PCR quantitativa

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 PCR
 Histórico
 Teoria
 Aplicações
 Desenho de primers
 qPCR
 Metodologias
Cálculos
 Aplicações
 PCR Digital
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Dogma central da Biologia Molecular
 Francis Crick / 1956
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PCR
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PCR - Polymerase Chain Reaction
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Funções da PCR
 Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;
 Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.
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Aplicações da PCR “convencional”
 Diagnóstico
 Avaliação de mutações
 Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
 Tipagem para transplantes - MHC
 Testes forenses
 Paternidade
 Investigações criminais
 
 Sequenciamento e clonagem
 Epidemiologia molecular e bioinformática
 Análise de OGM
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PCR “convencional”
Reagentes básicos
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Importância do tampão e íon potássio na PCR
 pH 8,3  pH 7,2 a 72º C
 Tris/ Tris-Cl
Função enzimática da DNA polimerase
 K+
 Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer pela neutralização de cargas negativas
 ↑ [K+] para fragmentos pequenos
 ↓ [K+] para fragmentos grandes
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Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
 Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
 Associados ao DNA na forma de dNMPs
 Sequestradores de Mg2+
 Mg2+
 Cofator da DNA polimerase
 Especificidade e eficiência da enzima
Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)
 Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+]  ↑eficiência ↓especificidade
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Função e relevância dos primers
 Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre
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DNA polimerase termorresistente
 Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
 Taq DNA Polimerase
 Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+)
 Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
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DNA molde
 Qualidade 
 Cuidado com resíduos de processos de extração
 SDS (dodecil sulfato de sódio)
 Fenol
 Corantes
 Heparina/EDTA/Citrato
 Polissacarídeos vegetais/carragenina
 Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
 Quantidade
 Excesso de DNA é prejudicial
 Aumento de reação inespecífica
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Parâmetros de termociclagem
 Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento  ↑estringência 
		 ↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento  ↑rendimento 
		 ↑ produtos inespecíficos
 Tempo de extensão
 DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C
 Mínimo = 1 minuto 
 Excesso  Atividade de exonuclase 5´-3´
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Aditivos
 Separação de fitas com alto conteúdo G:C
 Estruturas secundárias fortes
 Betaína (1 M)
 DMSO (1-10%)
 Formamida (1-10%)
 Agentes estabilizantes da DNA polimerase
 Redução da adesão de reagentes ao tubo
 BSA (0,1 mg/mL)
 Gelatina (0,1 – 1,0%)
 Detergentes não-iônicos (<0,5%)
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Inibidores
 Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;
 Fenol/álcoois
 EDTA
 Debris celular
 Detergentes
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Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
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Visualização dos resultados
 Separação por eletroforese
 Corantes/marcação fluorescente
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Visualização dos resultados
 Sequenciamento capilar
 Dideoxinucleotídeos
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Antes da PCR...
 Clonagem!
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Antes dos termocicladores...
 Banho-maria!
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Desenho de
primers
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Características de bons primers
 Tamanho adequado
 15 a 25 pares de bases
 Tamanho x Temperatura de dissociação
 Temperatura adequada de dissociação (Tm)
 Conteúdo G:C
Diferença entre primers < 5º C
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Características de bons primers
 Tamanho do fragmento a ser gerado
 Tempo de extensão da polimerase
Especificidade
 Primers específicos x degenerados
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Características de maus primers
 Inter-complementariedade
 Formação de dímeros (primer dimer)
 Atenção à extremidade 3´
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Características de maus primers
 Auto-complementariedade
 Formação de auto-dímeros e hairpins
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Características de bons primers
 Adequação para qPCR
 Tamanho do amplicon 
Junção exon-exon e contaminação com gDNA
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Ferramentas online de suporte
 Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
 Primer3
bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
 IDT Oligo Analyzer 3.1
www.idtdna.com/calc/analyzer
 UCSC PCR in silico
genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
 RT Primer DB (específico para qPCR)
 medgen.ugent.be/rtprimerdb
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Workflow para desenho de primers
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PCR
quantitativa
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PCR quantitativa
 Nomenclatura
 qPCR
 qRT-PCR
 Real-time PCR
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Conceitos importantes
 Fases exponencial, logarítmica e plateau
 Threshold
 Baseline
 Cycle threshold (CT)
Flourescência
(produtos de PCR)
Plateau
Linear
Exponencial
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↑ CT ↓ Qtde. inicial
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Conceitos importantes
 Quantidade inicial de amostra
 Relação CT x Quantidade inicial
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Conceitos importantes
 Eficiência
2n = cópias em n ciclos
Eficiência teórica= 100%
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Conceitos importantes
 Curva de dissociação (Curva de melting)
 Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;
 Ligação específica do corante à fita dupla
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Conceitos importantes
 Curva de dissociação (Curva de melting)
 Diretamente relacionada ao conteúdo G:C
 Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers
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Conceitos importantes
 Curva de dissociação (Curva de melting)
 Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex
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Fatores que afetam a eficiência da qPCR
 DNA degradado
 Produtos inespecíficos
 Tamanho do amplicon
 Condições de termociclagem
 Prática laboratorial inadequada
 Reagentes contaminados
 Primers mal desenhados
 Diluições mal feitas
 Falta de calibração e manutenção
 Pipetagem errada!
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Funções da PCR quantitativa
 Quantificação absoluta
 Curvas-padrão
 Quantidade conhecida de “cópias por volume”
 Semelhante a um ELISA
 Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
 Avaliação relativa
 Ausência de curva-padrão
 Gene de referência para normalização
 Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental
 Exemplo: expressão gênica
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Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificação
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Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta
 Regressão linear simples
 Método Pfaffl  Curva de cópias (plasmídeos)
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Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
 Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse
 Método Livak  2-ΔΔCT
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Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
 Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT
 Exemplo:
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Extração e manuseio de ácidos nucléicos
 RNA = extremamente lábil!
 Armazenamento correto
 Dosagem e normalização das amostras
 A260/280 e A260/230 > 1,8
 Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA
 Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de RNA para todas as amostras;
 Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;
 Ciclos de congelamento/descongelamento;
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Escolha do gene de referência
 É necessário ter opções!
 Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
 Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada;
 
Preparar um pool com amostras-controle
 6 diluições em triplicata
 Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
Algoritmos gratuitos na internet
NormFinder: macro para Excel	
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Antes da qPCR...
 Northern Blotting (RNA)
 Southern Blotting (DNA)
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http://www.gene-quantification.de/
Principalmente PRESENÇA x AUSÊNCIA!!!!!!!
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TODAS AS OBSERVAÇÕESSÃO VÁLIDAS PARA REAL TIME!!!!!!!
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Concentração normal de K+ no tampão: 50 - 100 mM
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BAIXA ESPECIFICIDADE LEVA À FORMAÇÃO DE PRODUTOS INESPECÍFICOS
DICA: DESCONGELAR E VORTEXAR BASTANTE O MgCl2!!
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Remoção dos fosfatos beta e gama dos dNTPs para associação à fita de DNA
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Thermus aquaticus = termofílica Gram Negativa
ENZIMAS ANTIGAS: KLENOW ou T4 DNA Pol  
TAQ = MEIA-VIDA DE 40 MINUTOS a 95º C
AUMENTAR A QTDE DE ENZIMA NÃO MELHORA O RENDIMENTO!!!
ERROS DE PIPETAGEM DEVIDO AO GLICEROL!
PROOFREADING = BLUNT
NON-PROOFREADING = OVERHANGING (A)
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Quantidade ideal = < 10 ng/µL!!!!!!!
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Detergentes não-iônicos: Tween-20, NP-40, Triton X-100
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SEQUENCIAMENTO/NGS
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APENAS NO END-POINT!!!!
Explicar o que é end-point!
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The Tm is also affected by the salt concentration of the reaction solution, because DNA duplexes are more stable at higher cation concentrations.
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AO CHECAR PRIMERS, A REDUNDÂNCIA É BEM-VINDA!
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