Técnicas Histológicas 5

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Técnicas Histológicas - Abordagem histologia
Muitas doenças e processos fisiológicos só poderão ser compreendido após o descobrimento do microscópio, essa ferramenta incrível possibilitou ao homem observar o mundo mil vezes menor do que estava habituado a ver, e compreender que muitos dos processos, até então inexplicável, tinham origem. As primeiras observação microscópicas foram feitas em folhas cortadas a mão, fios de cabelos e cascas de arvores, e tudo aquilo que a luz podia observar e que possua cor, com o passar do tempo a curiosidade humana almejou observar outras estruturas, criando ferramentas e procedimentos que tornassem estruturas maiores e sem contrate em finas e contratadas, nascia neste momento a técnica histológica ou histotecnologia. Técnica histológica é o conjunto de procedimentos que envolvem a preparação de amostra (tecidos ou células) para análise sob microscopia de luz. As técnicas histológicas são divididas nas seguintes etapas:
Coleta do material
Fixação
Clivagem
Descalcificação
Inclusão
Microtomia
Coloração
Selagem
Observação ao microscópio
Após a morte ou retirada de partes do tecido do organismo as amostras biológicas naturalmente se deterioram, isso se deve as enzimas autolíticas presentes nas células, além da ação de microrganismos decompositores, este processo desestabiliza as estruturas das moléculas presentes nos tecidos, modificando sua morfologia e alterando sua localização. A fixação é a principal etapa das técnicas histológicas, todos os procedimentos que se seguem depende que o material esteja bem preservado, os objetivos da fixação de tecidos são: evitar a autólise e a proliferação bacteriana; parar o metabolismo celular, mantendo o conteúdo bioquímico e preservando antígenos. Preservar os tecidos para futuras colorações; manter as relações topológicas e morfológicas das biomacromoléculas o mais próximo da situação “in vivo” e melhorar a diferenciação óptica das células preservando sua identidade. 
Existem várias formas de fixar uma amostrar, no entanto, podemos classificar os métodos de fixação em dois grandes grupos: fixação física que promove a conservação da amostra através do seu aquecimento ou resfriamento, e a fixação química é o processo de estabilização de biomoléculas pela a ação de agentes químicos. O principais grupos de fixados são: os agentes oxidantes, os agentes desnaturantes, fixadores de mecanismos desconhecidos, fixadores de aldeídos e suas combinações. Os principais fatores de que influenciam a fixação são:
Temperatura
Volume da mistura fixadora
Concentração 
pH da mistura fixadora
Osmolaridade
Espessura da amostra
Tempo de fixação
Procedimentos de coleta, fixação e clivagem
A coleta do material é um procedimento de retira de amostra de um biológica de um organismo vivo ou morto, obtidas através de biopsias, peças cirúrgicas e necropsias. Ao iniciar a coleta os tecidos devem ser manipulados com cuidado, no caso de necropsias os órgão produtores de enzimas devem ser retirados primeiros já que neste a autólise ocorre primeiramente, a fixação deve ocorre logo após a coleta quanto mais rápido o órgão ou tecido ser submetido ao fixado, mais rápido o processo de autólise será interrompido. 
Chama-se de clivagem o processo de redução de tamanho e espessura dos fragmentos fixados, permitindo de forma mais eficaz a penetração do fixador para o interior das amostras, e subsequentemente a melhor difusão dos reagentes, durante o processamento histológico. Cada órgão ou fragmento possuir um plano ideal de clivagem que deve ser obedecido, a clivagem deve ser realizada com o corte firme uni direcional de modo a torna a área de interesse evidente.
Descalcificação
O tecido ósseo apresenta uma matriz extracelular com componentes minerais e orgânicos de consistência pétrea, que não permitem seu seccionalmente e consequente visualização microscópio de luz. Para a observação desse tipo de tecido ou diagnostico de algumas patologias desse proceder a descalcificação. Podem-se utilizar descalcificadores a base de ácidos, histoquímicos, soluções descalcificadoras patenteadas, resinas de troca iônica e descalcificação eletrolíticos. Na escolha do método de descalcificação a fatores que devem ser levados em conta, como: a urgência do material, o grau de mineralização do tecido, coloração a ser empregada e o tipo de fixador a ser utilizado. 
Os descalcificadores mais empregados nos laboratórios de patologias são a base de ácidos, podemos assim classificar os descalcificadores a base de ácido como: ácidos fracos e ácidos fortes. Os ácidos fortes são ácidos de ação rápida, porém causam muito danos aos tecidos, só devem ser empregados em amostras que demandem muita velocidade e que apresentem uma grande quantidade de matriz mineralizada, como o fêmur ou a tíbia. 
O processamento de descalcificação reuni procedimentos que visam substituir a água que se entra nos tecidos por um meio mais solido, conferindo assim resistência e dureza suficiente para ser cortado. O processamento se caracteriza pela a difusão de substâncias apropriadas para dentro e fora do tecido, até atingir o ponto onde a concentração dos reagentes e do interior do tecidos se torna igual. Alguns fatores influenciam no processamento como: o tamanho do espécime, quando maior o tamanho do espécime maior deve o tempo do processamento ; os reagentes utilizados, os deferentes reagentes desidratantes, clarificantes e infiltrastes requerem processamentos diferenciados; espécie animal (moluscos, insetos), algumas espécie de animais querem processamentos diferenciados; propriedades dos tecidos, os tecidos embrionários muito hidratados ou mesmo os tecidos sanguíneos, também dependem de processamento diferenciado; presença de vácuo, quando há possibilidade de adicionar vácuo no processamento este pode ser acelerado; temperatura durante o processamento, temperaturas mais altas acelera o processamento, mas podem danificar o tecido, já temperaturas mais baixas retardam o processamento. 
Inclusão
A inclusão consiste no processo aonde o tecido é colocado em um molde coberto por parafina fundida, após ser totalmente infiltrada. A inclusão pode ser realizada com a parafina retirada diretamente da estufa ou pode ser realizada com o auxílio de uma central de inclusão, as centrais de inclusão são aparelhos confeccionados para facilitar o ato de incluir, garantido uma distribuição perfeita da temperatura. Durante a inclusão deve-se seguir algumas recomendações importantes:
A temperatura da parafina não deve exceder 5°C acima do seu ponto de fusão, pois corre risco de danificar o tecido;
As pinças utilizadas para inclusão deve estar constantemente aquecidas, pois pinças mal aquecidas pode dificultar a inclusão, pois grudaram nos tecido;
 Deve se incluir somente tecidos muito bem processados, tecidos mal processado deve ser novamente submetido a bateria de processamento, pois se incluídos serão inadequados para o corte;
 A inclusão deve ser realizada tão logo quando o tempo de infiltração tenho terminado, pois os tecidos não devem ficar muito tempo na parafina aquecida;
 Deve cuidar para que o tecido esteja uniformem-te apoiado ao fundo do bloco, permitindo ao ser cortado todas as áreas sejam atingida pela a navalha; 
Sempre manter a área clivada voltada para o fundo do molde, para que estar seja a região cortada;
Estruturas circulares, como fragmento de intestino quando possível devem ser incluídos com todas as partes voltadas para o fundo do bloco.
Esses cuidados devem facilitar a microtomia e ao mesmo tempo permitir uma análise correta do fragmento.
Microtomia
Após a inclusão os blocos estarão prontos para ser seccionados em fatias finas, permitindo assim a visualização das células e elementos extra celulares através da microscopia de luz, a este processo dar-se o nome microtomia. A microtomia é um procedimento delicado, que depende de um profissional bem treinado, equipamentos específicos, e cuidados que iram assegurar a execução de corte de alta qualidade. Dentre estes destacar-se:a estrutura do micrótomo, navalhas, o procedimento de lavagem e identificação das lâminas, a utilização de substâncias adesivas, a execução da microtomia e os problemas técnicos mais comuns. 
A congelação de tecidos seguida por a criomicrotomia consiste na fixação física a frio por congelação, seguida do corte desse tecido ainda congelado, é o processamento empregado nas rotinas de centros cirúrgicos, pois consiste no rápido diagnostico além de ser empregados em muitos centros de pesquisas especialmente por sua capacidade de preserva antígeno e lipídeos. 
Coloração
A coloração de tecidos é a coloração destinada a tornar os tecidos visíveis a microscópio, com o auxílio de soluções corantes. Os fragmentos expostos em lâminas de vidro ao final da microtomia são transparentes e precisam receber corantes para melhor visualizar e caracterizar suas células e componentes teciduais, no contexto morfológico e histoquímico.