AULA 8

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Microbiologia Médica – Aula 8 – 19/11/2015
Fases clínicas do diagnóstico – Fase Analítica – Processamento da amostra
Alguns autores trazem essa parte como sendo ainda da fase pré-analítica, outros trabalham com ela já na fase analítica, ou seja, na parte que sucede a colheita da amostra. O interessante é perceber a relação da doença com seu sítio anatômico e que as amostras devem vir destes locais. Sempre buscando fazer esta colheita no período em que o microrganismo esteja se multiplicando em maior quantidade possível (ACME). Principalmente para a microbiologia o que se consegue concluir? Tem que se isolar o microrganismo, sendo facilitada essa ação neste momento exato de ACME e tendo-se o cuidado com os procedimentos de assepsia, para minimizar a quantidade de microbiota presente na amostra. Tem que se ter a amostra dentro dos padrões exigidos pelo laboratório (com a melhor qualidade possível no menor tempo). Quando a colheita não acontecer no laboratório, deve-se ter muito cuidado na etapa de transporte, para que essa amostra chegue no menor tempo possível ao laboratório.
O que é o processamento? Manipulação da amostra de forma a poder transferi-la para a identificação por diferentes métodos (MEIO DE CULTURA, SOROLOGIA, TESTE DE SENSIBILIDADE, TESTES BIOQUÍMICOS, por exemplo).
O que é o processar essa amostra? Trabalho com quantidades necessárias para os diferentes testes, importar (aliquotar), no que preciso for, para o armazenamento e uma possível contra prova. Realizar a produção de lâminas para análise morfotintorial (GRAM – início do caminho pra um diagnóstico final), para evitar, por exemplo, receitas indevidas de antibióticos de amplo espectro. Depois disso pode se utilizar a amostra para fazer hemocultura para se confirmar o diagnóstico e informar ao médico que pode continuar com o tratamento.
A partir da anamnese feita pelo médico e das informações na requisição do exame, é possível presumir quais os principais agentes causadores daquela situação clínica e por qual caminho deve-se trilhar dentro do laboratório, qual o tipo de meio que será utilizado...
Por exemplo, se temos um paciente com infecção urinária:
Qual o principal patógeno relacionado? Uma possível E. coli.
O que se espera achar na lâmina? Bacilos Gram Negativos. Caso se confirme, é uma grande pista que se estar no caminho certo! Este é o 1º passo, pois já se começa também imaginar a possibilidade de realizar uma cultura em um meio mais adequado possível, que neste caso seria o Ágar MacConkey (seletivo – não cresce gram + / BEM também é para gram – e é seletivo, não cresce gram +).
Ágar MacConkey isola-se Bacilos Gram Negativos, seleciona as que consomem lactose e possui, ainda, substâncias que inibem o crescimento de Gram Positivas. Para gram + usa-se o manitol salgado. E o ágar sangue é importante para gram + também, principalmente para Streptos, mas o ágar sangue em laboratório é MUITO utilizado.
OBS: Não se pode sair fazendo cultura em todos os meios disponíveis no laboratório, pois aí já entra a questão do custo/benefício.
Se fosse uma infecção de pele (excetuando-se os fungos), com coleta por swab... Qual seria o possível patógeno? Staphylococcus ou Streptococcus. Qual o meio seria mais adequado? Ágar sangue / manitol salgado?!
A Fase Analítica é justamente a fase que irá se empregar os meios de cultura para isolamento e/ou identificação... Não só a utilização de meios de cultura, mas sim com outros testes: Bioquímicos (a partir do consumo de açúcar, por exemplo); de sensibilidade (discos de antimicrobianos – que não é o antibiograma, pois este já esta mais para o final do diagnóstico); Enzimáticos (Coagulase, Catalase); Imunofluorescência.
O ideal é que seja implementado pelo menos 2 métodos no diagnóstico. Por exemplo, faz-se o Gram = uma confirmação. Faz-se teste para consumo de lactose (no meio de cultura) = outra confirmação. Teste de motilidade = mais uma confirmação. Então quanto mais métodos implementados, havendo uma convergência de resultados entre eles, menor é a chance de erro no diagnóstico. E isso ainda leva-se em conta a relação custo benefício. Não se deve gastar muito para se obter um bom diagnóstico, mas sim gastar somente o necessário pra se obter o diagnóstico final. Sempre se deve estar atento às infecções mais comuns (amostras típicas).
OBS: Em casos de patógenos EMERGENTES ou REEMERGENTES (amostras atípicas), são encaminhadas para laboratórios de referência para ser confirmado/ou não.
Deve-se fazer implementações de métodos para se ter relevância clínica, ou seja, tentar isolar e, consequentemente, inferir uma causa etiológica a este agente que está causando o problema e dessa forma, fornecer ao médico as informações necessárias para ele possa encaminhar o paciente a um tratamento eficaz.
A aplicação de relevância clínica é utilizar um método que traga uma informação útil, uma informação que tenha relação com aquela amostra analisada.
Quando se diz que irá realizar testes enzimáticos para CATALASE, é obvio que a suspeita é de Estreptococos ou Estafilococos... Quando a catalase é negativa, indica uma coisa, e positiva (Staphylococcus aureus) indica outra! E a partir disso vai-se formando uma teoria, e vai-se trilhando caminhos até um diagnóstico definitivo. Cada laboratório tem seu plano de ações, um padrão operacional (ORGANOGRAMA, por exemplo).
Laboratórios de lugares diferentes possuem padrões de amostras definidos, protocolos diferentes predominantemente diferente porque têm padrões de doenças diferentes, assim como é o laboratório hospitalar em comparação com o laboratório de comunidade. Por exemplo, comparações de laboratórios hospitalares rurais e urbanos. Amostra de um paciente em laboratório hospitalar por si só já indica que este paciente ele está comprometido (que já é um agravante, pois até a própria microbiota pode causar doença). Amostras hospitalares, geralmente, são as mais invasivas, pois tentam recuperar nestas amostras a menor quantidade de microbiota possível. Amostras de hospitais rurais, geralmente, estarão relacionadas a infecções ligadas ao ambiente, devido, principalmente, ao não uso ou ao uso inadequado de EPI’s por parte da população nas suas atividades no campo. Enquanto que nas amostras de hospitais urbanos são de doenças infectocontagiosas, como em épocas frias as pessoas tendem a se amontoarem, ficarem próximas uma das outras o que facilita a transmissão da gripe, por exemplo.
Antigamente trabalhava-se muito, inoculava-se em vários meios de cultura (PANCULTURA), e no final causava mais confusão do que respostas para o diagnóstico.
Para um bom processamento, é de fundamental importância, portanto, seguir um padrão:
Uso de corantes, pois estes são fundamentais porque servem para distinguir os microrganismos; escolher o meio mais adequado para a cultura, oferecendo os macro e micronutrientes para o crescimento do microrganismo de interesse (levando em consideração as bactérias fastidiosas, fornecendo as melhores condições para seu crescimento), atentando-se para as técnicas de transferência mais adequadas (semeadura é uma etapa do processamento – estriamento, esgotamento). 
ISOLAMENTO – MEIO DE CULTURA (NUTRIÇÃO – QUIMICA) E INCUBAÇÃO (CONDIÇÕES FÍSICAS). Fornecer incubação (temperatura – esta desequilibra o pH quando alta; umidade e atmosfera) ideal para o crescimento do microrganismo, assim como o fornecimento de fatores de crescimento, vitaminas, macro e micronutrientes, ou seja, mimetizar o ambiente artificial ideal. Após o crescimento do microrganismo ainda deve ser feita a análise e determinar se ele necessita de uma melhor caracterização, por que nem sempre o inóculo no primeiro meio é suficiente para o diagnóstico final, por isso deve ser realizado um subcultivo (transferência de meio primário para um secundário), com forma de se obter relevância clínica, para determinar com segurança o diagnóstico; como em infecções onde há baixo numero de patógeno, então se usa um meio enriquecido para aumentar a quantidade e depois inocula em um meiopara que seja isolada. E por fim, faz-se um teste de sensibilidade, para determinar o antibiótico e a dose adequada para combater aquele microrganismo.
Um bom exemplo é quando não se consegue em uma amostra uma quantidade de microrganismo suficiente para isola-lo em um meio, então faz-se um cultivo desse microrganismo visando sua multiplicação e, logo em seguida, com uma maior quantidade desse microrganismo, faz-se uma inoculação em um segundo meio, com o objetivo de selecioná-lo, diferenciá-lo.
Portanto, deve ser feito um monitoramento constante no laboratório para se obter QUALIDADE nos diagnósticos, e para isso é necessário muito trabalho, manutenção de aparelhos e funcionários qualificados.
Como se deve proceder para um bom processamento de amostras? “Restringir o processamento de amostras de cultura a produção de informação relevante e útil.” No fim da história, nada mais é que: O processamento vai nos dirigir a amostra de cultura para a produção de informação útil, ou seja, só vamos inocular em um meio de cultura se isso nos fornecer um dado clínico relevante! E para isso devemos:
Selecionar bem os meios de cultura primários;
Escolher as melhores técnicas de transferências, seja de meio para o outro ou da amostra clínica para o meio de cultura primário – semeadura por estriamento, esgotamento;
Determinar qual a melhor técnica de cultivo;
E o que seria um meio de cultura? Conjunto de substâncias formuladas de maneira adequada capazes de promover o crescimento microbiano no ambiente laboratorial.
Se tem-se um caso de pneumonia, a amostra é o escarro, o paciente se encontra doente, e eu não consigo recuperar do escarro um eventual agente etiológico, o que houve neste caso? Certamente um erro no momento da colheita da amostra, ou não foi colhido no melhor dia (não tendo uma boa viabilidade em quantidade de microrganismos naquele sítio anatômico), e neste caso seria necessário fazer um cultivo para a multiplicação do agente, em caldo de enriquecimento, por exemplo, e somente depois tentar novamente isolar este agente em um meio de cultivo secundário.
Meio adequado para neisserias – “tai mart” = agar chocolate modificado.
Quando se usa um meio líquido, caldos, por exemplo, a ideia é aumentar a quantidade de microrganismos presentes naquela amostra e não isolar estes agentes.
MacConkey – enterobacterias – bacilos gram – possibilitando inibir gram + e meio seletivo pelo padrão de consumo de lactose. 
A maioria das bactérias podem ser, atualmente, cultivadas em laboratório. As que não são cultiváveis deve-se implementar outras técnicas de diagnóstico (SOROLOGIA, COLORAÇÃO, TESTES IMUNOENZIMÁTICOS, IMUNOFLUORESCÊNCIA, TÉCNICAS MOLECULARES, ETC...).
Os meios de cultura são formados basicamente por:
Fonte de carbono (FONTE DE ENERGIA – carboidratos - base de toda molécula orgânica) e nitrogênio (para a formação de peptídeos/proteínas);
Fonte de energia;
Sais minerais;
Fatores de crescimento;
Condições físicas (condições de incubação: temperatura, umidade, atmosfera, etc);
Esterilização (para não dificultar o isolamento do real patógeno);
Os meios de cultura são classificados de acordo com suas características, quanto à composição, de acordo com a concentração de ágar existente no meio:
De acordo com o estado físico podem ser:
Líquidos ou caldos: Produzidos em tubos. Tem total ausência de ágar. Serve para proporcionar o crescimento indiscriminado do microrganismo, sendo este crescimento evidenciado pela turvação do meio; OBSERVAR TURVAÇÃO E MULTIPLICAÇÃO MAIOR EM MENOR TEMPO.
Semi-sólidos: Uma quantidade pequena de ágar (0,1% a 0,4%). Serve para analisar motilidade bacteriana (analisar a presença de flagelo);
Sólidos: Produzidos em Placas de Petri. Meios consistentes em temperatura ambiente, devido a presença, em maior concentração, do ágar. Fazendo-se uso de técnicas de transferências adequadas é realizado o isolamento do microrganismo de interesse, obtendo-se uma cultura.
Quando a amostra colhida não possui uma quantidade necessária de microrganismos, faz-se necessário o uso do caldo como meio primário e utiliza-se da técnica de Shake (movimentos rápidos, chacoalhando a amostra, permitindo o contato de células bacterianas mais facilmente) com finalidade de aumentar a capacidade de divisão celular, objetivando-se, então, a multiplicação bacteriana e, posteriormente, o isolamento deste microrganismo em um meio de cultura secundário. Incubadora que chacoalha e tem uma temperatura e umidade adequada, 8-15h o caldo fica turvo.
A turvação é o sinal de crescimento bacteriano no meio, como por exemplo, quando recebe-se uma amostra de LCR turva, é um sinal de que existem bactérias se multiplicando ali, e muito possivelmente trata-se de uma meningite.
De acordo com as características químicas os meios de cultura podem ser divididos em:
Sintéticos: Quando se conhece quase que a complexidade de todo o meio... Sabe-se quanto tem de peptona, quanto tem de fonte de carbono, então... Se conhece o que tem e a quantidade do que tem-se no meio.
Complexos: Basicamente não se sabe a composição ao certo, como por exemplo: é retirado o sangue de carneiro para fazer o ágar sangue... Então se tem uma quantidade de proteínas, carboidratos... Mas não se tem uma determinação aproximada de quantidades e nem de componentes totais por se tratar de uma fonte natural.
Os meios diferem, quanto aos compostos químicos, em:
Meio básicos: São aqueles de uso geral, ou seja, que podem ser usados no preparo de outros meios... Por exemplo: Ágar Nutriente; Ágar Müeller Hinton.
Meio de enriquecimento: Composição química rica em nutrientes e tem como função fazer com que amostras clínicas aumentem em número. Exemplo: Caldo Brain Heart Infusion (BHI) – Um meio complexo; Caldo Tetratinado – Um meio também seletivo, usado para o crescimento de enterobactérias como, por exemplo: Salmonella e Shigella. ÁGAR SS – seletivo (especifico) para Salmonela e Shigella.
Meio diferencial/indicador: É o que mais é implementado. Possibilita distinguir entre vários gêneros e espécies de microrganismos, por possuírem substâncias que permitem a diferenciação presuntiva, evidenciada pela mudança de coloração ou morfologia de colônias. Geralmente são meios sintéticos, onde tem corantes que diferenciam na cor após o crescimento dos tipos de bacterias. Exemplo: MacConkey é seletivo e diferencial, ele seleciona por um corante (Cristal Violeta) que irá impedir o crescimento de Gram Positiva, e proporcionar o crescimento só de Gram Negativa. Presença de lactose, sacarose.
Exemplos de outros meios: Ágar EMB (Eosina azul de metileno – leva a diferenciar na cor do crescimento de E. coli (alta consumidora de lactose – fica verde) ou outras enterobactérias que podem estar relacionadas com o mesmo quadro clínico – Salmonella, Proteus, Shigella (fracos consumidores de lactose); Ágar MacConkey e Ágar Hectoen.
 Geralmente os meios diferenciais e seletivos são meios sintéticos. No entanto, Agar sangue, que é um meio complexo, também pode ser um meio diferencial para streptococos (e entre os próprios streptos, os alfa, os beta e os anemoliticos) e staphylococos.
Meio seletivo: muito implementado. A finalidade deste tipo de meio é selecionar as espécies que se deseja isolar e impedir o desenvolvimento de outras bactérias (adição de antibióticos, antifúngicos, corantes, por exemplo). Exemplos destes meios: Ágar Manitol Salgado, Ágar SS, Agar chocolate. Quase sempre quando é seletivo pode ser diferencial.
Às vezes um meio é seletivo e pode ser diferencial, mas nem sempre quando for diferencial é seletivo.
O ágar sangue pode ser utilizado para o diagnóstico de Estreptococos, caracterizando-os de acordo com o padrão hemolítico.