Determinação de colinesterase em sangue

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS 
 
 
Relatório de Ecotoxicologia 
 
Experimento II 
Determinação de colinesterase em sangue 
 
 
 
 
Alunos: Matrícula: 
Jussara Ferreira Mesquita 2015.1.13.041 
Levy Bueno Alves 2015.1.13.031 
Rosângela Gonçalves 2015.1.13.034 
 
Profª. Eduardo Costa Figueiredo 
 
 
 
 
 
Alfenas, 20 de Setembro de 2017 
 
Introdução 
 
As colinesterases são enzimas do grupo das hidrolases que possuem a função de 
catalisar a hidrolise da acetilcolina e outras colinas. Há dois tipos de enzimas designadas 
colinesterases: a acetilcolinesterase e a pseudocolinesterase. Enquanto as acetilcolinesterases 
predominam nos eritrócitos, neurônios, glânglios do sistema nervoso autônomo e em placas 
motoras terminais, as pseudocolinesterases encontram-se predominantemente no plasma, 
fígado, músculo liso e adipócitos. 
 Os inseticidas organofosforados, organoclorados e/ou carbamatos têm propriedades de 
inibição destas enzimas. De acordo a OPAS/OAMS, 1996, os inseticidas organofosforados são 
inibidores da colinesterase e responsáveis pela maioria das mortes por intoxicação no Brasil. 
Estes são absorvidos pela pele, por ingestão ou por inalação. A inibição da enzima colinesterase, 
principalmente acetilcolinesterase, provoca o aumento da concentração da acetilcolina nas 
sinapses nervosas e desencadeia efeitos parassimpáticos. 
 A colinesterase pode sofre alterações como a diminuição de sua concentração basal em 
pessoas que são expostas constantemente a esses inseticidas. E, como esse tipo de enzima 
também está presente no sangue e igualmente inibida, a determinação da atividade de 
colinesterase no sangue é de grande importância para a verificação do grau de exposição a 
inseticidas organofosforados e carbonatos. 
 Devido ao vasto emprego destes compostos, grande número de pessoas estão 
ocupacionalmente expostas. Segundo Soares (2003), a exposição por agrotóxicos pode levar a 
problemas respiratórios, como bronquite asmática, distúrbios, gastrointestinais, musculares, 
debilidade motora, fraqueza. E ainda, segundo Faria et. Al. (1996), pessoas que tiveram 
intoxicação aguda por organofosforado, moderada, raras e leves apresentam sequelas 
neuropsicológicas. 
 
Objetivo 
 
 Determinar através de reagentes a atividade da colinesterase no sangue em amostras 
de sangue total (St) e plasma (Pl) por espectrometria. 
 
Métodos 
 
Para a determinação de colinesterase em sangue existe dois métodos que são mais 
amplamente utilizados. Os métodos utilizados baseiam-se na medida da velocidade de hidrólise 
da acetilcolina pelas acetilcolinesterases. O método Colorimétrico, se baseia na variação do pH 
do meio de reação, pelo ácido acético liberado na hidrólise da acetilcolina pela enzima 
colinesterase, que é verificada através do indicador azul de bromotimol, assumindo diferentes 
colorações em função da atividade enzimática, e o Método Espectrofotométrico, conhecido como 
método de Ellman et al, é baseado na medida colorimétrica da velocidade de hidrólise da 
acetilcolina pelas colinesterases sanguíneas - a tiocolina liberada reage com o ácido 5,5-
ditiobis(2-nitrobenzóico) (DTNB) liberando um composto de cor amarela que é quantificado pelo 
espectrofotômetro. 
Nessa prática foi adotado o método de Ellman e foram utilizadas técnicas para 
mensuração do sangue total e do plasma para a avaliação da amostra de sangue. Na técnica 
para sangue total, pipetou-se 9,0 ml de tampão fosfato de pH 7,4 em um tubo de ensaio de 15 
ml e adicionou-se 10 µL de sangue total e homogeneizou. Após isso transferiu-se 3,0 ml do 
sangue total para uma cubeta e adicionou-se 100,0 µL de DNTB e homogeneizou novamente. 
Adicionou-se 50,0 µL de acetiltiocolina à cubeta, e em seguida, foi realizada duas leituras no 
espectrofotômetro com o auxílio de um cronômetro, a primeira no tempo de 30 segundos e a 
segunda após o decorrer de 3 minutos. 
 Na técnica para o plasma, pipetou-se também 9 ,0 ml de tampão fosfato pH 7,4 em um 
tubo de ensaio de 15 ml e adicionou-se 40 µL de plasma e homogeneizou. Em seguida, 
transferiu-se 3 ml do plasma para uma cubeta e, logo, adicionou-se junto 100 µL de DNTB e 
homogeneizou. Adicionou-se 50,0 µL do substrato à cubeta, e assim como na técnica para 
sangue total, realizou-se as leituras sob as mesmas circunstâncias. 
 
Resultados e discussões 
 
 A análise da amostra foi possível encontrar os valores utilizando a seguinte fórmula: 
 
∆𝐴𝑏𝑣 = 𝐴𝑏𝑣2 − 𝐴𝑏𝑣1 
 
 Onde ∆𝐴𝑏𝑣 é a variação entre os valores de absorbância observados, 𝐴𝑏𝑣2 a leitura 
da absorbância encontrada no tempo de 3 minutos e 𝐴𝑏𝑣1, no tempo de 30 segundos. 
 Foi obtido os seguintes dados: 
 
 
 
 
 Foi possível obter através das seguintes fórmulas a atividade da colinesterase total 
(ST) e a atividade da colinesterase plasmática (PL), respectivamente: 
 
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑆𝑇 = ∆𝐴𝑏𝑣 × 100 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑃𝐿 = ∆𝐴𝑏𝑣 × 25 
 
 E assim encontrar seus respectivos valores de atividade: 8,0 de atividade ST e 2,025 
de atividade PL. Como a reação foi feita à temperatura ambiente, a atividade foi corrigida de 
acordo com a temperatura de 24ºC. Obtendo: 
 
𝑆𝑇 = 8 × 1,039 → 8,31 𝑃𝐿 = 2,025 × 1,045 → 2,12 
 
 Através desses resultados também foi possível determinar a acetilcolinesterase 
eritrocitária através da fórmula: 
 
𝐸 = 
100
 𝐻𝑡
 × 𝑆𝑇 − 𝑃𝐿 (1 −
𝐻𝑡
100
) 
 
 Onde foi encontrado o valor de 19,503 de atividade colinesterásica eritrocitária. Sendo 
este, o indicador biológico que melhor representa a atividade enzimática. Pois possui a vantagem 
de viabilizar comparações por ser o indicador de efeito mais usado em avaliações laboratoriais 
de exposição aos agrotóxicos. 
 
Amostras 𝐴𝑏𝑣1 𝐴𝑏𝑣2 ∆𝐴𝑏𝑣 
ST 0,089 0,169 0,08 
PL 0,149 0,230 0,081 
 Após os cálculos, os resultados obtidos foram: 
 
Eritrocitária 59,37% 
Plasmática 69,71% 
Total 66,76% 
 
 Para a interpretação dos resultados, utilizou-se referências do Índice Biológico Máximo 
Permitido (IBMP), que está na seguinte tabela: 
 
Eritrocitária 30% de depressão 
Plasmática 50% de inibição 
Total 25% de inibição 
 
Interpretação 
 
Através do método de Ellman, ou método espectrofotométrico, é possível constatar 
através das referências de normalidade que a atividade colinesterásica do sangue total está 
abaixo da faixa de normalidade. Diante disso, a atividade colinesterásica eritrocitária, que é a 
verdadeira, nos permite afirmar que está abaixo da normalidade, pois apresenta uma depressão 
eritrocitária de 59,37%, quase o dobro do índice máximo permitido para inibição eritrocitária, que 
é de 30%. Portanto, podemos concluir que o indivíduo pode estar numa condição de intoxicação 
por organofosforados e/ou organoclorados, ou até mesmo, os valores diminuídos de 
colinesterase no soro podem estar relacionados também a patologias como hepatite aguda, 
hepatite crônica de longa duração, cirrose e carcinoma metastático 
 
Conclusão 
 
 O objetivo da prática foi atingido pois foi possível determinar, por meio de reagentes, a 
atividade da colinesterase numa amostra de sangue. 
 Concluímos também que os exames da atividade colinesterásica é um importante 
indicador na intoxicação por organofosforado e carbanatos, de pessoas intoxicadas por 
agrotóxicos. Quanto menor o nível da atividade enzimática, maior o grau de intoxicação 
Entretanto, oexame está sujeito associado a outros tipos de patologias que podem interferir no 
resultado, como exemplo, doenças como a diabetes e a hipertensão arterial aumentam a 
colinesterase, ao passo que a insuficiência renal hepática e verminose diminuem o nível 
enzimático. 
 
Referências 
 
SIQUEIRA, Maria Elisa Pereira Bastos de; FERNICOLA, Nilda Alícia Gallego Gándara de; 
BORGES, Eustáquio Linhares. Determinação de níveis normais de colinesterase plasmática e 
eritrocitária. Rev. Saúde Pública, São Paulo , v. 12, n. 3, p. 340-344, Sept. 1978 
FARIA X.M.Neice; et.al., Intoxicação por agrotóxicos no Brasil: os sistemas oficiais de informação 
e desafios para realização de estudos epidemiológicos. Ciência & Saúde Coletiva, 12(1): 25-38, 
2007. 
SOARES, W. et. al.,Trabalho rural e fatores de riscos associados ao regime de uso de 
agrotóxicos em Minas Gerais, Brasil, 2003.