CONTINUAÇÃO STAPHYLOCOCOS

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AULA 02
CONTINUAÇÃO STAPHYLOCOCOS
Quanto mais patogênico esse microorganismo é menos eu preciso de um problema de base, ou susceptibilidade do hospedeiro. S. aureus causam muitas doenças, inclusive faringites, mas menos frequentes. S. epidermitis e S. saprofiticus acomete principalmente pacientes hospitalizados, por isso são menos virulentos, são menos hemolíticos. S. epidermitis ainda é mais prevalente que o S. saprofiticus, porque está muito relacionado a colonizar próteses em hospitais, marca-passo, etc. Já o S. saprofiticus está mais relacionado a infecções urinarias em mulheres e é o menos prevalente destes 03 mais prevalentes.
Pelo uso abusivo de antibióticos outras duas espécies de Staphylos surgem: o S. haemoliticus e o S. ludgnensis, são dois tipos de Staphylos que surgem como emergência, eles estão em menor proporção, mas quando surgem é complicado porque são muito resistentes a uma gama de antibióticos. Essa resistência e patogenia surgem muito pelo compartilhamento de DNA plasmidial (DNA extra-cromossomal), DNA cromossomal ou por bacteriófagos. 
A resposta a toxinas (superantígenos) pode ser mononuclear, através de linfócitos. 
Os streptos são muito diversos (e estão muito relacionados a doenças por conta de serem muito diversos e por isso compor de forma intensa nossa microbiota, e muitas doenças surgem dessa microbiota, de um desequilíbrio – onde o que era de um local pode ir para outro ou o que era transitório passa a prevalecer) mais que os staphylos, no entanto, os staphylos produzem mais toxinas e enzimas, são mais agressivos. Onde os streptos agridem mais através de componentes estruturais. 
O S. aureus é da microbiota permanente do TGU e do TRS. Já no TGI é de microbiota transitória. Se eles prevalecerem como microbiota transitória eles podem produzir enterotoxinas que causam intoxicação gastrointestinal. Por isso é preciso que esteja tudo equilibrado, pois se houver desequilíbrio pode perturbar essa relação da microbiota em diferentes sítios anatômicos. E qualquer desequilíbrio para esses microorganismos que tem um potencial de produzir toxinas e enzimas, que possui cápsula (essa capsula é muito imunogênica e está muito relacionada à virulência porque ela permite a adesão em mucosas e a fuga da fagocitose), é muito serio. Além disso, essas bactérias possuem ac. Tecoico e lipotecoico que são muito imunogênicos e, por isso estimulam um processo inflamatório intenso. 
Sepsemia – muito comum estar relacionada à S. aureus e Streptococos. Diagnóstico por hemocultura. 
Pseudomonas, acinetobacter – bacilos gram – não fermentadores e estão em emergência para causar sepsemia. 
Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína é uma enzima. Boa parte dos Staphylos relacionados à doença tem capsula, que são muito imunogênicas e é um forte fator de virulência. E estas são utilizadas para sorotipar, existem cerca de 11 sorotipos de Staphylococos através da capsula. A 05 e 07 são as capsulas mais ocorrentes nos principais casos de doenças. Nos Staphylococos a capsula não está tão relacionada a manutenção da bactéria aderida ao sítio anatômico, mas está relacionada à grande resistência dessas bactérias a agentes químicos ou físicos e se manterem aderidas a cateteres, materiais sintéticos (sondas, próteses), a viabilidade em fômites – tudo isso devido serem pouco fastidiosos. E aqui está mais relacionada à Staphylos coagulase – , S. aureus também, mas estão menos nesse ambiente. E essa capacidade maior de sobreviver por mais tempo, por serem resistentes a altas temperaturas, agentes químicos e físicos, os S. aureus serem halofílicos permite uma maior probabilidade de elas entrarem em contato com um hospedeiro e estabelecerem uma doença.
Outra parte que é fundamental é o peptidioglicano, é quem dar forma à bactéria por ser o arcabouço, são bastante imunogênico (são fortes estimuladores da produção de interleucinas pro-inflamatórias, assim como a cápsula) e conferem virulência, através dos ácidos tecoicos e lipotecoicos. Se a bactéria não tem capsula o que vai estimular a resposta imunológica é o peptidioglicano. E até naqueles que têm cápsula o peptidioglicano pode estimular por ficar exposto fora da cápsula. E os principais leucócitos são os neutrófilos, formando lesões localizadas, por exemplo, do tipo “espinho” (são as mais típicas), geram necrose, abscesso (dois tipos: furúnculo e carbúnculo). Obs: No peptidioglicano podem possuir a enzima beta-lactamase, adquirida por plasmidio, e que são liberadas e degradam a penicilina. Isso é o que confere casos de resistência à penicilina pelo uso frequente desse antibiótico ou em grandes concentrações.
Proteinas A – proteínas de superfície – ficam do lado da coagulase na superificie. O crescimento dessa proteína é exponencial. A grande maioria dos Stafilococos aureus têm e elas estão relacionadas ao processo de ligação delas com uma porção de reconhecimento do anticorpo (Fc) e impede a ação do anticorpo (por isso é compreendida como um fator de virulência) e gera o chamado “fator aglutinante” ou “fator campling”. 
Enterotoxina B (mas existem de A – E e G – I) são as causadoras de náuseas, diarreia, vomito, em quadros de intoxicação, e estes são processos não contagiosos, assim como as toxinas da síndrome do choque tóxico (TSST – são muito comuns em mulheres menstruadas que usam absorventes internos por muito tempo, sem trocá-lo) e estas toxinas são produzidas em algumas cepas em algum momento que o hospedeiro esteja susceptível e em um local anatômico específico, e por isso não são produzidas exponencialmente, mas são estacionárias. 
A enterotoxina A está mais relacionada a doença, a intoxicações. As enterotoxinas C e D são encontradas em produtos lácteos.
Ácidos tecoicos e lipotecoico – estão muito relacionados à aderência, como as cápsulas. 
As proteínas de ligação a fibronectina estão ligadas ao peptidioglicano e que conferem a capacidade de penetrar em tecido integro, porque são capazes de se ligar a fibronectina presente no tecido. 
Lisozima produzida no olho causa a degradação de Stafilococos. No olho o que temos de infecção por Stafilococos ou Strepto no cílio inserido na pálpebra.
Coagulase - a coagulase juntamente com a proteína A são proteínas de superfície. A coagulase é de dois tipos: a coagulase ligada que é esta a qual nos referimos e a coagulase livre. O teste em lamina faz para a ligada (fator clumping) e em tubo para a livre. Essa enzima dar a essas bactérias a capacidade de transformar fibrinogênio em fibrina e passar desapercebida do sistema imune. A coagulase tem uma forte função de atuação como proteção e consequente potencial invasivo. Eles possuem também Stafiloquinase que degradam o coagulo de fibrina quando necessário for.
“Fator cumpling”: proteína A e coagulase
Catalase – O teste diferencia os Stafilos de Streptos, porque aqueles são catalase + e estes são –. É muito importante este teste devido ambas produzirem uma manifestação clinica bem parecidas. A catalase degrada o peroxido de hidrogênio em oxigênio e água. Os stafilos produzem agua oxigenada durante o processo de multiplicação e para não alterar o pH do meio eles possuem a catalase para degradá-la. 
Hialuronidase – enzima presente que destrói acido hialuronico que faz parte de tecido conjuntivo e, a bactéria por degradar essa proteína aumenta sua capacidade de penetração, de disseminação e por isso que lesões epiteliais tendem a penetrar chegando ao tecido subcutâneo, dando origem ao abscesso do tipo celulite.
Lipases – pela composição da pele, além das membranas que possuem lipídios. E esta enzima é muito importante para penetrar em tecidos mais internos: cutâneos e subcutâneos. Furúnculos e carbúnculos (onde estes são fruto também de uma fragilização, não só de mecanismos de patogenicidade da bactéria (como as lipases), por isso são muito comuns em idosos).
São geralmente encontrados na nasorofaringe, TGI (como membro de microbiota transitória) e trato urogenital (S. aureus), inclusive os coagulase negativos causam problemas no TGU (especificamenteo S. saprofíticos). 
As enterotoxinas (superantígenos – eles estão relacionados à DNA cromossomal, assim como as TSST) que causam problemas mais graves são: B e C.
Boa parte das pessoas são portadores sãos onde têm cepas de S. aureus que produzem alguma dessas enterotoxinas, por isso a importância de profissionais de saúde e manipuladores de alimentos serem bem cuidadosos neste contato. 
EXOTOXINAS
Um outro grande conjunto de fatores de virulência são as exotoxinas.
São enzimas ou toxinas que não são de composição estrutural da bactéria, mas são produzidas e secretadas por ela. Basicamente são algumas cepas de aureus que mais possuem essas exotoxinas, enquanto os coagulase negativo não estão muito relacionados a estas, por seu menor potencial patogênico.
Levam a lesões localizadas dermonecroticas ou podem se tornar sistematizadas (como osteomielite, glomerulonefrite, febre reumática, sepse).
STAFILOS PRODUZEM DOIS TIPOS DE TOXINAS: OU AS ENTEROTOXINAS OU TOXINAS CITOLÍTICAS.
Toxina alfa: esta relacionada ao halo formado em agar sangue. O manitol só é utilizado para diferenciar S. aureus de S. não aureus (coagulase negativo) porque o alto teor de sal pode neutralizar o que se procura, como por exemplo, fazer teste de coagulase. Você faz o teste da coagulase em lamina ou tubo através de uma alçada da colônia do agar sangue. Portanto, o manitol salgado não é utilizado para caracterizar os Stafilos, mas para diferencia-los. Essas toxinas alfa são muito produzidas e caracterizadas do uso dessas amostras clinicas de S. aureus em ágar sangue. É uma toxina muito CITOLÍTICA, geralmente lisa células onde estão atuando ou que tem nessas células uma forma de responder contrariamente à bactéria. Produzir toxina gasta muita energia, e por isso essas toxinas só são produzidas em momentos de necessidade, em uma resposta imunológica, por exemplo. Lisam muito eritrócitos (para obter ferro), plaquetas, hepatócitos, onde elas abrem poros na membrana da célula gerando lise osmótica. BETA-HEMÓLISE É MUITO COMUM PARA OS AUREUS. 
Toxina Beta ou Esfingomielase C – lisam eritrócitos, fibroblasto (como forma de penetrar), monócitos, macrófagos. É produzida pela maioria das cepas de Stafilos. Acredita-se que sua função é agir conjuntamente à toxina alfa com a finalidade de destruir o tecido e formar abscesso. CITOLÍTICA.
Toxina delta: também é citolítica. É produzida pela maioria das cepas de Stafilos. Atuando como um surfactante em membranas celulares, como uma espécie de detergente que dissolve membranas. 
Leucocidinas: tem atuação em leucócitos na maioria das vezes polimorfonucleares, mas também mononucleares que são estimulados em situações como na síndrome do choque toxico e síndrome da pele escaldada que são superantígenos que induzem resposta mononuclear e como é uma toxina o padrão de resposta não é por fagocitose, é por uma via de resposta especifica que é quando os linfócitos T são ativados. E as leucocidinas destroem os linfócitos T e consequentemente não há destruição das bactérias, pela não produção de IL-8, IL-6 - INVIABILIZANDO A RESPOSTA DO HOSPEDEIRO. 
Nem todas as cepas produzem leucocidinas.
Toxina gama – também citolítica e que lisa macrófagos e neutrófilos. 
OBS: TODAS ESSAS TOXINAS CITOLÍTICAS PRODUZIDAS SÃO MECANISMOS DE INVASÃO POR EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA
SINDROME DO CHOQUE TOXICO 
Situação sistêmica. É causada por um superantígeno. Está relacionada com a mucosa vaginal pelo uso de absorventes por períodos longos, formando um bom agar sangue, permitindo a multiplicação dos Stafilococos, e mais especificamente de uma cepa que produz um superantígeno que é de DNA cromossomal (TOXINA).
SINDROME DA PELE ESCALDADA
Toxina esfoliativa A e B são as mais relacionadas a estas doenças. Quando é mais localizada chama-se impetigo bolhoso e de forma mais sistêmica a síndrome da pele escaldada, gerando uma descamação generalizada, que são vários impetigos bolhosos que se confluem. São vesículas cheias de pus que estouram e se depositam e descamam. Geralmente ocorre em crianças ou idosos. Nessas vesículas não tem muita bactéria, nem muito neutrófilo, mas elas seriam apenas a manifestação do efeito/ação da toxina. 
A toxina esfoliativa A é termoestável e é mais ligada ao DNA cromossomal. 
A toxina esfoliativa B é mais termolábel e menos importante no que diz respeito à reação a partir desse impetigo bolhoso ou síndrome da pele escaldada estafilocócica. E está mais ligada a dna plasmidial.
Febre não é típico de infecções bacterianas, e sim mais viral, no entanto, como se trata de superantígenos o padrão de resposta é diferente e a febre nesses casos é um sintoma característico (pela produção de IL-1). As duas doenças estão muito relacionadas a ter bactérias no sangue causando isso.
ENTEROTOXINAS
Produzida por um conjunto de Stafilos, e essas toxinas não tem ação citolítica. E a ação é no intestino. Cerca de 30-50% dos Stafilos podem produzir enterotoxinas. As principais são a B e C, são toxinas termoestáveis a 100ºC por 30 min e resistem ao ácido gástrico. Elas agem diretamente no SNC que desdobra no SNP causando fortes vômitos, náuseas, diarreia difusa ocorrendo entre 1-8h o que difere de infecções por bactérias em si. Estimulam demais o peristaltismo intestinal.
Diagnóstico muito difícil porque teria que identificar a toxina nas fezes através de anticorpo monoclonal, ELIZA, IMUNOFLUORESCENCIA. Por isso não se faz diagnóstico, e o tratamento é de suporte. Os efeitos da toxina são muito rápidos. 
AULA 03
Staphylos em outros sítios e mesmo com o paciente saudável pode gerar doença pelo seu grande arsenal gênico.
Produção de alimentos em massa – enterotoxinas – multiplicação de bactérias – acondicionamento inadequado (bacteriostático) – diarreia difusa – efeitos rápidos (8h) – tratamento de suporte. PERDA DE LIQUIDOS INTENSA – EM CRIANÇAS É GRAVÍSSIMO.
Problemas de saúde por dano direto ou por toxinas.
As infecções piogenicas são lesões por dano direto (o que é próprio – “endotoxinas”) porque por toxinas (exotoxinas) não são, são mais “sistêmicas”.
Sistematização por pele ou por sítios (pode haver); através de úlceras de decúbito (escara) através de fômites contaminados; sistematização por estar em ambiente hospitalar (muito comum) – cateter, sondas – S. epidermitis e S. saprofíticos. 
FURUNCULOS E CARBUNCULOS – acessam através do folículo piloso. Diferença em manifestação: furúnculo está ligado a um abscesso e o carbúnculo é como se fossem vários furúnculos. Muito comum em mulheres pela depilação. E em idosos pela pele ser mais frágil, a idade. Pessoas acima do peso pelo estiramento da pele. Há um represamento de algumas bactérias, e quando se expulsa esse material purulento a lesão rapidamente cessa. Geralmente não é diagnosticado. * MUITO RELACIONADO A STAFILOS E STREPTOS
FOLICULITE – inflamação nos folículos pilosos. A mais clássica é o “terçol”.
IMPETIGOS – enormes manchas vermelhas, base eritematosa com vesículas que contém líquido (QUE QUANDO ESTOURAM PODEM FORMAR CROSTAS), mas esse liquido geralmente não tem toxina e nem bactéria, é uma manifestação da ação da toxina produzida pelo estafilococo na pele (lesões bolhosas). Impetigo generalizado: síndrome da pele escaldada onde a bactéria é de uma cepa que produz a exotoxina (SSS). Geralmente não se faz diagnóstico. * MUITO RELACIONADOS A STAFILOS E STREPTOS.
O problema de sistematização para essas bactérias esta mais relacionado à traumas (cateter, por exemplo) e pós-cirúrgicos - BACTEREMIAS -> SEPSES. Varios Stafilos têm tropismo por ossos (osteomielite – cartilaginoso e ósseo/artrites) e válvulas cardíacas (causando endocardites, necrose neste local e podem até levar ao infarto do paciente). Estão relacionados à pneumonias (em hospital – S. aureus, S. haemofilos, Klebsiela pneumonie / streptos – 70% das pneumonias em comunidade) e abscessos em pulmão (epiemia). Síndrome da pele escaldada stafilocócica (muito comum em crianças porque está em formação seu sistema imune, já nos adultos essa generalização dessa doença– SPES – não é comum porque o individuo é mais fácil possuir anticorpos contra a toxina, já que este tem mais probabilidade de ter sido exposto anteriormente. Intoxicações intestinais. Impetigo. Síndrome do Choque Tóxico (toxinas muito potentes – capaz de comprometer o individuo de forma sistêmica).
Amostras: LCR; SANGUE; ESCARRO; ALIMENTOS (indireta); PARA AMOSTRAS CLÍNICAS O PRIMEIRO ÁGAR É O SANGUE.
MICROSCOPIA -> CULTURA EM AGAR SANGUE -> MANITOL SALGADO -> TESTES ENZIMATICOS (CATALASE, COAGULASE) -> TESTES IMUNOLÓGICOS (NÃO MUITO UTILIZADOS PELA POUCA SENSIBILIDADE E POUCO ESPECIFICO PORQUE O QUE SE PROCURA VAI SER OS ACIDOS TEICOICOS QUE ESTAO PRESENTES NOS DOIS E SÃO CAROS) = PARA DIFERIR STAFILOS E STREPTOS.
AUDIO 04
Enterococos também são importantes dentro de alimentos.
Amostras para diagnóstico de stafilos – swabs (para os problemas mais localizados); sangue (para infecções sistêmicas); LCR (menos comum a casos de meningite); escarro (pneumonia) e alimentos (intoxicações entéricas).
COLHEITA DO LOCAL REAL DA INFECÇÃO. 
A microscopia é fundamental de forma inicial. Às vezes tem que ir antes para um caldo. O que se espera é em vínico, pares, cadeias. 
Depois vai pra cultura em manitol; agar sangue (beta-hemolíticos); teste da catalase (Estafilococos +); teste da coagulase (S. aureus +). Os testes sorológicos que detectam o antígeno que é o peptidioglicano acaba sendo inespecífico porque são anticorpos policlonais, onde Stafilos e Streptos são GRAM + e causam manifestações semelhantes, precisando serem diferidos. Como diferenciar os coagulase negativos dentro dos Stafilos? 
Diagnóstico rápido, especifico e sensível.
FAZ PRIMEIRAMENTE O GRAM E DEPOIS FAZ O MEIO DE CULTURA/CALDO DE ENRIQUECIMENTO (PARA REALIZAR TESTES ENZIMATICOS OU PARA DEPOIS CULTIVAR EM MEIO DE CULTURA – AGAR SANGUE – colônias maiores, dourada - stafilos; colônias menores e brancas - streptos) E EM SEGUIDA FAZ O GRAM DA CULTURA NOVAMENTE. 
Streptos causam mais problemas pelo que possuem na célula, sua estrutura. Já os Stafilos possuem além de mecanismos estruturais, mas também por toxinas e enzimas.
Para Stafilos geralmente se usa caldo de enriquecimento (BHI) - E SE A SUSPEITA FOR S. AUREUS FAZ EM MANITOL HIPERTONICO) - devido esses pacientes na maioria estão sob ação de fármacos. 
(AGAR BADIN PARKER MUITO PARA ALIMENTOS).
Diferenciação de stafilos e streptos: bacterioscopia -> cultura (agar sangue, manitol hipertônico) -> testes enzimáticos (catalase e cogulase)
 teste da DNAse, teste da novobiocina).
TESTE DA CATALASE
Difere stafilos (+) de streptos (-). Inicialmente crescem em caldo BHI (ideal porque no ágar sangue pode ter catalase) e se colhe um pouco da amostra (O TESTE DEVE SER FEITO A PARTIR DE CULTURA E NÃO DO PACIENTE PORQUE NO TECIDO E SANGUE HÁ CATALASE, PODENDO DAR UM FALSO POSITIVO) e faz um esfregaço em lâmina colocado 2 ou 3 gotas de água oxigenada. Se formar bolhas (conversão de água oxigenada em H2O e 02 pela catalase).
Micrococos também são catalase +, na microscopia estão em tétrades e são comuns em grãos.
TESTE DA COAGULASE
Difere Stafilos (+) de outros Stafilos (-) e Streptos (-).
Existem dois tipos de coagulase: a ligada (de composição da célula – mais relacionada a lamina) e a livre (secretada – mais em caldo). Para este teste pode fazer um caldo de enriquecimento ou em agar sangue. Você põe na lamina uma amostra do caldo ou agar e homogeniza com salina se for do agar sangue e adiciona soro sanguíneo e se for coagulase + vai haver formação do coagulo. Ou no tubo onde você tem o soro sanguíneo (geralmente de coelho) e adiciona a amostra vindo de caldo ou homogeneizada com salina e se for coagulase + vai formar um coagulo. 
Se der negativo continua-se a pesquisa com o TESTE DA NOVOBIOCINA para diferenciar saprofiticus e epidermitis. Em um ágar muller-hunton coloca-se a amostra por espalhamento (do caldo de enriquecimento) e depois de 16h-24h coloca-se discos de novobiocina que é um antibiótico. E observa quem é sensível e resistente. Quando há sensibilidade: S. epidermitis. Se houver resistência: S. saprofiticus. 
Stafilos coagulase negativo não formam hemólise em ágar sangue, ai você já suspeita e coleta uma porção da colônia e coloca para crescer em caldo de enriquecimento (e nesse caldo rapidamente cresce) para depois espalhar em ágar muller-hunton e implantar discos de novobiocina. 
Teste da Trealose – diferencia o saprofiticus e epidermitis, mas é muito difícil de usar.
TESTE DA DNAse – é uma desoxirribonuclease. Por que alguns produzem? Para degradar a molécula de DNA para emulsificar o material pustular. Pois o pus é uma resposta do hospedeiro à infecção e que é até uma proteção contra penetração por outros patógenos. E por isso alguns tentam fluidificar para penetrar, por isso que o ideal é retirar o pus e colocar medicamento tópico para curar mais rápido e dificultar uma expansão da infecção. 
Em uma ágar DNA você põe uma amostra clínica crescida no ágar sangue ou do caldo colocando uma colônia densa, sem espalhar, no centro na horizontal ou vertical para que se perceba melhor a formação do halo ou não. Incuba 24h-48h e os que são DNAse + vão formar o halo. E o halo é revelado pela adição do ácido clorídrico que oxida o resto da placa (ficando turva – já que o meio é límpido) e deixa em evidencia o halo onde não há mais DNA.