Técnicas Moleculares Aplicadas ao Diagnóstico de Doenças Infecciosas

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Técnicas moleculares aplicadas ao diagnóstico de doenças infecciosas
Marli Matiko Anraku de Campos
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1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de restrição, ferramentas essenciais para a manipulação in vitro do DNA.
importância para o isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA para a clonagem in vivo (técnicas de DNA recombinante descritas por Berg em 1972)
Southern blotting - 1975 – localização de genes e estudo de doenças genéticas
1977 – sequenciamento – identificação de alterações específicas de DNA
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1987 – Kary Mullis – PCR
técnica de hibridização do tipo dot ou blot, Southern e Northern, e hibridização in situ; técnicas de amplificação de alvos-específicos como a PCR, PCR competitiva, PCR-transcriptase reversa (RT-PCR) e a PCR em tempo-real; métodos de amplificação de sinal, como por exemplo branched DNA (bDNA); tecnologia de arrays.
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Na área de doenças infecciosas, a detecção rápida de microrganismos de crescimento lento, ou daqueles não cultiváveis, se torna possível através das técnicas de biologia Molecular
 Determinação de resistência antimicrobiana,
 no monitoramento de doenças através da quantificação da infecção e em estudos epidemiológicos
Testes moleculares mais comumente empregados são: os de avaliação de carga
 viral para HIV e hepatite C
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1995, foi introduzida por Schena e colaboradores outra tecnologia baseada na amplificação de sinal, a tecnologia de microarrays.
São lâminas com uma alta densidade de seqüências de DNA que permitem estudos de níveis de expressão gênica, analisando-se uma grande quantidade de genes ao mesmo tempo, utilizando sondas de cDNA.
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PCR
Entre as principais técnicas resultantes de
 modificações da reação em cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randômicos e PCR em tempo
real.
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RT-PCR utiliza uma enzima chamada
 transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação por PCR, permitindo estudo de vírus de RNA e análises de expressão gênica. 
O nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificação com um par de primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do método.
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PCR multiplex é uma reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas seqüências-alvo numa mesma amostra.
PCR a partir de primers randômicos utiliza seqüências curtas de oligonucleotídeos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico e é bastante empregado em estudos epidemiológicos.
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PCR em tempo real permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência. Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.
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técnicas descritas para escrutínio de mutações de ponto em fragmentos de DNA:
– DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis); – SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism); – HA (Heteroduplex Analysis); – CSGE (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis).
Baseiam na clivagem de bases não pareadas em heteroduplexes: CCM – Chemical Cleavage Method e EMC – Enzyme Mismatch Cleavage
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DGGE
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detecção de alterações na proteína transcrita por um determinado fragmento de DNA (PTT – Protein Truncation Test).
análise de heteroduplexes é a DHPLC (Denaturing high-performance liquid chromatography)
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Tuberculose
Sondas genéticas Accuprobe – hibridizam DNA E RNA ribossomal
PCR – Amplicor, 	EMTD, AMTD
Amplicor RNA 16S (primer marcado com biotina)
EMTD – amostras BAAR negativas
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Micobactérias não tuberculosas
PRA (Restriction Enzyme Analysis): consiste na amplificação por PCR de um fragmento de 439 pb do gene hsp65.
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Chlamydia trachomatis
Padrão ouro: cultura em linhagens de células McCoy (80% sensibilidade)
PCR – material endocervical em mulheres e urina primeiro jato homens (91% sensibilidade e 100% especificidade) – importância vital para pacientes assintomáticos, que são a maioria
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TOXOPLASMOSE
Pesquisa de IgG e IgM, 
IgA e IgE de fase aguda
Pesistência de IgM por anos, problemas de interpretação na gestação, infecções congênitas e imunossuprimidos, tornam a sorologia um recurso que exige melhor especificidade para o diagnóstico;
PCR – 1 a 10 parasitas na amostra, diagnóstico de infecção congênita em líquido amniótico, pesquisa em sítios não habituais (pulmão, liquor, etc.)
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Vírus HPV
Vírus DNA
PCR melhor sensibilidade e especificidade
Coleta de material por pessoal especializado, escovado na região suspeita, manter amostra a -20°C
PCR e RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) – classifica o grupo viral e determina o genótipo encontrado na amostra
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Meningites virais
Painel multiplex viral (métodos in house)
Enterovírus e Herpes simples – PCR = padrão ouro
Dispensa biópsia cerebral
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Infecção hospitalar
Fonte de infecção: ambiental ou pessoal
Resistência bacteriana:
Staphylococcus aureus produtor de gene MecA, resistente a meticilina
Enterococcus resistente a vancomicina (VRE) genes Van-a, Van-b, Van-c
Bactérias gram-negativas produtoras de beta-lactamase (ESBL) – real time PCR
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Polimorfismo do HIV
Azul - Mudança de AA
Verde - Mudança Silenciosa
Amarelo - Bases variáveis