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INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CURSO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL BRUNELA DOS SANTOS NEVES ESTUDO DE BIOFILMES E O POTENCIAL DE CORROSÃO EM AÇO INOXIDÁVEL AISI 316 EM ÁGUAS MARINHAS Vitória 2016 BRUNELA DOS SANTOS NEVES ESTUDO DE BIOFILMES E O POTENCIAL DE CORROSÃO EM AÇO INOXIDÁVEL AISI 316 EM ÁGUAS MARINHAS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia Sanitária e Ambiental do Instituto Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Graduação em Engenharia Sanitária e Ambiental. Orientadora: Profª. Dra. Adriana Marcia Nicolau Korres Coorientadora: Profª. Dra. Viviane Azambuja Favre- Nicolin Vitória 2016 (Biblioteca Nilo Peçanha do Instituto Federal do Espírito Santo) N513e Neves, Brunela dos Santos. Estudo de biofilmes e o potencial de corrosão em aço inoxidável AISI 316 em águas marinhas / Brunela dos Santos Neves. – 2016. 76 f. : il. ; 30 cm Orientadora: Adriana Marcia Nicolau Korres. Coorientadora: Viviane Azambuja Favre-Nicolin. Monografia (graduação) – Instituto Federal do Espírito Santo, Coordenadoria de Saneamento Ambiental, Curso Superior de Engenharia Sanitária e Ambiental, Vitória, 2016. 1. Engenharia sanitária. 2.Ecossistema. 3. Aço inoxidável - Corrosão. 4. Água do mar – Analise. I. Korres, Adriana Marcia Nicolau. II. Favre-Nicolin, Viviane Azambuja. III. Instituto Federal do Espírito Santo. IV. Título. CDD 21 – 628 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus por guiar todos os meus caminhos e estar sempre à frente dos meus planos. À minha mãe, Edneia, que muitas vezes abriu mão de seus sonhos para que eu pudesse conquistar os meus objetivos. À minha professora e orientadora Adriana Marcia Nicolau Korres pela dedicação e ajuda no decorrer deste e tantos outros trabalhos. À minha coorientadora Viviane Azambuja Favre-Nicolin pelo suporte. Aos meus colegas do laboratório de Microbiologia e em especial nossa técnica, Sheila Ribeiro, pelo apoio. Ao estagiário do laboratório de Biotecnologia e Sustentabilidade, Cássio Faé, pela ajuda da coleta da água do mar. Aos integrantes do laboratório de Química, em especial a Paola Angélica, pela ajuda nas análises químicas. Ao Ricardo Boldrini do laboratório de Microscopia e Microanálise pelo apoio no MEV. Ao Bruno Poubel pelo suporte nos ensaios eletroquímicos. Ao Pedro Rupf pela disponibilidade, ajuda nas análises eletroquímicas e pela disponibilização de material de literatura. E aos meus amigos que de alguma forma me incentivaram e acreditaram no meu potencial, obrigada a todos. O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis. José de Alencar RESUMO Os biofilmes são pequenos ecossistemas complexos e dinâmicos, formados por microrganismos envolvidos em uma matriz de polímeros orgânicos aderidos a uma superfície. Microrganismos estruturados em biofilmes demonstram uma preferência pelo processo de adesão em diversas superfícies inanimadas, incluindo aço inoxidável. O ambiente marinho é um ambiente propício para associação de microrganismos devido à velocidade das ondas, temperatura do ambiente, potencial eletroquímico de substratos metálicos imersos na água do mar e diversos outros fatores que propiciam essa interação. O presente trabalho tem como objetivo estudar o biofilme e o potencial de corrosão em aços inoxidáveis AISI 316 imersos por 40 dias em águas das praias da Ilha do Boi e de Manguinhos. O estudo incluiu a avaliação do número de UFC/cm² na superfície dos cupons de aço, a caracterização morfológica, os potenciais de corrosão e a resistência do biofilme formado ao longo da superfície dos cupons, a perda de massa do material em estudo, imagens de microscopias ótica estereoscópica e eletrônica de varredura e uma microanálise por espectrometria em energia dispersiva (EDS) de elementos químicos presentes na superfície do aço com biofilme. Os resultados revelaram que não é apenas o eletrólito que influencia na corrosão, como também a dinâmica do meio influenciada por características ambientais, meteorológicas, químicas, físicas e principalmente a dinâmica dos microrganismos presentes. O número de UFC/cm² mostrou maior contagem global de microrganismos aeróbios mesófilos heterotróficos em Manguinhos, observando a presença de cianobactérias somente nesse ambiente. Estas foram ausentes na Ilha do Boi, possivelmente pelo predomínio de fungos na superfície do aço imerso nesse ambiente. Observou-se um processo corrosivo maior no aço e também maior resistência do biofilme em aços imersos na água de Manguinhos quando comparado ao da Ilha do Boi, sugerindo que ocorreu uma corrosão influenciada por microrganismos. O estudo de biofilme no aço inoxidável em ambientes marinhos se torna importante devido à dinâmica de formação e interação dos mesmos com o meio de estudo, podendo comprometer a balneabilidade da água do mar como também o descarte indevido do material danificado pela corrosão, gerando um grande acúmulo de sucata. Palavras-chave: Biofilmes. Corrosão. Aço Inoxidável. Água Marinha. ABSTRACT Biofilms are small complex and dynamic ecosystems, formed by involved microorganisms in organic polymer matrix adhered to a surface. Microorganisms structuralized in biofilms demonstrates preference for the process of adhesion in diverse inanimate surfaces, including stainless steel. The marine environment is a propitious environment for association of microorganisms due to speed of the waves, temperature of the environment. Electrochemical potential of metallic substrates immersed in marine water and diverse other factors that propitiate this interaction. The present work reports the study of biofilms and the potential of corrosion in AISI 316 stainless steel immersed by 40 days in marine waters of Ilha do Boi and Manguinhos, by analysing the number of CFU/cm² in the surface of steel coupons, by morphological characterization, by the potentials of corrosion, and the resistance of biofilms formed throughout the surface of coupons, by the loss of mass of the material in study, by images of optical and scanning microscope and by microanalysis of chemical elements available in the surface of the steel with biofilms for energy dispersive spectrometry (EDS). The results revealed that not only the electrolyte that influences the corrosion, but also the dynamics influenced by environmental characteristics, meteorological, chemistries, physics and dynamics of the microorganisms. The number of CFU/cm² showed a larger global count of heterotrophic mesophilic aerobic microorganisms in Manguinhos, observing the presence of cyanobacteria only in this environment. These were absent in Ilha do Boi, possibly due to the predominance of fungi on the steel surface immersed in this environment. A high corrosion process was observed in steel immersed in water from Manguinhos when compared to theIlha do Boi. Data also show the high resistance of the biofilm in steels immersed in the water of Manguinhos, even the corrosive process being high in this environment suggesting a corrosion influenced by microorganisms. The study of biofilms in the stainless steel in marine environments becomes important due the dynamics formation and interaction and may compromise the marine water quality such as improper disposal of material damaged by corrosion leading to a large accumulation of waste. Keywords: Biofilms. Corrosion. Stainless Steel. Marine Water. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Esquema representativo do processo corrosivo de caráter eletroquímico 20 Figura 2 - Arranjo experimental para o levantamento das curvas de polarização por meio de um potenciostato..........................................................................23 Figura 3 - Curvas de polarização potenciodinâmica hipotética para um sistema que apresenta passivação com as regiões anódica e catódica ....................... 24 Figura 4 - Circuito Randles modificado com duas constantes de tempo ................... 25 Figura 5 - Diagrama de Nyquist ................................................................................. 26 Figura 6 - Fotografia apresentando o cupom de aço pronto para imersão ................ 30 Figura 7 - Mapa da localização da Ilha do Boi (Vitória-ES) ....................................... 31 Figura 8 - Mapa da localização de Manguinhos (Serra-ES) ...................................... 31 Figura 9 - Cupons de aço imersos em biorreatores contendo água do mar .............. 32 Figura 10 - Célula eletrolítica montada para o levantamento das curvas de polarização e impedância eletroquímica .................................................. 34 Figura 11 - Cupons de aço AISI 316 antes do início do experimento e após a decapagem ............................................................................................... 36 Figura 12 - Morfotipos microbianos de cupons de aço imersos por 40 dias em reatores com água da Ilha do Boi ............................................................. 40 Figura 13 - Morfotipos microbianos de cupons de aço imersos por 40 dias em reatores com água de Manguinhos .......................................................... 41 Figura 14 - Comparação das curvas de polarização do aço AISI 316 (matriz), imersos por 40 dias em reatores com águas da Ilha do Boi e de Manguinhos .............................................................................................. 47 Figura 15 - Gráfico de impedância eletroquímica dos cupons de aço AISI 316 com biofilme formado na água da Ilha do Boi ................................................. 49 Figura 16 - Gráfico de impedância eletroquímica dos cupons aço AISI 316 com biofilme formado na água de Manguinhos, A: escala com zoom, B: escala normal ...................................................................................................... 50 Figura 17 - Comparação do gráfico de impedância eletroquímica dos cupons de aço com biofilme formado nas águas da Ilha do Boi e Manguinhos ............... 51 Figura 18 - Imagem da corrosão dos aços após os ensaios eletroquímicos ............. 52 Figura 19 - Microscopia ótica em cupons de aço AISI 316 imersos por 40 dias em reatores contendo águas de Manguinhos e da Ilha do Boi ....................... 54 Figura 20 - Microscopia eletrônica de varredura em cupons de aço AISI 316 imersos por 40 dias em reatores contendo águas das praia de Manguinhos e Ilha do Boi ....................................................................................................... 56 Figura 21 - Composição química nos cupons de aço AISI 316 com adesão de biofilme da Ilha do Boi por meio de Espectrofotômetro em Energia Dispersiva (EDS) ...................................................................................... 58 Figura 22 - Composição química nos cupons de aço inoxidável AISI 316 com adesão de biofilme de de Manguinhos por meio de Espectrofotômetro em Energia Dispersiva (EDS) ...................................................................................... 60 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Número de Unidades Formadoras de Colônias por cm² nos cupons de aço 316 imersos por 40 dias em águas marinhas .................................... 38 Tabela 2 - Parâmetros físico-químicos das águas de Manguinhos e da Ilha do Boi . 44 Tabela 3 - Potenciais de corrosão e de pite com o desvio padrão. ........................... 47 Tabela 4 - Cálculo da taxa de corrosão pela perda de massa dos cupons de aços AISI 316 imersos por 40 dias nas águas de Manguinhos e da Ilha do Boi ................................................................................................................. 53 Tabela 5 - Comparação dos pontos de corrosão de cupons imersos em água da Ilha do Boi e de Manguinhos, de acordo com EDS ......................................... 62 LISTA DE SIGLAS AISI - American Iron and Steel Institute AFM - Microscopia de Força Atômica BVS - Biblioteca Virtual em Saúde CE - Contra eletrodo CIM - Corrosão Influenciada por Microrganismos CONAMA - Conselho Nacional de Meio Ambiente DeCS - Descritores em Ciências da Saúde ER - Eletrodo de referência ET - Eletrodo de trabalho EDS - Espectrofotômetro em energia dispersiva EIE - Espectroscopia de Impedância Eletroquímica Hz - Hertz IFES - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Espírito Santo IQA – Índice de Qualidade da Água ITPAC - Instituto Tocantinense Presidente Antônio Carlos MO - Microscopia ótica MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura MDD - Perda de massa por unidade de área, por unidade de tempo NTU - Unidade de Turbidez Nefelométrica OCP - Potencial de Circuito Aberto OD - Oxigênio Dissolvido PAP - Polarização Anódica Potenciodinâmica pH - Potencial Hidrogeniônico PET - Politereftalato de etileno p.p. - Pontos Percentuais UFC - Unidades Formadoras de Colônias VC - Voltametria cíclica LISTA DE SÍMBOLOS C - Carbono Cr - Cromo Cu - Cobre e- - Elétrons liberados Fe - Ferro H2 - Gás hidrogênio ou hidrogênio molecular H20 - Água Me - Metal Mez+ - Íon Metálico Ni - Níquel O - Oxigênio OH- - Hidroxila Ω - Ohm (Resistência) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15 2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 17 2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................... 17 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 17 3 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 18 3.1 ÁGUA MARINHA .............................................................................................. 18 3.2 BIOFILMES MICROBIANOS ............................................................................ 18 3.3 CORROSÃO .................................................................................................... 19 3.3.1 Biocorrosão .................................................................................................... 21 3.4 AÇO INOXIDÁVEL AISI 316 ............................................................................ 22 3.5 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS ........................................................................ 22 3.5.1 Curvas dePolarização Potenciodinâmica .................................................... 22 3.5.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ............................................ 24 3.6 ANÁLISES DE SUPERFÍCIE ........................................................................... 26 4 METODOLOGIA .............................................................................................. 29 4.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 29 4.2 DELINEAMENTO METODOLÓGICO ............................................................... 29 4.3 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO ................................................................ 29 4.4 AMOSTRAGEM DE ÁGUA MARINHA ............................................................. 30 4.5 MONTAGEM DO REATOR .............................................................................. 32 4.6 ANÁLISE FISICO-QUÍMICA DA ÁGUA ............................................................ 32 4.7 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS ..................................................................... 33 4.7.1 Enumeração de Unidades Formadoras de Colônias/cm² (UFC/cm²) ......... 33 4.7.2 Caracterização Morfológica dos Microrganismos ....................................... 33 4.7.3 Determinação de Coliformes Totais e Escherichia coli .............................. 33 4.8 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS ........................................................................ 34 4.8.1 Curvas de Polarização ................................................................................... 34 4.8.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ............................................ 35 4.9 Taxa de corrosão ............................................................................................. 35 4.10 Análises de Superfície ...................................................................................... 36 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 38 5.1 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS ..................................................................... 38 5.1.1 Unidades Formadoras de Colônias/cm² (UFC/cm²) ..................................... 38 5.1.2 Caracterização Morfológica ........................................................................... 39 5.1.3 Coliformes Totais e Escherichia coli ............................................................ 43 5.2 ANÁLISES FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA ....................................................... 44 5.2.1 pH .................................................................................................................... 44 5.2.2 Temperatura .................................................................................................... 45 5.2.3 OD .................................................................................................................... 45 5.2.4 Turbidez .......................................................................................................... 46 5.3 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS ........................................................................ 46 5.3.1 Curvas de Polarização ................................................................................... 46 5.3.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ............................................ 48 5.4 Taxa de Corrosão ............................................................................................. 52 5.5 ANÁLISES DE SUPERFÍCIE ........................................................................... 53 5.5.1 Microscopia Ótica........................................................................................... 53 5.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura e Espectrometria em Energia Dispersiva de Raios-X.....................................................................................55 6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 63 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................... 65 REFERÊNCIAS..................................................................................................66 APÊNDICES.......................................................................................................72 APÊNDICE A - Mapas da composição química nos cupons de aço imersos por 40 dias na água da Ilha do Boi por EDS ........................73 APÊNDICE B - Mapas da composição química dos cupons de aço imersos por 40 dias na água de Manguinhos por EDS......................75 15 1 INTRODUÇÃO O ambiente marinho é o mais corrosivo de todos os meios naturais e compreende desde a atmosfera envolvida com sal do mar até regiões mais profundas do oceano com o lodo no fundo do mar. Os componentes e estruturas que estão normalmente expostos aos meios marinhos são, por exemplo, as bombas e tubulações de água do mar, navios, submarinos, cais, estacas e plataformas de petróleo (PONTE, 2003). Os biofilmes são pequenos ecossistemas complexos e dinâmicos, formados por microrganismos envolvidos em uma matriz de polímeros orgânicos aderidos a uma superfície, configurando um modo protegido de desenvolvimento microbiano mediante as situações hostis. Microrganismos estruturados em biofilme demonstram uma preferência pelo processo de adesão em diversas superfícies inanimadas, incluindo aço inoxidável (RECH et al., 2013). O ambiente marinho é um ambiente propício para associação de microrganismos devido à velocidade das ondas, temperatura do ambiente, potencial eletroquímico de substratos metálicos imersos na água do mar e diversos outros fatores que propiciam essa interação. A formação da camada de biofilme na superfície considerada, altera as características físico-químicas da interface, incluindo a hidrofobicidade e a carga elétrica do substrato (MENEZES, 2012). Frequentemente, tem sido observado danos causados em estruturas que estão expostas a ambientes marinhos devido à corrosão e a bioincrustação, além do impacto ambiental causado e prejuízos às espécies marinhas (MENEZES, 2012). Dependendo do ponto de vista, os biofilmes podem ser benéficos ou nocivos, daí a necessidade de estudar sua formação nesse ambiente como um meio de determinação da resistência do mesmo, com o intuito de prevenir danos e proteger o material constituinte de estruturas instaladas em ambientes marinhos. Estima-se que o Brasil direciona cerca de 3,5% de seu Produto Interno Bruto (PIB) na busca de alternativas para contenção e reposição de materiais deteriorados. Dados também apontam que 25% da produção anual de aço do país são destinados somente à substituição das estruturas danificadas pela corrosão. Outro problema é que o descarte indevido do material danificado gera um grande acúmulo de sucata (MELLO; ÁVILA; SILVA, 2015). 16 À vista disso, justifica-se o estudo da comunidade microbiana em superfície de aço por números, imagens microscópicas e ensaios de eletroquímicos, o que pode esclarecer sobre a formação de biofilmes e possíveis danos associados à corrosão da superfície do aço. 17 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Estudar o biofilme e o potencial de corrosão em aço inoxidável AISI 316 imerso por 40 dias, em águas marinhas renovadas. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar a adesão de microrganismos em termos de número de unidades formadoras de colônias por cm² (UFC/cm²) na superfície dos cupons de aço. • Isolar e caracterizarmorfologicamente os microrganismos formadores de biofilme presentes no material. • Medir os potenciais de corrosão e a resistência do biofilme ao longo da superfície dos cupons. • Determinar a perda de massa do material em estudo. • Analisar e comparar imagens do biofilme formado na superfície por microscopias ótica estereoscópica e eletrônica de varredura. • Realizar uma microanálise por espectrometria em energia dispersiva (EDS) de elementos químicos presentes na superfície do aço com biofilme. 18 3 REVISÃO DE LITERATURA Além dos grandes esforços hoje realizados para se manter em dia os planos de manutenção dos navios, é necessário também buscar soluções para os problemas causados pelo meio ambiente, como, a corrosão e a bioincrustação em estruturas na água do mar (MENEZES, 2012). O que levam a fenômenos como a possível mortandade de peixes e espécies marinha além da vulnerabilidade quanto a qualidade da água e a balneabilidade. 3.1 ÁGUA MARINHA A água do mar contém cerca de 3,4% de sais dissolvidos e é levemente alcalina (pH ≅ 8,0). Devido a isto, ela é um bom eletrólito e pode causar, portanto, corrosão. A corrosão em água do mar é afetada pela velocidade e temperatura da água, pelo seu conteúdo de oxigênio e pelos seus organismos vivos, dentre outros fatores (PONTE, 2003). 3.2 BIOFILMES MICROBIANOS Em geral os microrganismos não vivem dispersos em células individuais como culturas puras; em vez disso, se acumulam nas interfaces para formar agregados polimicrobianos, tais como filmes, flocos e lodos ou estruturas chamadas de biofilmes (FLEMMING; WINGENDER, 2010). Os biofilmes formados nas superfícies dos instrumentos, tubulações, superfícies marinhas e outras se tornam inconvenientes pois, por conferirem maior resistência aos agentes sanitizantes, acabam por se implantar nessas superfícies, propiciando espaço e condições para a proliferação de microrganismos, tanto patogênicos quanto deteriorantes (FUSTER-VALLS et al., 2008). Além disso, os microrganismos formadores de biofilmes podem gerar a corrosão das superfícies de tais equipamentos, reduzindo sua vida útil (MANSFELD, 2007). Estudos comparativos sobre a dinâmica de composição de biofilmes em estágio inicial são desafiadores, porque diferentes locais de imersão estão associados às diferenças nas condições ambientais (como os nutrientes, a temperatura, a hidrodinâmica e a composição química da água). Todos os quais influenciam a ecofisiologia planctônica e de biofilme (SALTA et al., 2013). 19 3.3 CORROSÃO Nos processos de corrosão estão envolvidas reações de oxido-redução, no que ocorre perda de elétrons por uma espécie e ganho de elétrons por outra, sem que haja acúmulo de carga elétrica. Na reação de oxidação, chamada de reação anódica, o metal é dissolvido e transferido para a solução na forma de íons metálicos - reação 1. Na reação de redução, denominada de reação catódica, o oxigênio é geralmente reduzido em soluções aeradas - reações 2 e 3. Em soluções não aeradas ocorre a produção de hidrogênio molecular - reações 4 e 5 (FELIPE et al., 2013). Reação Anódica: (1) Reações Catódicas: Em meio aerado: Neutro ou básico: (2) Ácido: (3) Em meio não aerado: Neutro ou básico: (4) Ácido: (5) A figura 1 mostra um esquema representativo de corrosão em meio aquoso, em que a superfície do metal é o catodo e o centro da gota é o anodo (na região da gota, ocorre oxidação do ferro). As reações de caráter anódico e catódico ocorrem simultaneamente, com passagem de elétrons da região anódica para a catódica através do metal (FELIPE et al., 2013). 20 Figura 1 - Esquema representativo do processo corrosivo de caráter eletroquímico Fonte: FELIPE et al. (2013). Com o crescente avanço tecnológico, a demanda por produtos resistentes à corrosão é significativa. No Brasil, os gastos com produtos e tratamentos de combate à corrosão chegam a aproximadamente 35 bilhões de reais por ano (MELLO; ÁVILA; SILVA, 2015). Assim, práticas de controle da corrosão podem reduzir em média 20% de custos relacionados com aspectos diretos, como manutenção e/ou substituição de peças e equipamentos, ou indiretos, como paralisações acidentais em função da perda de eficiência dos equipamentos, contaminação do produto, perda da produção e eventual comprometimento da segurança pessoal e ambiental (FELIPE et al., 2013). Atualmente, os principais biomateriais com cobertura para o revestimento de superfícies metálicas disponíveis no mercado são aqueles com revestimentos a base de antissépticos ou antibacterianos. Entretanto, um dos principais desafios é obter “in vivo” a efetividade encontrada nos experimentos “in vitro”, principalmente em períodos de uso mais prolongados (TRENTIN; GIORDANI; MACEDO, 2013). Considerando os produtos naturais, o revestimento de superfícies com produtos vegetais bioativos também está sendo investigado, sendo que um dos principais desafios é a manutenção da atividade biológica de um composto quando ele está retido em uma superfície (TRENTIN; GIORDANI; MACEDO, 2013). 21 Com dados sobre a taxa de corrosão de um determinado material, pode-se determinar a agressividade de um meio corrosivo, como também estimar a vida útil de um equipamento. Estes valores de taxa são influenciados por características ambientais, químicas (gases dissolvidos, salinidade, pH), físicas (velocidade, temperatura e pressão) ou biológicas (microrganismos e macrorganismos) do meio (GENTIL, 2011). Por isso, torna-se importante o estudo da corrosão em ambientes com diferentes características, sejam elas químicas, físicas ou biológicas para servirem de base no controle da corrosão nesses ambientes. 3.3.1 Biocorrosão Os termos biocorrosão e corrosão microbiana tendem a sugerir que os microrganismos são a principal causa da corrosão, enquanto corrosão influenciada por microrganismos (CIM) sugere um envolvimento de microrganismos que podem ou não ser direto. As palavras "influenciado" e "induzido" são ambíguas. Algumas pessoas tendem a culpar os problemas de corrosão para os quais não têm respostas claras (mesmo antes de os mecanismos de corrosão convencionais serem investigados minuciosamente) à CIM apenas porque os microrganismos são encontrados em locais de corrosão (GU, 2012). Uma das causas da biocorrosão é a corrente que passa entre os picos e vales de uma superfície rugosa. Os microrganismos utilizam essas fissuras para se aderirem preferencialmente (DREESZEN, 2003). Albuquerque, Andrade e Neves (2014) apresentaram os métodos mais comuns aplicados para controle da biocorrosão e formação de biofilmes. Por exemplo, “green molecules” como enzimas, extratos vegetais, bacteriófagos, biosurfactantes e bactérias isoladas de organismos marinhos. A desagregação de biofilme pode ser a chave para o controle dos efeitos nocivos causados pelos microrganismos indesejáveis na indústria do petróleo. Marangoni (2010) isolou e identificou microrganismos presentes em corpos de prova metálicos instalados em estações de corrosão em duas Usinas Hidrelétricas (Usina Hidrelétrica de Balbina – Presidente Figueiredo/AM e UsinaHidrelétrica de Salto Pilão – Ibirama/SC). O aço carbono foi o metal mais afetado pela biocorrosão e também apresentou maior diversidade de microrganismos. Foi verificado que com a 22 utilização de técnicas de metagenômica é possível acelerar o processo de identificação das bactérias redutoras de sulfato envolvidas com o “biofouling” e biocorrosão. Ele ainda observou que, apesar de serem ambientes diversos, com reservatórios de profundidades diferentes e condições climáticas também diferentes, foram observados padrões semelhantes com relação ao ataque das superfícies metálicas. Ambos os experimentos tiveram a liga de aço carbono extremamente atacada e foram detectados os mesmos gêneros para bactérias redutoras de sulfato. 3.4 AÇO INOXIDÁVEL AISI 316 O aço inoxidável AISI 316 é uma liga caracterizada pelos elevados teores de cromo e níquel, além da adição de molibdênio, que aumentam sua resistência à corrosão, pois esses elementos atuam formando uma camada de óxido autopassivante, tornando-o resistente em ambientes oxidantes. Esta liga é utilizada nos mais diversos segmentos industriais, como em sistemas de distribuição de água, indústrias de papel, petrolífera e alimentícia (MORAES, 2009). De acordo com a Associação Brasileira do Aço Inoxidável (2012), a composição química do aço inoxidável 316 é 16-18% de Cromo (Cr), 10-14% de Níquel (Ni), 2% de Manganês (Mn), 1% Silício (Si), 0,08% de Carbono (C), 0,045% de Fósforo (P), 0,030% de Enxofre (S), 2-3% Molibdênio (Mo) e o restante de Ferro (Fe). 3.5 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS Os ensaios eletroquímicos são ferramentas importantes para avaliar o comportamento dos materiais frente à corrosão em diferentes meios. Ensaios eletroquímicos consistem em curvas de polarização, resistência à polarização linear, espectroscopia de impedância eletroquímica, entre outros. 3.5.1 Curvas de Polarização Potenciodinâmica Para obter a curva de polarização potenciodinâmica é preciso impor experimentalmente o material metálico a um potencial diferente do seu potencial de corrosão, por meio de fontes externas, como por exemplo o equipamento de potenciostato. Através do potenciostato é possível impor o material ao potencial desejado e também medir a variação da densidade de corrente elétrica por meio da montagem de uma célula de três eletrodos: eletrodo de trabalho (ET), eletrodo de referência (ER) e o contra eletrodo ou eletrodo auxiliar (EA). O metal estudado é o 23 eletrodo de trabalho, a medição do potencial é feita com um eletrodo de referência e o contra eletrodo é utilizado para fixar o circuito de uma pilha eletrolítica (NUNEZ, 2006). A figura 2 ilustra esquematicamente o arranjo para o levantamento das curvas de polarização por meio de um potenciostato. Figura 2 - Arranjo experimental para o levantamento das curvas de polarização por meio de um potenciostato Fonte: NUNEZ (2006). A Figura 3 ilustra uma curva de polarização potenciodinâmica hipotética de um material que sofre passivação. Pode-se dividir a curva de polarização potenciodinâmica em três regiões: ativa, passiva e transpassiva. Na região ativa ocorrem duas reações: catódica de redução e anódica de oxidação (LIMA, 2007). O sistema se encontra em estado estacionário uma que a taxa do processo de oxidação é exatamente igual à do processo de redução. A partir de certo ponto, a corrente sofre um rápido decréscimo com o aumento do potencial. Esse comportamento corresponde ao início da região passiva, na qual a corrente se mantém muito baixa em uma determinada faixa de potencial (LIMA, 2007). Em um determinado potencial a corrente começa a aumentar novamente: esta é a região transpassiva, onde a barreira criada pelo filme óxido é quebrada. Em soluções de concentrações suficientemente agressivas, há a formação de pites. Baixas correntes na região passiva indicam um alto grau de passivação. A região passiva em potenciais mais positivos indica um filme passivo mais estável (LIMA, 2007). 24 Figura 2 - Curvas de polarização potenciodinâmica hipotética para um sistema que apresenta passivação com as regiões anódica e catódica Fonte: LIMA (2007). 3.5.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica De acordo com Gussow (1997), a impedância é a soma fasorial entre resistência e reatância, seja indutiva, capacitiva ou as duas. Assim, a técnica de impedância visa observar e modelar resultados de uma amostra em função das características elétricas, fazendo o uso de elementos que não geram tensão elétrica ou corrente, como no caso de resistências, capacitores e indutores. O teste de impedância eletroquímica consiste na aplicação de um potencial alternado senoidal V(t) em um sistema. Posteriormente, obtém-se uma corrente senoidal que será proporcional a uma medida de impedância (VIANA, 2012). O resultado é expresso pela fórmula abaixo: Z= onde Z é expresso em Ω 25 A impedância irá depender do tipo do material utilizado e da solução em que a amostra se encontra (VIANA, 2012). Na figura 4 é representado um modelo de circuito que simula a resistência da solução e da amostra, juntamente com a capacitância de dupla camada (por ter a camada protetora do aço e o biofilme). Na figura 5, mostra o diagrama de Nyquist. O diagrama é um plano complexo - real imaginário de coordenadas cartesianas, em que se tem na abscissa a parte real - termos resistivos e na ordenada a parte imaginária - termos capacitivos ou indutivos (RIBEIRO; SOUZA; ABRANTES, 2015). Figura 3 - Circuito Randles modificado com duas constantes de tempo Fonte: RIBEIRO; SOUZA; ABRANTES (2015). Re - representa a resistência da solução e do filme do produto de corrosão C1 e R1 - capacitância e resistência do revestimento C2 - capacitância da dupla camada R2 - é a resistência à transferência de carga, que determina a taxa da reação de corrosão O circuito equivalente proposto por Randles, tem uma larga aplicação em muitos sistemas eletroquímicos. Nele, Re representa a resistência da solução e do filme do produto de corrosão, que também é conhecido como a resistência ôhmica do eletrólito entre o ponto sensitivo de voltagem do eletrodo de referência e a interface eletrodo/eletrólito (RIBEIRO; SOUZA; ABRANTES, 2015). 26 Figura 4 - Diagrama de Nyquist Fonte: RIBEIRO; SOUZA; ABRANTES (2015). Uma vez construído o diagrama de Nyquist, faz-se a extrapolação da parte direita do semicírculo até encontrar o eixo horizontal. O diâmetro do semicírculo é a resistência à transferência de carga (Rt), equivalente à resistência de polarização (Rp). Assim, quanto maior o diâmetro deste semicírculo, maior a resistência Rp e, consequentemente, menor a taxa de corrosão (RIBEIRO; SOUZA; ABRANTES, 2015). 3.6 ANÁLISES DE SUPERFÍCIE A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é um método de análise de superfície de alta resolução de imagem, que usa elétrons na formação da imagem, tal como o microscópio óptico usa a luz visível. A vantagem da MEV sobre a microscopia óptica inclui a alta magnificação e a profundidade de campo. As informações quanto à análise química qualitativa e quantitativa são também obtidas usando-se o espectrofotômetro em energia dispersiva de raios-X (EDS) associada à MEV (CAVALCANTE, 2010). Estudo de biofilme é de grande importância em todas as áreas, seja ambiental, médica, alimentícia e outras. Neves et al. (2015) analisaram,por meio de Microscopia de Força Atômica (AFM), a adesão de microrganismos na superfície do aço. O estudo mostra que a altura média pico a pico do aço em branco, sem crescimento de biofilme foi aproximadamente 37 nm; já após 21 dias de estudo com o crescimento microbiano, a altura média pico a pico era de 675 nm. Resultados indicam que a diferença da altura média pico a pico é devido a formação de biofilmes e supostamente a ocorrência de um processo de corrosão no aço. 27 Analises de adesão de microrganismos em quatro tipos de superfícies (vidro, PET, aço inoxidável 304 e 316) em água marinha foram feitas por Neves et al. (2014). No qual determinaram o número de unidades formadoras de colônia/cm² (UFC/cm²), indicando o aumento da colonização de todas as superfícies em todas as semanas de estudo. Imagens por microscopia ótica estereoscópica revelaram a alteração na coloração dos núcleos de biofilme no decorrer das semanas de estudo. Técnicas eletroquímicas e microscópicas podem esclarecer a ação dos biofilmes na superfície do aço. Moraes (2009) estudou a influência da Escherichia coli na corrosão do aço AISI 316, com o uso de técnicas de potencial de circuito aberto (OCP), polarização anódica potenciodinâmica (PAP), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE), microscopia óptica (MO), voltametria cíclica (VC) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados obtidos nas curvas de PAP para o pH 7 revelaram que o aço AISI 316 é passivo até 0,95V. As EIE confirmaram que a resistência do aço AISI 316 diminui com o aumento da concentração de bactérias. As micrografias para os três valores de pH estudados revelaram a formação de biofilme sobre a superfície do metal, bem como o surgimento de corrosão, comprovada por voltametria cíclica. A análise de superfície com uso de MEV elucidou que o tipo de corrosão que o aço inoxidável AISI 316 sofre na presença da E. coli é localizada com formação de pits. O autor concluiu que a região onde o biofilme fica aderido torna-se pouco oxigenada, fazendo com que o aço perca a capacidade de formar a camada de óxido autopassivante, tornando-se susceptível a corrosão. Ao estudar a influência de microrganismos no processo de corrosão eletroquímica em cupons de aço carbono SAE 1005 imersos em água marinha, Menezes (2012) utilizou medidas eletroquímicas, caracterização dos produtos de corrosão, microscopia eletrônica de varredura (associada a detectores de energia dispersiva de raios-X) e avaliação da estrutura da comunidade bacteriana por sequenciamento de DNA. Seus estudos indicaram correlações entre a natureza dos produtos de corrosão, medidas eletroquímicas e a natureza dos microrganismos. A pesquisa mostrou uma condição redutora no início da exposição, evoluindo para condições mais oxidantes nos primeiros instantes da imersão. 28 Muitos trabalhos na literatura também usam a metodologia da montagem do biorreator “off-site” devido à dificuldade de experimentos in loco por subtração dos equipamentos. Menezes (2012) analisou cupons em aço carbono SAE 1005 que foram imersos de modo equitativo em seis tanques de 250 L, cada um. A água do mar no interior dos tanques foi mantida em recirculação durante os 15 dias de ensaios. Da mesma forma Dantas (2009) conduziu experimentos sobre corrosão de cupons metálicos de aço carbono em sistemas estáticos por biorreatores com troca de água a cada 15 dias. 29 4 METODOLOGIA 4.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA A revisão bibliográfica foi realizada por meio de buscas no Portal de Periódicos Capes, que disponibiliza uma consulta integrada em bases de dados científicas como a Scielo e Web of Science. Além disso, banco de teses e dissertações do Portal, livros e anais de congressos também foram utilizados para complementar a pesquisa. Os descritores “Biofilms” ou “Biofilmes”, “Corrosion” ou “Corrosão”, “Stainless Steel” ou “Aço Inoxidável”, “Marine Water” ou “Água Marinha” foram escolhidos de acordo com a lista de Descritores em Ciências da Saúde (DeCS), da Biblioteca Virtual em Saúde (BVS). Todo material encontrado foi fichado eletronicamente no Software EndNoteWeb para o gerenciamento das referências bibliográficas. 4.2 DELINEAMENTO METODOLÓGICO De acordo com o Instituto Tocantinense Presidente Antônio Carlos (2011), existem vários tipos de pesquisas e podemos classificá-las de acordo com a sua natureza, a forma de abordagem do problema, os procedimentos técnicos e quanto ao local de aplicação/realização. Do ponto de vista da sua natureza, o presente trabalho classifica-se como pesquisa aplicada, por produzir conhecimentos práticos dirigidos à solução de problemas específicos. De acordo com abordagem do problema, a pesquisa é do tipo pesquisa quantitativa. Em relação aos procedimentos técnicos, trata-se de uma pesquisa experimental e quanto ao local de aplicação/realização é uma pesquisa laboratorial. 4.3 PREPARO DOS CUPONS DE AÇO Vinte Cupons de aço inoxidável AISI 316 já polidos com dimensões de 20x50x1,8 mm, foram limpos individualmente com acetona pura, imersos em detergente neutro por 1 hora, enxaguados com água destilada e lavados com álcool 70% (v/v). Em seguida, foi feita uma lavagem adicional com água destilada e secos com secador (modificado de RASSONI; GAYLARDE, 2000). 30 Para facilitar a suspensão dos cupons sobre os reatores e permitir os ensaios eletroquímicos, eletrodos de cobre recobertos com capa isolante foram fixados nos cupons de aço (figura 6). Posteriormente, os cupons de aço foram mantidos até a imersão nos reatores de água do mar para início dos ensaios. Figura 5 - Fotografia apresentando o cupom de aço pronto para imersão Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 4.4 AMOSTRAGEM DE ÁGUA MARINHA As amostras de água foram coletadas semanalmente (sempre nas mesmas praias) durante 40 dias com o uso de bombonas de 10L cada. As praias de coleta foram Praia Grande, localizada na Ilha do Boi, Vitória, ES (figura 7) e a Praia da Enseada, localizada em Manguinhos, Serra, ES (figura 8). A coleta da água e os experimentos foram realizados nos meses de abril e maio de 2016. A Ilha do Boi está localizada entre os portos de Vitória e Tubarão, importantes locais de passagem de navios e embarcações. Manguinhos está localizada no município da Serra, que se situa fora da área portuária. 31 Figura 6 - Mapa da localização da Ilha do Boi (Vitória-ES) Fonte: GOOGLE MAPS (2016). Figura 7 - Mapa da localização de Manguinhos (Serra-ES) Fonte: GOOGLE MAPS (2016). 32 4.5 MONTAGEM DO REATOR Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Biotecnologia e Sustentabilidade (LABIOTECS) do Ifes - Campus Vitória por 40 dias, em dois sistemas estáticos abertos (biorreatores) com capacidade de 15L cada com 10 cupons cada. Foi feita a renovação semanal da água do mar para simular o ambiente natural. Os cupons de aço foram suspensos no estilo varal de modo a ficarem imersos na água contida no biorreator. A água do biorreator foi circulada com bombinhas de aquário para uma melhor oxigenação (figura 9). Figura 8 - Cupons de aço imersos em biorreatores contendo água do mar Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 4.6 ANÁLISE FISICO-QUÍMICA DA ÁGUA As amostras da água do mar foram analisadas quanto ao pH, temperatura, oxigênio dissolvido (OD) e turbidez. As análises foram feitas no momento de coleta na água do mar e depois de 40 dias de estudo nos reatores. O pH, temperatura e turbidez foram determinados por método direto com o auxílio de potenciômetro (TECNOPON modelo mPA-210), termômetro com escala 0-200°C e precisãode 1°C e turbidímetro (PoliControl modelo AP 2000), respectivamente. OD foi determinado pelo método de Winkler modificado pela azida, disponível no 33 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA/AWWA/WEF, 2005) e os cálculos foram feitos por estequiometria. Em todas as análises foram feitas três determinações (triplicatas) e então foi obtida a média entre elas. 4.7 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 4.7.1 Enumeração de Unidades Formadoras de Colônias/cm² (UFC/cm²) Após o período de imersão de 40 dias nos reatores contendo água do mar, os corpos de prova foram retirados com pinça esterilizada, lavados delicadamente em água esterilizada para a retirada de células não aderidas. A coleta do material aderido nos cupons foi realizada em triplicata e com o uso de três swabs esterilizados. Os swabs foram colocados em tubos com água peptonada esterilizada (0,1% p/v), agitados (em agitador tipo Vortex durante 30 segundos) e depois feitas diluições de 10-1 a 10-6. Um volume de 0,1 mL foi inoculado em meio Ágar Padrão para Contagem (PCA) e Ágar Sabouroud (AS) e incubados em estufa durante 24h a 35°C para contagem global de microrganismos aeróbios mesófilos heterotróficos e 25°C para a contagem de bolores e leveduras (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997). O resultado foi expresso pela fórmula abaixo: Sendo o volume inoculado em mL. 4.7.2 Caracterização Morfológica dos Microrganismos Culturas isoladas foram obtidas a partir das placas de UFC/cm² e as lâminas preparadas pela técnica da coloração diferencial de Gram com objetivo de caracterizar morfologicamente os isolados (KONEMAN et al., 2008). 4.7.3 Determinação de Coliformes Totais e Escherichia coli Avaliou-se a qualidade microbiológica da água do reator após os 40 dias de estudo utilizando-se o método de presença ou ausência de coliformes totais e Escherichia 34 coli através do uso de substrato cromogênico, preconizado pelo Standard Methods of the Examination of Water and Wastewater (APHA/AWWA/WEF, 2005). As amostras da água do reator foram coletadas com frascos esterilizados de capacidade para 100 mL e foram incubadas em estufa durante 24h à 35°C. Foram utilizados os substratos cromogênicos Colilert e Colitag, com o intuito de se obter resultados mais confiáveis. 4.8 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS 4.8.1 Curvas de Polarização Os cupons de aços foram submetidos a ensaios de polarização em solução de NaCl 3,5%, utilizando três eletrodos: o eletrodo de referência - calomelano, o contra- eletrodo - platina e o eletrodo de trabalho - amostra com biofilme (RODRIGUES et al., 2012), (figura 10). Figura 9 - Célula eletrolítica montada para o levantamento das curvas de polarização e impedância eletroquímica Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 35 Para a realização das medidas de polarização, foi utilizado o potenciostato AUTOLAB (modelo PGSTAT302N) e software Nova 2.0. Foram obtidos dados utilizando-se o Potencial de Circuito Aberto (OCP) por 30 minutos. A seguir, procedeu-se a uma determinação da polarização linear aplicando uma faixa de potencial de -1,0/1,5 V e taxa de varredura de 1,667 mV/s. Posteriormente os gráficos foram plotados no Software Origin 6.0 4.8.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica As medidas foram realizadas com a mesma célula eletrolítica da polarização e potenciostato AUTOLAB (modelo PGSTAT302N) e software Nova 2.0, os gráficos posteriormente plotados no software Origin 6.0. A espectroscopia de impedância eletroquímica foi realizada com o valor do OCP, na frequência de 10.000 a 0,04 Hz e amplitude de 0,01. Os testes de impedância possibilitaram a análise da resistividade e capacitância do biofilme. 4.9 Taxa de corrosão Cupons de aço AISI 316 foram pesados em balança de precisão (modelo AL 500 Marte) antes do início do experimento e após os 40 dias de imersão em água do mar, com a retirada do biofilme e com o tratamento apropriado. O tratamento dos cupons consistiu na decapagem ácida com solução de Clarke (ácido clorídrico + 50g/L cloreto estanoso + 20g/L trióxido de antimônio) por um tempo de 5 a 10 minutos seguindo a NBR 9771/1987 (figura 11). Passado o tempo da decapagem, os cupons foram lavados com água destilada, acetona PA, uma lavagem adicional de água e depois secos com secador. Após a decapagem, os aços foram pesados novamente na balança para análise da perda de massa dos cupons. A determinação foi feita em triplicata das amostras e posteriormente foi calculada a média. 36 Figura 10 - Cupons de aço AISI 316 antes do início do experimento e após a decapagem Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). Como a perda de massa é influenciada pela área exposta e tempo de exposição, essas variáveis foram combinadas e expressas em taxa de corrosão (FERREIRA et al., 2002). De acordo com Associação Brasileira de Corrosão (2013) os valores das taxas de corrosão podem ser expressos pela redução de espessura do material por unidades de tempo (em mm/ano) e/ou pela perda de massa por unidade de área, por unidade de tempo em mg/dm2/dia (mdd). mm/ano: ou mdd: Sendo: : perda de massa, em mg; S: área exposta, em cm2; t: tempo de exposição, em dias e massa específica do material, em g/cm3. ρ: massa específica do aço 4.10 Análises de Superfície Os cupons de aço imersos em água do mar por 40 dias foram observados a fresco em microscópio estereoscópico (Leica, modelo EZ4 HD, Alemanha) com ampliação 37 visual de 8x, 10x, 12,5x, 16x, 20x, 25x, 30x e 35x e sistema de captura LAS EZ. 2.0.0. Além disso, os cupons com biofilme sem metalização foram analisados por Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) (Zeiss, modelo EVO MA10, Alemanha) com tensão de aceleração 30 kV e magnificação de 2,5 kX, 10 kX e 20kX integrado ao EDS com software AZtec, Oxford. Com o EDS pretendeu-se realizar a identificação e o mapeamento da distribuição dos elementos químicos com a geração de gráficos e mapas da composição dos elementos desejados no aço com a adesão microbiana. 38 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS 5.1.1 Unidades Formadoras de Colônias/cm² (UFC/cm²) A tabela 1 mostra a enumeração do número de UFC/cm2 foi realizada nos cupons de aço imersos por 40 dias em água das praias de Manguinhos e Ilha do Boi. Foram feitas contagem global de microrganismos aeróbios mesófilos heterotróficos e a contagem de bolores e leveduras. Tabela 1 - Número de Unidades Formadoras de Colônias por cm² nos cupons de aço 316 imersos por 40 dias em águas marinhas *A contagem foi feita com menos de 30 colônias Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). De acordo com número de UFC/cm² constatou-se um número maior na contagem global de microrganismos aeróbios mesófilos heterotróficos em Manguinhos comparado com a Ilha do Boi. Este resultado pode estar relacionado ao fato de que em Manguinhos a diversidade de microrganismos ter sido maior no que refere à classificação morfológica (figura 13). Como por exemplo as Cianobactérias que foram isoladas na água de Manguinhos e ausentes na Ilha do Boi. Quanto à contagem de bolores e leveduras, observou-se um número maior na Ilha do Boi quando comparado com Manguinhos, possivelmente pela água da Ilha do Boi ser um ambiente mais antropizado, com maior circulação de embarcações, e possivelmente por apresentar maior quantidade de matéria orgânica. Os bolores são fungos filamentosos que obtêm sua nutrição a partir de matéria orgânica disponível no ambiente e as leveduras são fungos não filamentosos queestão bem difundidos na natureza sendo disseminados principalmente pelo vento e pelas correntes aéreas (TORTORA; FUNKE; CASE, 2010). Neves e Korres (2016a) estudaram a formação de biofilmes em aços inoxidáveis 304 e 316 imersos na posição horizontal por 21 dias em águas de dois ambientes Fonte de Água Contagem Global de Microrganismos Aeróbios Mesófilos Heterotróficos (em UFC/cm²)* Contagem de Bolores e Leveduras (em UFC/cm²)* Ilha do Boi 2,5.10² 4,0.10² Manguinhos 3,5.10² 2,0.10² 39 marinhos, Ilha do Boi e Manguinhos. O número de UFC/cm² foi medido semanalmente e dados revelam que até na segunda semana de estudo a adesão era maior no aço 316, em aços imersos na água da Ilha do Boi. A partir da terceira semana houve uma inversão na adesão que passou a ser menor no aço 316 comparado com o 304, mostrando a sucessão microbiana na superfície dos cupons. O presente estudo observou-se que fatores como a posição dos cupons, circulação e a renovação da água são determinantes para adesão microbiana e a formação de biofilmes. Neves e Korres (2016b) também estudaram a formação de biofilme no aço inoxidável 304 com 28 dias imersos na forma horizontal em água da Ilha do Boi. Observou-se que o número de UFC/cm² diminuiu expressivamente da ordem de 9,15 x 105 na terceira semana para 8,74 x 105 na quarta semana. Estudos esclarecem o motivo do baixo valor de UFC/cm² no presente trabalho com 40 dias de estudo, possivelmente pela disposição dos aços na posição vertical, dificultando o depósito de sedimentos como areia e outros. Além disso, pode-se relacionar o menor número de UFC/cm² com a adiantada fase da colonização inicial do suporte pela comunidade microbiana. A formação de biofilmes inclui etapas de sucessão microbiana que vão determinar a variação em número e tipos de microrganismos colonizadores (JENKINSON; LAPPIN-SCOTT, 2001). Os estágios iniciais do desenvolvimento de comunidades incrustantes caracterizam- se somente pelo estabelecimento de microrganismos, por isto denominadas de comunidades de microincrustantes ou de microfouling. Posteriormente, uma comunidade de organismos macroscópicos desenvolve-se sobre a microincrustação, incluindo cracas, briozoários, ascídias, esponjas e macroalgas, dentre outros (GAMA; PEREIRA; COUTINHO, 2009). Essa evolução poderá levar a grandes prejuízos às indústrias. 5.1.2 Caracterização Morfológica A caracterização morfológica dos isolados microbianos permitiu avaliar a forma, o arranjo e a reação à técnica de coloração diferencial de Gram. Foi possivel observar 40 estreptobacilos Gram positivos, estafilococos Gram positivos e bacilos Gram negativos como morfotipos microbianos da Ilha do Boi (figura 12). Como morfotipos microbianos isolados da superfície do aço imerso em água da praia de Manguinhos, estafilobacilos Gram positivos, estafilococos Gram positivos, bacilos Gram positivos, bacilos finos Gram negativos e dois tipos de cianobactérias (figura 13). Figura 11 - Morfotipos microbianos de cupons de aço imersos por 40 dias em reatores com água da Ilha do Boi Aumento 100x Estreptobacilos Gram Positivos Estafilococos Gram Positivos Bacilos Gram Negativos Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 41 Figura 12 - Morfotipos microbianos de cupons de aço imersos por 40 dias em reatores com água de Manguinhos Aumento 100x Aumento 100x Estafilobacilos Gram Positivos Bacilos Finos Gram Negativos Estafilococos Gram Positivos Cianobactérias Tipo 1 Bacilos Gram Positivos Cianobactérias Tipo 2 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 42 Pedrós-Alió e Brock (1983) afirmaram que a disponibilidade de substrato, a força de corrente ou fluxo da água do sistema e a alimentação pelo zooplâncton são variáveis que podem influenciar na disponibilidade das bactérias na água em ambientes naturais. Neves e Korres (2016a) avaliaram a caracterização dos isolados microbianos em aços inoxidáveis 304 e 316 imersos em sistemas estáticos abertos contendo água do mar, sem renovação e sem circulação da água por 21 dias. A caracterização dos isolados da superfície de aços imersos na água de Manguinhos mostrou cocos Gram positivos em vários arranjos e leveduras como morfotipos microbianos e já a praia da Ilha do Boi mostrou leveduras e estafilococos. No presente trabalho, a troca semanal da água e a circulação da água simulando o ambiente natural, influenciaram na diversidade de microrganismos, não encontradas em outros trabalhos. Essa diversidade foi encontrada principalmente nos cupons imersos na água de Manguinhos. A caracterização morfológica mostrou a presença de cianobactérias somente nos aços imersos na água de Manguinhos. Estas estiveram ausentes na Ilha do Boi possivelmente pelo predomínio de fungos na superfície do aço imerso em água desse ambiente. Segundo Azevedo (1998), as cianobactérias são microrganismos aeróbicos fotoautotróficos. Seus processos vitais requerem somente água, dióxido de carbono, substâncias inorgânicas e luz. A fotossíntese é seu principal modo de obtenção de energia para o metabolismo. A origem das cianobactérias foi estimada em cerca de 3,5 bilhões de anos pela descoberta de fósseis, em rochas sedimentares encontradas no noroeste da Austrália. As cianobactérias estão, portanto, entre os organismos pioneiros na Terra, sendo provavelmente os primeiros produtores primários de matéria orgânica a liberarem oxigênio elementar na atmosfera primitiva. Em ecossistemas aquáticos, mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilmes associadas a uma grande variedade de superfícies. Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogêneos, compostos por duas ou mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o crescimento das demais e a adesão de uma dada espécie fornecer substâncias que promovem a ligação de 43 outras. Inversamente, a competição pelos nutrientes e a acumulação de metabólitos tóxicos produzidos pelas espécies colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num biofilme (IST, 2008). Salta et al. (2013) observaram que os biofilmes microbianos podem modificar e/ou mascarar as propriedades e topografias das superfícies, o que declara a necessidade de controlar ainda mais essas complexas comunidades. Em geral, os biofilmes marinhos estão associados a uma vasta gama de estruturas de engenharia. Entretanto, há muito pouca informação publicada sobre a composição do biofilme marinho e a complexidade dos mesmos, pois em cada ambiente observa-se um tipo diferente de composição dos biofilmes. É muito importante ressaltar que alguns microrganismos existentes na natureza são difíceis de se cultivar em meios artificiais em laboratório, sendo apenas detectados pela presença de seu material genético pela técnica da Metagenômica. 5.1.3 Coliformes Totais e Escherichia coli Os resultados não apresentaram fluorescência azul sob luz ultravioleta para ambos ambientes (Ilha do Boi e Manguinhos), o que indica ausência de Escherichia coli nas amostras. Escherichia coli é o indicador da contaminação fecal de ambientes, o que significa que, quando detectada, indica a presença de patógenos. Mesmo a caracterização morfológica indicando bacilos Gram negativos nos aços imersos na água de Manguinhos e bacilos finos Gram negativos nos aços imersos na água da Ilha do Boi, os resultados indicaram ausência de Escherichia coli, portanto ausência de patógenos nos dois ambientes. A análise de balneabilidadeavalia a qualidade dos corpos d’água. A Resolução CONAMA nº 274/00 estabelece a condição de balneabilidade das águas avaliadas nas categorias de própria e imprópria, sendo que as próprias são subdividas em excelente, muito boa e satisfatória. De acordo com o banco de dados do Instituto Estadual do Meio Ambiente (2015), o último período de amostragem disponível para a balneabilidade da Praia da Enseada, localizada em Manguinhos classifica a água quanto excelente. O banco de dados da Prefeitura de Vitória (2016) possui dados semanais atualizados, dados da 44 primeira semana de dezembro 2016 classifica a água da Praia Grande, localizada na Ilha do Boi como própria, porém não como excelente, pois dados frequentes revelam a água da Ilha do Boi como imprópria para banho. Assim, a manutenção da água dos dois ambientes avaliados em reatores mostrou que não houve o desenvolvimento de microrganismos indicadores da contaminação fecal. 5.2 ANÁLISES FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA Analisar os parâmetros da água é de extrema importância pois ajudam no entendimento dos processos envolvidos no ambiente. Medidas de pH, temperatura, OD e turbidez foram realizados no trabalho ora relatado, no momento da coleta na água do mar e depois de 40 dias de estudos nos biorreatores (tabela 2). Foram feitas 3 medições e obtida a média entre elas. Tabela 2 - Parâmetros físico-químicos das águas de Manguinhos e da Ilha do Boi Parâmetro Medição no momento da coleta da água Medição após 40 dias de estudo IL H A D O B O I m m m pH 7,9 8,9 T (°C) 22,4 23,7 OD (mg/L) 3,75 3,0 Turbidez (NTU) 17,2 18,6 M A N G U IN H O S pH 8,0 8,1 T (°C) 22,0 23,0 OD (mg/L) 3.7 3,4 Turbidez (NTU) 51,8 7,9 Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 5.2.1 pH Os valores de medição de pH da água de Manguinhos e da Ilha do Boi se encontram dentro do valor estabelecido para a proteção de vida aquática tanto no início quanto no final do experimento relatado, indicando que não houve desvio dos valores padrões. De acordo com Messano (2007) valores de pH para água do mar são 45 encontrados entre os valores 7,2 e 8,6. E ainda a resolução CONAMA 357/05 estabelece que para a proteção da vida aquática o pH deve estar entre 6 e 9. Chen, Zhang, Bott (2005) realizaram um experimento da taxa de crescimento do biofilme em função do pH. Este experimento mostrou que meios neutros (pH próximo a 7) são os mais favoráveis para o desenvolvimento da bioincrustação, seguido pelo meio alcalino (pH em torno de 8,5) com redução na taxa crescimento e por último os meios ácidos (pH abaixo de 6), onde a taxa de crescimento cai drasticamente. A alta alcalinidade das águas da Ilha do Boi após os 40 dias de estudo (pH de 8,9) valida a contagem global de microrganismos ter sido maior na água de Manguinhos, indicando a preferência de bactérias em ambientes com pH próximo ao neutro (pH de 8,1). 5.2.2 Temperatura Observou-se um aumento na temperatura da água após os 40 dias de estudo em relação a medição no momento da coleta. Podemos inferir que o regime climático onde o reator foi instalado é diferente do regime natural do mar, explicando tal aumento de temperatura. A temperatura desempenha o papel principal de controle no meio aquático, condicionando as influências de uma série de parâmetros físicos e químicos. As variações de temperatura são parte do regime climático normal, e corpos d’água naturais apresentam variações sazonais e diurnas. A temperatura da água é influenciada por fatores tais como radiação disponível, latitude, altitude, estação do ano, período do dia, taxa de fluxo e profundidade (ZUMACH, 2003). A elevação da temperatura da água, dentro de certos limites, aumenta a atividade metabólica de organismos tais como bactérias, causando também maior consumo de oxigênio (BRANCO, 1978). 5.2.3 OD O oxigênio dissolvido é de essencial importância para os organismos aeróbios. Durante a estabilização da matéria orgânica, as bactérias fazem uso do oxigênio nos seus processos respiratórios, podendo vir a causar uma redução da sua concentração no meio (VON SPERLING, 1996). 46 O uso de oxigênio nos processos respiratórios dos microrganismos, assim como a elevação da temperatura nos reatores, aumentando as atividades metabólicas dos mesmos, sugerem a queda nos níveis de oxigênio dissolvido após os 40 dias de estudo comparado com as medições no momento da coleta. A queda no nível de OD também induz dizer que as condições do reator mesmo com circulação e aeração da água, não foram as mesmas encontrados no ambiente natural. Ainda pode-se observar que a diminuição dos níveis de OD de Manguinhos não foram tão grandes comparadas com o da Ilha do Boi, possivelmente pela produção de oxigênio pelas cianobactérias presentes na água de Manguinhos. 5.2.4 Turbidez A turbidez é causada pela presença de materiais em suspensão na água, tais como partículas insolúveis de solo, matéria orgânica e organismos microscópicos (MOTA, 1995). A água de Manguinhos mostrou uma elevada turbidez quando analisada no momento da coleta da água, em torno de 51,8 NTU, por ser uma região característica com muitas ondas, o que facilita a suspensão de areia. O contrário foi observado nas águas da Ilha do Boi, que tem águas mais mansas (turbidez de 17,2 NTU). As medições após os 40 dias de estudo em Manguinhos mostraram a diminuição no valor de turbidez indicando que as partículas se decantaram. Entretanto a turbidez da água da Ilha do Boi aumentou, provavelmente pela maior quantidade de matéria orgânica presente na água coletada nesse ambiente e pelo crescimento microbiano. 5.3 ENSAIOS ELETROQUÍMICOS 5.3.1 Curvas de Polarização Foram realizados ensaios de polarização no aço AISI 316 sem adesão de biofilme (matriz), no aço AISI 316 com biofilme formado na água da Ilha do Boi e no aço AISI 316 com biofilme formado na água de Manguinhos, no sentido de fazer uma comparação entre os tratamentos e os potenciais de corrosão e de pite dos mesmos. A figura 14 mostra o gráfico das curvas de polarização em função da 47 densidade de corrente (J) e o potencial elétrico (E) e a tabela 3 mostra os valores de potenciais de corrosão e pite das amostras com o desvio padrão. Figura 13 - Comparação das curvas de polarização do aço AISI 316 (matriz), imersos por 40 dias em reatores com águas da Ilha do Boi e de Manguinhos Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). Tabela 3 - Potenciais de corrosão e de pite com o desvio padrão. Aço Ec Desvio Padrão Epite Desvio Padrão Branco -0,27 * 0,30 * Manguinhos -0,17 0,07 0,51 0,21 Ilha do Boi -0,08 0,06 0,49 0,12 *O aço em branco foi feito apenas com uma amostra. Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 48 Os potenciais de corrosão (Ec) são potenciais onde ocorre a inversão da região catótica e anódica. À medida que há uma diminuição significativa no potencial de corrosão (Ec), o aço está mais suscetível à corrosão. A região anódica é a região onde começa a ocorrer a corrosão, o aço matriz por ter o menor potencial (-0,27 V) é o primeiro a entrar na região anódica, portanto o mais suscetível à corrosão. Em seguimento, destaca-se o aço com o biofilme de Manguinhos com o potencial de corrosão (-0,17V). Comparando as três situações pode-se dizer que o que apresentou maior potencial de corrosãofoi o aço imerso em água da Ilha do Boi (Ec: -0,08V), portanto, o que apresenta menor suscetibilidade a corrosão. A análise das curvas de polarização do aço (matriz, imerso em água da Ilha do Boi e de Manguinhos, figura 14) mostra que ocorreu um aumento da corrente na região passiva do aço imerso na água de Manguinhos comparado com o aço imerso na água da Ilha do Boi, sugerindo uma oxidação maior do aço de Manguinhos. Segundo Gentil (2011) a oxidação gera um aumento na corrente. Pela análise da curva de polarização também foi possível observar uma maior passivação no aço imerso na água de Manguinhos, sugerindo uma maior resistência da camada passiva com o potencial de pite 0,51V, comparado com da Ilha do Boi e o aço Matriz, 0,49 e 0,30, respectivamente. 5.3.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica Os gráficos de impedância eletroquímica dos cupons de aço AISI 316 com biofilme formado nas águas da Ilha do Boi e de Manguinhos (figuras 15 e 16), mostram a presença do biofilme devido à mudança de curvatura, revelando a característica de uma cobertura de revestimento (no caso o biofilme) nos aços. No aço da Ilha do Boi isso ocorre a 4,45 Hz e no aço de Manguinhos a 474,22 Hz. O primeiro ponto dos gráficos indica a resistência ao eletrólito, em seguida a influência do biofilme, pois o biofilme sobrepõe-se à superfície do aço e depois a mudança na curvatura onde começa a influência do aço. Vieira (2008) estudou a biocorrosão em sistemas estático e dinâmico de revestimento aplicados em aço carbono e pelo diagrama de Nyquist observou para 49 aço com tinta rica em zinco a indicação de associação de mais de um processo ocorrendo na superfície, uma vez que primeiramente há formação de um pequeno arco capacitivo e posteriormente a intensificação de uma corrente difusiva ao longo do tempo mostrando a mudança no arco capacitivo, indicando a presença do revestimento no aço. Figura 14 - Gráfico de impedância eletroquímica dos cupons de aço AISI 316 com biofilme formado na água da Ilha do Boi Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). No gráfico de impedância com biofilme formado em Manguinhos só foi possível observar essa mudança de curvatura com detalhamento minucioso, observando a figura com zoom (figura 16-A). Na figura 16-B apresenta o gráfico em escala normal. 50 Figura 15 - Gráfico de impedância eletroquímica dos cupons aço AISI 316 com biofilme formado na água de Manguinhos, A: escala com zoom, B: escala normal FONTE: AUTORIA PRÓPRIA (2016). Os dados da comparação dos cupons de aços com biofilme formado nas águas da Ilha do Boi e de Manguinhos pelo diagrama de Nyquist (figura 17) mostram uma resistência maior do biofilme do aço de Manguinhos devido ao maior diâmetro do semicírculo mostrando uma espessura maior do filme. Os dados sugerem dizer que a espessura do filme do aço da Ilha do Boi é menor do que do aço de Manguinhos, devido ao fato dele se romper previamente. Gráficos de Nykist sugerem que quanto menor o diâmetro do semicírculo, menor a resistência do filme e, consequentemente, maior a taxa de corrosão, pois o aço fica mais suscetível ao processo de corrosão do eletrólito. Porém no estudo ora relatado mostrou-se o oposto, o aço que obteve maior resistência do biofilme (aços imersos na água de Manguinhos) também mostrou maior processo corrosivo de acordo com a polarização anódica e a perda de massa (tabela 4). Os dados sugerem que ocorreu uma corrosão influenciada por microrganismos. Além do processo corrosivo no aço imerso na água de Manguinhos ser maior, os dados obtidos pelo número de UFC/cm² indicaram maior número na contagem 51 global de microrganismos nesse ambiente e também maior diversidade de microrganismos pela caracterização morfológica, confirmando uma corrosão influenciada por microrganismos. Figura 16 - Comparação do gráfico de impedância eletroquímica dos cupons de aço com biofilme formado nas águas da Ilha do Boi e Manguinhos Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). A figura 18 mostra a corrosão nos aços após os ensaios eletroquímicos. No aço em Branco foi possível observar uma corrosão por pite que é característica em aços inoxidáveis. Nos aços com biofilmes da Ilha do boi e Manguinhos observou-se uma corrosão diferenciada estilo “lascas”, evidenciando uma corrosão influenciada por microrganismos e ainda evidenciar uma maior quantidade de lascas no aço com biofilme de Manguinhos comparado com o da Ilha do Boi. 52 Figura 17 - Imagem da corrosão dos aços após os ensaios eletroquímicos Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). 5.4 Taxa de Corrosão O cálculo da taxa de corrosão pela perda de massa dos cupons de aço indica que a taxa de corrosão foi cinco vezes maior nas amostras imersas nos reatores com a água de Manguinhos. A tabela 4 mostra as taxas de corrosão dos cupons de aço, considerando a redução da espessura do material (mm/ano) e a perda de massa em MDD (mg/dm²/dia). 53 Tabela 4 - Cálculo da taxa de corrosão pela perda de massa dos cupons de aços AISI 316 imersos por 40 dias nas águas de Manguinhos e da Ilha do Boi Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). Araújo (2011) avaliou a corrosão induzida microbiologicamente no aço carbono 1020 com e sem revestimento à base de óxido de nióbio, em água do mar “in natura” e estéril. Ele observou que na água “in natura” há uma tendência crescente e linear de perda de massa do aço com e sem revestimento, ou seja, quanto maior o tempo de exposição, maior a degradação do material metálico. Contudo, o recobrimento da superfície metálica com a tinta contendo o pigmento de óxido de nióbio reduziu o processo corrosivo, mesmo quando houve a formação de biofilme. Também concluiu que as perdas de massa foram diferenciadas para água do mar estéril e “in natura” e o aço exposto a água do mar “in natura” apresentou uma taxa de corrosão de 0,029 mm/ano com 28 dias de estudo. A corrosão pode ser atribuída especificamente à formação de biofilmes e à atividade dos microrganismos neles presentes, por vários mecanismos como, por exemplo, pela geração de agentes corrosivos, ácidos orgânicos e inorgânicos (ARAUJO, 2011). 5.5 ANÁLISES DE SUPERFÍCIE 5.5.1 Microscopia Ótica A análise da superfície dos cupons de aços imersos em água de Manguinhos e Ilha do Boi por microscopia ótica (figura 19) mostrou a formação de biofilmes nas superfícies de maneiras diferentes. M1 (g) M2 (g) M3 (g) Média (g) Taxa de corrosão (mm/ano) Taxa de corrosão (mdd/dm2/dia) Ilha i 11.957 11.891 12.248 Ilha f 11.943 11.887 12.234 Δm 14 4 14 10 0,01147 2,5 Manguinhos i 12.190 12.490 12.066 Manguinhos f 12.157 12.405 12.040 Δm 33 85 34 50 0,05738 12,5 54 Figura 18 - Microscopia ótica em cupons de aço AISI 316 imersos por 40 dias em reatores contendo águas de Manguinhos e da Ilha do Boi Ilha do Boi Manguinhos 8x 16x 35x Fonte: AUTORIA PRÓPRIA (2016). A oxidação de diferentes metais gera diferentes óxidos, muitos dos quais são caracterizados por cores particulares. O óxido de ferro, por exemplo, apresenta uma cor castanha avermelhada, enquanto o hidroxicarbonato de cobre II apresenta uma coloração azul esverdeada (PALMA; TIERA, 2003). Ainda se observa que a oxidação de objetos de cobre, principalmente quando em meio aquoso em contato
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