Estudo Dirigido de Técnicas Moleculares

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Bruna Luiza Gomes Lopes da Silva 
Biomedicina 2020.2 
Biofísica 2 
Estudo Dirigido: Técnicas Moleculares 
1- Quais são os reagentes que devem ser adicionados aos microtubos? 
A enzima DNA polimerase, didesoxinucleotídeo trifosfato (ddNTPs), DNA molde a 
ser sequenciado (com primer marcado radioativamente) e desoxinucleotídeo 
trifosfato (dNTPs). 
2- Qual a modificação química que deve ser introduzida na desoxirribose para 
que a síntese de DNA seja interrompida? 
A retirada do oxigênio do carbono 3’ da desoxirribose. Isso interrompe a síntese, pois 
para que ela ocorra, deve haver uma hidroxila nesse carbono 3’. A molécula então 
fica truncada. 
3- Por que se utiliza os dNTPs (dioxinuclídeos) e ddNTPs (dideoxinuclídeos) com 
três fosfatos? 
Eles são utilizados com 3 fosfatos porque 2 desses fosfatos serão usados para geração 
de energia. Já o outro fosfato se liga com a hidroxila do carbono 3’ do próximo 
nucleotídeo, formando a ligação fosfo-diéster. 
4- Como é possível saber qual a base nitrogenada que cada fragmento de DNA 
termina? 
É possível saber qual a base que cada fragmento de DNA irá terminar, pois, antes do 
processo de sequenciamento iniciar, as didesoxis são coradas, cada uma com uma cor 
diferente. 
5- Por que se utilizam 4 poços no gel de eletroforese? 
Porque como a molécula a ser sequenciada é o DNA, cada poço corresponderá a uma 
base nitrogenada diferente (A, T, C e G), utilizando um ddNTP diferente para cada. 
6- Escreva a sequência do DNA sintetizado (tente fazer você mesmo, sem ver a 
resposta, até acertar), que corre no sentido 5' para o sentido 3'. 
TAAGCGCACTGTG. 
7- Escreva a sequência do DNA molde, que corre no sentido 3' para o 5', que é a 
fita que se desejou sequenciar (tente fazer você mesmo, sem ver a resposta, até 
acertar). 
ATTCGCGTGACAC. 
 
8- Por que a leitura das sequências no gel é feita de baixo para cima? 
Porque a sequência obtida no gel da eletroforese é do DNA complementar, e não do 
DNA molde, como desejado. A cadeia do DNA complementar cresce de 5’ para 3’. O 
5’ está na parte de baixo, e por isso a leitura é feita de baixo para cima. 
9- Por que a primeira sequência de bases lida a partir do gel é a fita 
complementar, e os fragmentos estão no gel indo de baixo para cima no sentido 
5' para o 3'? (pode mostrar um esquema!). 
Porque, como os fragmentos menores de DNA descem o gel mais rapidamente, eles 
ficam no fim do gel, representando as posições de nucleotídeos mais perto do primer 
(5’). Dessa forma, a leitura é feita de baixo (5’) para cima (3’). Como é nessa ordem, 
essa seria a fita complementar. 
 
10- Como se encontra então a sequência da fita molde, que corre no sentido 3' 
para o 5'? (pode mostrar um esquema!). 
A sequência da fita complementar complementa a fita molde. 
 
11- Sanger inventou a técnica de sequenciamento do DNA praticamente a partir 
do zero, e talvez deva ser considerado o grande gênio técnico da história da 
biologia molecular, abrindo uma nova era da genética que resultou no Projeto 
Genoma Humano. Pesquise e comente pelo menos uma descoberta a partir do 
sequenciamento de DNA que, na sua opinião, trouxe uma mudança de 
paradigmas para a Biologia e/ou Biomedicina. 
O sequenciamento de DNA permitiu aos cientistas estudar melhor todos os seres 
vivos e seus genomas. Esse método pode ser bastante importante para identificar 
doenças genéticas e encontrar tratamentos eficazes para elas. 
12- Sobre a técnica de PCR, uma pergunta: é preciso "purificar" a amostra 
coletada, por exemplo, separar o vírus das células humanas por técnicas 
específicas (por exemplo, ultra-centrifugação), para poder amplificar o genoma 
do vírus? 
Sim, pois é necessário retirar moléculas presentes nas células humanas que podem 
contaminar o vírus, a fim de estudar melhor o genoma viral. 
13- Sobre os Imunoensaios, é preciso que a pessoa esteja com 'sinais clínicos e 
sintomas', para poder realizar a detecção dos anticorpos específicos para agente 
biológico investigado? 
Não necessariamente. Um exemplo atual é a infecção por covid-19, no qual a pessoa 
pode portar o vírus, mas sem apresentar nenhum sintoma, ou seja, sendo um caso 
assintomático. Nesse caso, a pessoa produz os anticorpos para tratar essa infecção, 
mas não possui sinais clínicos e sintomas dela. 
14- Entre no site do NCBI (Link anexado abaixo), selecione Nucleotide, e 
procure pelo genoma do SARS-COV-2. Mostre um "print" da sequência de 
nucleotídeos (não precisa ser inteira) do genoma do coronavírus.