escamosas. (A) Displasia epitelial de baixo grau; (B) Displasia epitelial de 
grau moderado; (C) Displasia epitelial de alto grau; (D) Carcinoma In Situ; (E) Carcinoma de 
células escamosas invasivo. (Yang et al., 2013) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
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leucoplasias com displasia de baixo grau e com diagnóstico histopatológico 
similar, porém com aspectos clínicos diferenciados. Foram classificadas em 
dois subgrupos: leucoplasias com transformação maligna e sem transformação 
maligna. Para tal, foi utilizada uma amostra inicial de 45 pacientes com 
diagnóstico de leucoplasia com displasia de baixo grau. Desta amostra, 10 
pacientes desenvolveram carcinoma in situ ou carcinoma de células 
escamosas após uma média de cerca de 30,1 meses da determinação do 
diagnóstico inicial, sendo 2 destes afastados do estudo por fraca qualidade do 
RNA obtido. Dos restantes 35 que não desenvolveram carcinoma, 12 foram 
excluídos do estudo por ocorrência de novas lesões e outros 5 também foram 
excluídos devido à fraca qualidade do RNA obtido. Dos 8 indivíduos restantes 
que desenvolveram carcinoma, 7 deles que permaneceram entre 3-5 anos em 
observação clínica com displasia de baixo grau foram selecionados parase 
identificar as diferenças ocorridas na expressão de miRNA com as respetivas 
lesões pré-malignas. Igualmente foram colhidas amostras salivares de 7 
controlos saudáveis para aferir a expressão normal de miRNA salivar. Para 
avaliar a expressão de miRNA foram escolhidos 8 marcadores (mIR-10b, mIR-
145, mIR-99b, mIR-708, mIR-181c, mIR-30e, mIR-660 e mIR-197) cuja 
produção se encontra significativamente alterada em leucoplasias com 
transformação maligna em comparação com aquelas que não apresentaram 
transformação. Constatou-se que o mIR-10b, mIR-660, mIR-708 e o mIR-30e 
estavam marcadamente expressos em leucoplasias com transformação 
maligna, antagonicamente o mIR-145, mIR-99b, mIR-181c e o mIR-197 
encontravam-se menos ativos neste tipo patológico.[20] 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
17 
 
 
 
 Foi ainda possivel de acordo com os dados obtidos sobre os miRNAs 
constantes nas amostras salivares dos indivíduos com lesão oral pré-maligna 
(leucoplasia), que a sua expressão era diferenciada comparativamente à das 
amostras tecidulares recolhidas. Verificou-se então que estes miRNAs afetados 
estavam presentes na saliva embora em quantidades muito mais baixas, 
contudo com padrões de diferenciação concordantes com os das amostras 
tecidulares.[20] Em seguida é apresentada uma tabela (Tabela III) que regista as 
alterações encontradas ao nível da expressão dos respetivos marcadores de 
miRNA nas duas formas leucoplásicas. 
Figura 4 – Nível relativo de expressão salivar de alguns miRNAs em 3 grupos de estudo: grupo controlo – sem 
patologia (control); grupo de pacientes com leucoplasia sem progressão maligna (non-pro-LK); grupo de 
pacientes com leucoplasia de progressão maligna (pro-LK). (Yang et al., 2013) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
18 
 
 
 
 
 
 
 De acordo com Cervigne et al, existem 3 marcadores de micro-RNA que 
estão fortemente associados com o aumento do grau de malignidade de uma 
lesão, e são estes: mIR-181b, mIR-21 e mIR-345. (Vêr Figura 5, página 18) 
 
 
 
 
Leucoplasias com progressão 
maligna 
Leucoplasias sem progressão 
maligna 
 
miRNAs com expressão 
aumentada (+) 
 mIR-10b 
 mIR-708 
 mIR-30e 
 mIR-660 
 mIR-19a 
 mIR-26a 
 mIR-181c 
 mIR-197 
 mIR-99a/b 
 mIR-145 
 
miRNAs com expressão 
diminuida (-) 
 mIR-99b 
 mIR-197 
 mIR-145 
 mIR-181c 
 mIR-708 
 mIR-181c 
Tabela IV – Expressão de alguns miRNAs em amostras salivares de indivíduos portadores de leucoplasia 
oral com progressão maligna e sem progressão maligna em comparação com o observado em amostras 
salivares de indivíduos saudáveis. (Yang et al., 2013) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 – Relação entre o aumento da expressão de mIR-181b, mIR-21 e mIR-345 com o 
grau de transformação maligna de uma lesão oral. (NP: amostras sem progressão maligna 
da lesão, seguindo-se amostras com progressão maligna da lesão em diferentes estadios de 
displasia celular (Queratose, Displasia Ligeira, Displasia Moderada, Displasia Severa e 
Carcinoma Oral Escamoso). (Cervigne et al., 2009) 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
20 
 
6. ACTINA E MIOSINA COMO BIOMARCADORES EM LESÕES PRÉ-
MALIGNAS E MALIGNAS 
 
 
 Existem atualmente diversos tipos de componentes proteicos estudados 
com o objetivo de no futuro poderem vir a ser validados e aplicados como 
marcadores de células tumorais. Entre estes estão a miosina e a actina, 
proteínas estas de origem intra-celular que apresentam uma estreita ligação do 
ponto de vista funcional na célula. Estas duas proteínas integram os filamentos 
que compõem o citosqueleto celular, estrutura que confere a forma/morfologia 
da própria célula, participa da manutenção das junções celulares bem como de 
todos os seus movimentos. Deste modo, a actina e a miosina são consideradas 
proteinas-chave nos processos de motilidade e invasão celulares.[21,22] 
 Num estudo publicado em 2010 por De Jones et al., este apresentou a 
miosina e a actina como biomarcadores salivares promissores na deteção 
específica de lesões orais pré-malignas e malignas. Como metodologia de 
investigação, recolheram 12 amostras salivares de indivíduos portadores de 
lesões orais pré-malignas e outras 12 de indivíduos com lesões orais malignas. 
Os valores de sensibilidade e especificidade para diferenciar estes dois 
estadios lesionais foram respetivamente 100% e 75% (p=0,002) para a actina e 
de 67% e 83% para a miosina (p<0.0001). A actina e a miosina foram passíveis 
de serem detetadas no fluído salivar uma vez que a identificação de células 
epiteliais exfoliadas da cavidade oral, mais especificamente provenientes do 
local da lesão, também foram encontradas na saliva. A predominância destas 
células epiteliais em meio salivar é explicada pelo fato de toda a saliva em 
contato direto com a lesão oral levar a um aumento da probabilidade de serem 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
21 
 
detetadas proteínas provenientes quer de lesões orais pré-malignas ou 
malignas. Assim, os autores partiram do pressuposto que as alterações na 
expressão destas duas proteínas na saliva poderiam estar associadas à 
progressão do grau de malignização das referidas lesões, sendo que a 
quantidade relativa destas duas proteínas nas células epiteliais exfoliadas 
presentes na saliva poderia refletir o que ocorre ao nível celular no local da 
lesão. Efetivamente o que foi observado neste estudo foi que ambas as 
proteínas, actina e miosina, aumentaram de forma clara as suas quantidades 
comparativamente com os seus níveis normalizados, sendo que o aumento foi 
mais significativo nas lesões orais malignas do que nas lesões pré-malignas. 
Estes resultados permitiram aos investigadores concluir que o que ocorre na 
saliva para a miosina e a actina é uma consequência direta do que se verifica 
nas células afetadas da lesão. Foi ainda referido no estudo que não foi 
registado qualquer aumento do número de células epiteliais exfoliadas na 
saliva de indivíduos com lesões malignas em comparação com as da saliva de 
indivíduos com lesões orais pré-malignas.[23] (Figura 6) 
 Outros estudos publicados suportam os resultados obtidos por De Jong et 
al. mencionando um expressivo aumento na quantidade de isoformas de actina 
em experiências in vitro para observar o processo de migração de células 
tumorais, tal como em carcinomas de células escamosas invasivos da cavidade 
oral.[24,25] 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
22 
 
 
 
 
 
 No caso da actina, a sua função é regulada por uma proteína da família 
das gelsolinas, a CapG, que está presente principalmente ao nível do citosol e 
das mitocôndrias. Sendo uma proteína de ligação à actina, vai interferir na 
organização desta ao nível dos filamentos do citosqueleto, o que se repercutirá 
nas funções celulares em que intervém o citosqueleto.[26] Existem no entanto 
evidências do papel oncogénico da CapG indicando o seu envolvimento no 
controlo da migração e invasão celulares.[27] Para comparar a expressão de 
CapG presente entre lesões orais pré-malignas com a existente em OSCCs, 
Nomura etal., recolheu amostras tecidulares tanto de leucoplasias como de 
Figura 6 – Diagramas de caixa com os dados obtidos da análise dos níveis relativos de 
actina e miosina encontrados em lesões orais pré-malignas e malignas. (A)- Níveis 
relativos de actina observados na saliva; (B) – Níveis relativos de miosina observados na 
saliva; (C) – Níveis relativos de actina detetados nas células afetadas pela lesão; (D)- Níveis de 
miosina detetados nas células afetadas pela lesão. (De Jong et al., 2010) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
23 
 
carcinomas orais. Aplicando a técnica de imunohistoquímica, observou-se uma 
expressão aumentada desta proteína em 52% dos casos de carcinoma oral no 
estadio primário e em 64% dos casos de leucoplasia oral nas respetivas 
amostras. Como fator de calibração foram ainda obtidas amostras tecidulares 
de mucosa oral normal que revelaram quantidades mínimas ou mesmo 
ausência total de expressão de CapG, sendo estas consideradas CapG-
negativas.[28] 
 
 
 
 Analisando os dados da figura 7, conclui-se que a expressão de CapG é 
significativamente mais elevada nas amostras de tecido tumoral com 
estadiamento mais avançado (T3 e T4) comparativamente ao observado nas 
amostras de tecidos procedentes de lesões orais pré-malignas, neste caso, de 
leucoplasias.[28] Apesar de neste estudo as amostras não serem de origem 
salivar mas de origem tecidular e decorrente de não terem sido encontrados 
Figura 7 – Percentagem de expressão de CapG por imunoreação nas diversas 
amostras estudadas. OPLs: Lesões orais pré-malignas; OSCCs: Carcinoma oral de 
células escamosas (Estadios – T1, T2, T3 e T4). (Nomura et al., 2008) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
24 
 
estudos que abordassem a expressão desta proteína no meio salivar, seria 
importante investigar a existência da CapG na saliva e, no caso da sua 
identificação neste fluído, verificar se a expressão salivar traduz o 
comportamento observado nos tecidos afetados com vista à sua validação 
como novo biomarcador salivar tumoral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
25 
 
7. DNA MITOCONDRIAL COMO BIOMARCADOR EM LESÕES ORAIS 
PRÉ-MALIGNAS E MALIGNAS 
 
 As mitocôndrias são componentes celulares que produzem e fornecem a 
energia necessária para que possam ocorrer os processos que permitem a 
manutenção das funções da própria célula. É por intermédio de um conjunto de 
reações de fosforilação oxidativa que é principalmente gerado o ATP 
necessário ao funcionamento dos mecanismos celulares. Num estudo 
publicado (Porporato et al.,2014), foi demonstrado que o processo de 
fosforilação oxidativa intervém na regulação da transformação cancerígena.[29] 
O sistema de reações que 
permite a fosforilação oxidativa 
encontra-se distribuído em 5 
complexos proteicos (I-V), 
sendo que alguns dos seus 
componentes são codificados 
pelo mtDNA.[30] Este DNA 
mitocondrial consiste numa 
molécula de 16.5 kb, de dupla 
cadeia e com apresentação 
circular, sendo que é transmitido apenas por via materna. Algumas mutações 
ao nível deste DNA como, por exemplo, deleções génicas ou diferenças quanto 
ao número de cópias está relacionado com o aparecimento de diversos tipos 
de cancro. Por norma, a disfunção mitocondrial está presente em tumores 
agressivos e de rápida progressão.[31,32] 
Figura 8 – DNA mitocondrial (Phillips et al.,2014) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
26 
 
 O DNA mitocondrial é passível de ser identificado e isolado em amostras 
de fluídos biológicos nomeadamente a partir da saliva.[33] Tendo em conta este 
facto, existem estudos que procuraram correlacionar a sua presença na saliva 
com o desenvolvimento de carcinoma oral escamoso. De acordo com dados 
apresentados, foram detetadas células exfoliadas em meio salivar provenientes 
de epitélio de carcinoma oral de células escamosas através de mutações no 
DNA mitocondrial.[34,35] Observou-se, entretanto, que este DNA mitocondrial 
mutado estava patente em 46% de todos os tumores de cabeça e pescoço e 
em 67% dos casos de carcinoma oral de células escamosas diagnosticados a 
partir de amostras salivares.[33] 
 Noutra investigação, foram submetidos a estudo 2 genes específicos do 
mtDNA, nomeadamente o Cox I e Cox II (genes que codificam para a citocromo 
c oxidase I e II respetivamente) por técnica de quantificação em PCR. Para tal 
foram recolhidas amostras salivares de 94 indivíduos com quadro de carcinoma 
oral de células escamosas e, em seguida, foi estabelecido um grupo controlo 
de 656 indivíduos sem a referida patologia. O que se assistiu foi a um aumento 
notório dos níveis médios de Cox I e Cox II nas amostras salivares dos 
pacientes portadores de carcinoma, como se pode confirmar pelos resultados a 
seguir representados na Tabela IV .[36] 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
27 
 
 
 
 Quando se comparou a quantidade de mtDNA salivar expresso com a 
evolução do estadiamento tumoral, isto é, numa fase inicial e avançada do 
desenvolvimento cancerígeno, o que se pode constatar foi que o DNA 
mitocondrial (Cox I e Cox II ) aumentou consideravelmente a sua expressão na 
saliva com o aumento do grau de transformação maligna da lesão.[36] 
(Observar resultados na Tabela V) 
 
 
 
Grupo com Carcinoma Oral 
em Estadio Inicial 
(Estadios I e II) 
Grupo com Carcinoma Oral 
em Estadio Avançado 
(Estadios III e IV) 
 
Níveis médios de Cox I 
0,048 
[0,03-0,07]; IC=95% 
þ = 0,03 
0,086 
[0,07-0,11]; IC=95% 
þ = 0,03 
 
Níveis médios de Cox II 
0,029 
[0,02-0,04]; IC=95% 
þ = 0,04 
0,063 
[0,05-0,08]; IC=95% 
þ = 0,04 
 
 
Grupo com Carcinoma 
Oral 
Grupo 
Controlo 
 
Níveis médios de Cox I 
0,076 
[0,06-0,09]; IC=95% 
þ < 0,0001 
0,054 
[0,05-0,06]; IC=95% 
þ < 0,0001 
 
 Níveis médios de Cox II 
0,055 
[0,04-0,07]; IC=95% 
þ < 0,0001 
0,046 
[0,04-0,05]; IC=95% 
þ < 0,0001 
IC: Intervalo de Confiança; þ: nível mínimo de significância 
Tabela V - (Jiang et al., 2005) 
IC: Intervalo de Confiança; þ: nível mínimo de significância 
Tabela VI – (Jiang et al., 2005) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
28 
 
 
 
Figura 10 – Diagrama de Pontos com a dispersão de 
valores registados para os níveis de Cox II salivar nos 
estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do 
desenvolvimento de carcinoma oral (Jiang et al., 2005) 
Figura 9 – Diagrama de Pontos com a dispersão de 
valores registados para os níveis de Cox I salivar nos 
estadios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) do 
desenvolvimento de carcinoma oral (Jiang et al., 2005) 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
29 
 
 Tendo em conta os dados disponibilizados por este estudo, pode-se 
facilmente perceber a existência de uma relação clara entre o grau de 
desenvolvimento tumoral e o nível de expressão de mtDNA encontrado na 
saliva. Para determinar o grau de relação entre os níveis de mtDNA (Cox I e II) 
encontrados na saliva e no tecido do tumor primário, Jiang et al. aplicou o testede correlação de Pearson, teste este que mede a força de associação entre 2 
variáveis. Os resultados obtidos demonstraram a presença de uma correlação 
positiva aceitável entre a quantidade de mtDNA registado na saliva e no tecido 
do tumor primário, traduzidos pelos valores apresentados na Tabela VI.[36] 
 
 
 
Teste de Pearson 
Correlação entre os níveis 
identificados na saliva e no tecido 
do tumor primário 
 
Cox I 
r = 0,30 
 
þ = 0,005 
 
Cox II 
r = 0,33 
 
þ = 0,002 
 
 
 
 
 
Tabela VII – (Jiang et al., 2005) 
r : coeficiente de correlação de Pearson ( r = 1: correlação perfeita; 0 < r <1: correlação positiva; 
r = 0: correlação nula; -1 < r < 0: correlação negativa); þ: nível mínimo de significância 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
30 
 
8. CONCLUSÃO 
 
 O diagnóstico atempado do cancro oral resulta de um conjunto de fatores, 
alguns deles alheios ao próprio Médico Dentista. Atualmente, sabe-se que 
cerca de 60% dos pacientes com cancro oral morrem ao fim de 5 anos após 
este diagnóstico.[2] Segundo a American Cancer Society, se estes tumores 
fossem detetados em estadios iniciais do seu desenvolvimento, a taxa de 
sobrevivência a 5 anos poderia aumentar até 83%.[37] Como tal, é importante 
dar continuidade ao estudo de novas técnicas de diagnóstico que permitam 
obter resultados cada vez mais informativos e confiáveis. Neste trabalho foi 
avaliada a aplicação de três tipos diferentes de marcadores salivares, o caso 
dos miRNAs da classe dos RNAs, a miosina/actina e a CapG da classe das 
proteínas bem como o mtDNA da classe dos DNAs, sendo que os resultados 
associados a cada um deles são, de um modo geral, bastante promissores. 
 A aplicação de biomarcadores salivares na deteção precoce do cancro oral 
assume deste modo um papel fulcral no prognóstico desta condição patológica. 
Assim, seria de enorme utilidade a sua implementação regular na área da 
Medicina Dentária associada à técnica convencional da biópsia para uma maior 
asserção e confiança nos diagnósticos elaborados. Apesar de algumas 
limitações atuais, é de prever que num futuro próximo com a evolução da 
biotecnologia médica, possam vir a ser aplicados como único método não-
invasivo de diagnóstico do cancro oral em substituição da biópsia. 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
31 
 
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
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31. V. Gogvadze, B. Zhivotovsky, S. Orrenius. The Warburg effect and 
mitochondrial stability in cancer cells. Mol. Aspects Med. 31 (1) (2010) 60-
74. 
32. Gisbergen MW, Voets AM, Starmans MHW, Coo IFM, Yadak R, Hoffmann 
RF, Boutros PC, Smeets HJM, Dubois L, Lambin P. How do changes in the 
mtDNA and mitochondrial dysfunction influence cancer and cancer therapy? 
Challenges, opportunities and models. Mutation Research 764 (2015) 16-30. 
33. Fliss, MS, Usadel H, Caballero OL, Wu L, Buta MR, Eleff SM, Jen J, 
Sidransky D. Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and 
bodily fluids. Science, 2000. 
34. Prasad RB, Sharma A, Babu HM. An insight into salivary markers in oral 
cancer. Dent Res J (Isfahan). 2013 May-Jun; 10(3): 287-295. 
35. Markopoulos AK, Michailidou EZ, Tzimagiorgis G. Salivary markers for oral 
cancer detection. The Open Dent J. 2010; 4:171-8. 
36. Jiang W, Masayesva B, Zahurak M, Carvalho AL, Rosenbaum E, Mambo E, 
Zhou S, Minhas K, Benoit N, Westra WH, Alberg A, Sidransky D, Koch W, 
Califano J. Increased Mitochondrial DNA Content in Saliva Associated with 
Head and Neck Cancer. Clin Cancer Res, April 2005 11;2486. 
37. American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2015. Atlanta: American 
Cancer Society; 2015. 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
34 
 
10. ANEXOS 
 
I. Declaração de Autoria do Trabalho Apresentado 
II. Parecer do Orientador 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
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ANEXO I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
36 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
37 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANEXO II 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação da Aplicação de Biomarcadores Salivares no Contexto do Diagnóstico Precoce do Cancro Oral 
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