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Aula biotecnologia2018 Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida
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Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida Princípio básico da eletroforese Fonte de energia Eletrodos Catodo - Anodo + Proteínas Correntes de Convecção O que é um gel? Água + Polímero hidrofílico = GEL Estrutura molecular do gel Polímero Água Ligação cruzada “cross link” Moldagem do gel Solução de acrilamida Pente Espaçador Placa de vidro O aparato de eletroforese Amostra Catodo Anodo Gel Direção da migração A cuba Cabos Caixa do gel Tampa Gel Plugs A fonte Amperes Volts Liga/Desliga Intensidade Tomada de saída de energia Separação de proteínas Mistura de proteínas Poliacrilamida Eletroforese “Bandas” Migração das proteínas Poços com amostra Visão esquemática do gel Catodo Anodo Banda de proteína Tampão Gel Poço Proteínas maiores Proteínas menores Direção da migração Polimerização da acrilamida Acrilamida Bis-acrilamida Poliacrilamida Solução Gel catalizador Estrutura microscópica do gel de poliacrilamida Poros Matriz A concentração do gel determina o tamanho do poro 7% 10% 13% Velocidade de migração Tamanho do Poro Concentração Efeito da Concentração do Gel http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/rf.html 6% 7% 8% A B C D A B C D E A B C D E Efeito de Tamanho Proteína A 50kDa Proteína B 40kDa Proteína C 30kDa Proteína D 20kDa Grande Pequena Velocidade de migração Efeito de Carga Proteína A 90kDa Proteína B 90kDa Proteína C 90kDa Proteína D 90kDa Velocidade de migração - - - - - - - + Efeito de Forma Proteína A 90kDa Proteína B 90kDa Proteína C 90kDa Proteína D 90kDa Alongada Globular Velocidade de migração SDS Proteína enovelada Proteína desenovelada Cargas intrínsecas variadas Cargas negativas uniformes SDS -Dodecil sulfato de sódio Padrão de peso molecular 200 KDa 116 KDa 97 KDa 66 KDa 45 KDa 200 KDa Miosina Galactosidase Fosforilase Soroalbumina bovina Ovalbumina Proteína Peso molecular 1 Kda = 1000 Da 1 Da = 1 dalton = 1u.m.a. Com SDS, a migração é inversamente proporcional ao log do peso molecular Logarítmo do Peso molecular Coeficiente de migração Faixa linear Estimando o peso molecular de uma proteína desconhecida Peso molecular (KDa) Proteína desconhecida Diluições crescentes 250 150 100 75 50 37 25 20 15 10 Topo do gel Topo do gel Migração máxima Migração da Proteína Desconhecida 45mm Migração máxima 65mm Coeficiente de migração 45/65=0,69 Estimando o peso molecular de uma proteína desconhecida (2) Coeficiente de migração Log do Peso molecular Padrões Desconhecida 0,69 -1,99(0,69) + 2,784=1,41 10^1,41= 25,7 KDa 1,41 http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_3133.pdf Características que influenciam a migração Tamanho da proteína i Carga da proteína h Concentração do gel i Tamanho do poro do gel h Voltagem durante a corrida h Tempo de corrida h Não desmonte cuba antes da corrida terminar! http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gelgoofs/bizarre.html#5 Alta amperagem e superaquecimento Acrilamida mal misturada Excesso de proteína Excesso de proteína (2) ???
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