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1. 1ª Aula Prática – Coleta de Sangue à Vacuo
1.1 Introdução
A coleta de uma amostra é parte fundamental na determinação de uma variável analítica, pois, sendo o único contato entre o paciente e o laboratório, a não observação do preparo do paciente, pode acarretar em erros no resultado. Esta coleta pode ser feita através da venopunção ou da arteriopunção. O método empregado rotineiramente é a venopunção, que consiste em coletar uma pequena amostra do sangue periférico em uma veia. Uma vez que a amostra é obtida e enviada ao laboratório os erros podem se originar devido o período anterior à análise. Parte das análises é realizada no soro e para a determinação de algumas substâncias, por vezes se faz necessário a inibição da coagulação do sangue através do uso de anticoagulantes, assim obtém-se o plasma. E para a coletar o sangue, esta técnica pode ser realizada através de agulha e seringa ou utilizando o sistema à vácuo, este segundo é mais segundo devido ser um sistema fechado de coleta.  
	A coleta de sangue à vácuo é técnica de coleta de sangue venoso considerada segura, se bem executada, e recomendada pela Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial. 
	Diferença entre Soro e Plasma: O plasma é constituído de todos os elementos presentes no sangue, dentre eles: glóbulos vermelhos, glóbulos brancos, plaquetas, proteínas albumina e hemoglobina, eletrólitos, micronutrientes, hormônios e excretas metabólicas, grupo ABO, fator Rh. O único elemento que está presente no plasma e não no soro é o fibrinogênio, elemento que constitui em fibrina (coágulo) caso não haja anticoagulantes no meio. O soro é basicamente o plasma, porém com essa única diferença tratada acima, ele por não possui anticoagulantes em seu meio, converte fibrinogênio em fibrina e há formação de coágulos, então pode-se concluir que o plasma é sangue + fibrinogênio que não foi consumido, e o soro é sangue – fibrinogênio que foi consumido pelos elementos da coagulação.
Anticoagulantes
	Nessa primeira aula prática, os discentes tiveram a oportunidade de adquirir experiência prática em realizar a técnica de coleta de sangue, venopunção, utilizando o sistema à vácuo. 
1.2 Objetivo
	Apresentar os materiais necessários para a coleta. Orientar como deve ser preparado e executado a coleta. E permitir os discente a adquirir experiência prática na realização da coleta de sangue com o sistema à vácuo.
1.3 Materiais e Métodos
Luvas 
Agulhas 
Piloto 
Tubo de plástico com heparina (OBS: tampa verde)
Garrote
Álcool 70%
Algodão 
Bandeja de alumínio 
Estante para tubos 
Antes dos discentes executarem a parte prática, a docente responsável pela disciplina de Práticas em Biomedicina III, mostrou os materiais a serem utilizados na coleta, bem como a preparação. Foi também passada as instruções de como deve ser feito a coleta corretamente para a promoção de segurança ao discente responsável da execução da coleta e a do discente voluntário a ser coletado.
O discente responsável pela coleta, primeiramente, preparou a bandeja de alumínio portando os materiais necessário para a venopunção à vácuo. Nesta, continha o piloto, agulha tampada, dois pedaços de algodão e o garrote. Em seguida o discente colocou as luvas de látex e em sequência fez a procura da veia adequada para coleta, tendo como auxílio o garrote, no braço do discente voluntário. Após encontrar, fez-se a preparação do material. 
Retirou-se a agulha da embalagem e a acoplou no piloto. Colocou-se o garrote no braço do discente, a uma distância de cinco centímetros do cotovelo. O discente responsável pela coleta lembrou-se da veia escolhida a ser puncionada, então, partiu-se logo para a desinfecção do local a ser puncionado utilizando-se um algodão embebido em álcool 70%. Após secar o álcool, a agulha foi introduzida na veia. Depois, o tubo foi colocado no piloto permitindo o sangue fluir dentro deste. Retirou-se o garrote Após o sangue parar de fluir dentro tubo, este foi retirado cuidadosamente, bem como a retirada da agulha evitando que o sangue jorre para o exterior. Colocou-se um algodão seco logo após a retirada da agulha para estancar o sangue. E foi pedido para o discente voluntário pressionar o algodão e manter o braço estendido para prover o estancamento. 
1.4 Resultados 
	Alguns discentes tiveram ocorrências interferentes durante a execução da coleta como após a retirada da agulha ouve extravasamento do sangue, porém, algo sem gravidade. Os tubos com os sangues coletados foram descartados em recipientes adequados para armazenamento de materiais biológicos, assim como os materiais descartáveis como luvas, algodão e agulhas. Como a aula teve apenas objetivo de adquirir experiência em venopunção no sistema à vácuo, não foi preciso o armazenamento das amostras, sendo assim descartados ao término da aula. 
1.5 Conclusão
	Ao comparar o sistema à vácuo com o sistema composto por agulha e seringa, é percebível a vantagem que o primeiro proporciona como a agilidade, segurança e comodidade para o profissional da saúde e o paciente. 
1.6 REFERÊNCIAS 
MELO, M.; SILVEIRA, C. M. Laboratório de Hematologia: teorias, técnicas e atlas. Editora Rubio, 2015. 
Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial para coleta de sangue. 2ª ed. Minha editora, 2010. 
2. 2ª Aula Prática – Extração de DNA 
2.1 Introdução
	O Ácido desoxiribonucleico, conhecido como DNA (que vem do inglês deoxyribonucleic acid) é um complexo de moléculas que contém todas as informações necessárias para construir e manter um organismo.
Todos os seres vivos possuem DNA em suas células. O DNA além de ser um complexo conjunto de moléculas com estruturas e funções específicas, é também responsável pela hereditariedade nos organismos vivos.
O DNA é responsável por codificar as informações individuais de cada organismo, e parte dele é herdada dos pais, e, ao longo das gerações e trocas de DNA podem promover a variabilidade genética.
Em uma grande maioria das células dos organismos, o DNA se localiza no núcleo. Quando o DNA é organizado em um núcleo, as células são classificadas em eucariontes, todavia, quando o DNA está disperso no citoplasma das células, estas são denominadas de procariontes.
O DNA é formado por duas fitas de bases nitrogenadas mais açúcar/fosfato, originando uma estrutura conhecida como dupla-hélice. E o que mantém as duas fitas ligadas, são as pontes de hidrogênio que liga uma base nitrogenada a outra. Sendo assim, a adenina se liga a timina e vice-versa, e a guanina se liga a citosina e vice-versa.
Já a organização do DNA se dá pela seguinte forma: ele se enrola nas cromatinas. Estas se enrolam sobre si mesmas, formando as histonas, até formarem um complexo de polinucleotídeos, um conjunto de nucleotídeos formado por bases nitrogenadas, açúcar, fosfato e pontes de hidrogênio, que recebe o nome de cromossomos.
PCR Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction):
É uma técnica de amplificação, criação de múltiplas cópias, de DNA sem precisar utilizar um organismo vivo. A Reação em Cadeia da Polimerase é uma das técnicas comumente empregadas em laboratórios de pesquisas em biologia molecular para diversas tarefas.
A (PCR) é altamente sensível em análises e devido a isso realizado com muita cautela para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste na utilização de mecanismos de replicação in vitro. A maquinaria para separar as fitas senso positiva e senso negativa são muito complexas na célula e no lugar utiliza-se a mudança de temperatura, geralmente aos 95°C, essa é característica da primeira etapa da PCR, também conhecida como desnaturação. Os ciclos têm por objetivo disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, esta consiste na segunda etapa, conhecida como anelamento, que é a ligação dos primers a fita alvo através da formação das pontes de hidrogênio a uma temperatura de 55°C. Vale lembrar que é necessário extrair o material genético da célulaou outro material a ser estudado sem ocorrer danificação. A maioria dos materiais extraído é um DNA, contudo é possível utilizar o RNA , porém, necessário que este seja submetido a uma RT-PCR para ser convertido em DNA, através do mecanismo de transcriptase reversa, para só assim passar por uma PCR. Após a extração do DNA, este é adicionada em uma mistura conhecida como mix que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers e a enzima taq-polimerase em uma solução tampão. Esse mix é colocado em um termociclador, este faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos para cada reação no fragmento que sofrerá amplificação. 
Voltando as etapas da técnica de PCR, a última etapa é a extensão onde em uma temperatura elevada a 72 °C, para a enzima possa exercer sua função e formar nova molécula, e logo após, um novo ciclo se inicia. O número de ciclos pode variar de acordo com cada situação, contudo a média é de 25 a 40 ciclos para cada reação, cuja reação depende do fragmento. {\displaystyle 2^{ciclos}}
Para analisar o resultado é necessário a eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida. No geral, um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, nos poços, para avaliar o tamanho e o peso molecular do fragmento amplificado.
A PCR tem como principal aplicabilidade em materiais onde a quantidade de DNA disponível é reduzida, como na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (ex: sangue) passam por uma amplificação para depois serem analisadas. A PCR também é empregada em pesquisas da biologia molecular como, por exemplo, no objetivo de amplificar para a identificação de patógenos que estão presentes em amostras, a exemplo as hepatites virais (A, B, C, D e E). 
Extração do DNA:
	Nesta segunda aula fez-se a extração de DNA, a partir de uma técnica muito simples com o objetivo de extrair um pequeno fragmento de DNA da região oral de um discente voluntário, como extrair DNA de uma fruta escolhida pelos discentes.
2.2 Objetivo
	Extrair uma amostra de DNA da região oral de um discente voluntário. E extrair DNA de uma fruta escolhida pelos discentes. 
1.3 Materiais e Métodos
1 Banana
Almofariz
Proveta de 50 ml
Gaze 
Água destilada
Béquer de 100 ml 
Copos de plástico
Detergente comum 
Cloreto de Sódio (NaCl) 
Álcool etílico frio
Luvas 
Bastão
Antes de ser feito a parte prática, a docente da disciplina passou aos discentes as instruções de como realizar o procedimento da extração de DNA para que os resultados sejam satisfatórios. Nesta aula prática fez-se duas atividades de extração de DNA. A primeira consistiu da extração de DNA de uma fruta, nesse caso a fruta de escolha para essa aula foi a banana. Já a segunda prática teve como objetivo extrair o DNA das células epiteliais da boca. Vale destacar que esta atividade foi feita em grupo, tendo cada grupo de no máximo três componentes. 
A primeira atividade a ser feita foi a extração de DNA da banana. Primeiramente, esta foi descascada e partida em pedaços por um discente com as mãos, estas estavam protegidas por luvas. Os pequenos pedaços foram colocados em no almofariz, e com o auxílio de um bastão a banana foi amassada. Depois, adicionou-se 50 ml de água destilada, que estava em uma proveta. Em seguida adicionou-se 3 ml de detergente comum e 3 gramas de cloreto de sódio. Misturou-se tudo, com o auxílio do bastão. E foi aguardado um minuto. Após passado um minuto, outro discente filtrou a mistura com auxílio de uma gaze em um copo descartável. E lentamente foi adicionado 30 ml de álcool etílico frio. A mistura, então, foi deixada em repouso e algum tempo depois pôde ser observada uma camada gelatinosa que possivelmente são os DNAs “flutuando”. 
Já a segunda atividade, a extração de DNA das células epiteliais na boca, foi feita da seguinte forma. Primeiro foi preparada uma solução salina (água + NaCl) muito concentrada em um copo plástico. Um discente voluntário colocou a solução salina na boca e bochechou durante exatamente um minuto. Em seguida o obtido foi “cuspido” em um copo de plástico limpo. Foi adicionado a esse obtido duas gotas de detergente comum. Transferiu-se 20 ml do obtido para uma proveta e adicionou-se cuidadosamente 30 ml de álcool etílico frio. A mistura ficou em repouso por alguns minutos e pôde ser observado uma camada, considera fina de DNA subindo para superfície da solução.
1.4 Resultados e Discussões
	Na primeira atividade conseguiu-se uma camada rica em DNA. Isso se deve pelo fato da banana ser muito rica nessa molécula. Já na segunda atividade prática o fragmento de DNA conseguido foi muito pouco, a possível explicação deve-se pelo fato do discente não ter bochechado de maneira adequada. 
Respostas das questões:
Porque que é necessário macerar a banana?
O ato de macerar a banana, ou seja amassar, tem como objetivo deixar que os produtos químicos usados na mistura para a extração cheguem com facilidade nas células.
Em que etapa do procedimento ocorre o rompimento das membranas das células da banana e célula epitelial da boca? Explique.
Quando é adicionado o detergente comum, isso serve tanto para as células da banana quanto as células epiteliais da boca, pois, ela dissolve tem em sua composição química a capacidade de dissolver lipídeos, sendo assim, no caso das células, o detergente atua na parte lipídica das células deixando-as solúvel bem como são extraídos juntamente com as proteínas, que também compõem as membranas.
Qual a função do sal de cozinha?
O sal de cozinha tem como função fornecer íons para a etapa de precipitação do DNA.
Qual o papel do álcool?
O DNA extraído da banana encontra-se na forma aquosa, logo, dissolvido em água. Com a adição do álcool e de concentrações elevadas de sódio, devido ao NaCl, o DNA sai da solução e ocorre a precipitação. 
Por que não é possível visualizar a dupla hélice do DNA extraído a olho nu?
Porque o DNA possui o diâmetro de dois nanômetros, e com isso só é possível visualizar em microscópio eletrônico. Ou seja, o que se vê a olho nu é um emaranhado formado por inúmeras moléculas extraídas de DNA. 
1.5 Conclusão
	Através da aula prática e ao responder as questões acima, pôde-se aprender um pouco mais sobre a estrutura do DNA e sua importância para a aplicação em experimentos e testes, principalmente realizados na área da biologia molecular. 
1.6 REFERÊNCIAS 
VERLENGIA, R.; CRESPO HIRATA, R.D., HIRATA, M.H. Biologia Molecular - Prevenção e controle da contaminação nas reações de amplificação de ácidos nucléicos. NewsLab 43. 2000.