91205311 Resumo Biocel 1

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Conceitos-­‐chave	
  em	
  Biocel	
  1	
  	
   Aula	
  1	
  -­‐	
  Microscopia	
  óptica	
  	
  
Robert	
  Hooke:	
  pioneiro	
  no	
  desenvolvimento	
  de	
  microscópios,	
   criou	
  o	
  primeiro	
  microscópio	
  composto,	
  e	
  em	
  suas	
  observações,	
  cunhou	
  o	
  termo	
  “célula”	
  ao	
  observar	
  inúmeros	
  espaços	
  ocos	
  ampliados	
  de	
  fina	
  lâmina	
  de	
  cortiça.	
  	
  
Limite	
   de	
   resolução:	
   é	
   o	
   limite	
   da	
   ampliação	
   dos	
   microscópios	
   aonde	
   dois	
   objetos	
   ainda	
  podem	
   ser	
   vistos	
   como	
   duas	
   coisas	
   distintas.	
   O	
   simples	
   aumento	
   de	
   imagem	
   não	
   traz	
  informações	
   adicionais,	
   pois	
   isso	
   depende	
   apenas	
   da	
   resolução.	
   A	
   resolução	
   por	
   sua	
   vez	
  depende	
  da	
  lente	
  e	
  da	
  qualidade	
  da	
  luz.	
  Os	
  microscópios	
  de	
  maior	
  resolução	
  atualmente	
  são	
  os	
  microscópios	
  eletrônicos,	
  que	
  conseguem	
  visualizar	
  objetos	
  de	
  até	
  0,2nm.	
  	
  
Unidades	
  de	
  medida:	
  1	
  micrômetro	
  (μm)	
  é	
  o	
  milésimo	
  de	
  1	
  milímetro	
  (mm).	
  E	
  1	
  nanômetro	
  (nm)	
   é	
   o	
   milésimo	
   de	
   um	
   micrômetro.	
   Bactérias	
   costumam	
   ter	
   1μm,	
   enquanto	
   células	
  costumam	
  ter	
  entre	
  10	
  e	
  100μm.	
  	
  Preparo	
  de	
  amostras	
  	
  Além	
   de	
   pequena,	
   células	
   são	
   difíceis	
   de	
   serem	
   observadas	
   por	
   serem	
   transparentes,	
   serem	
  muito	
  hidratadas	
  e	
   frágeis	
  e	
  quando	
  dentro	
  de	
  orgãos	
  ou	
   tecidos,	
  precisam	
  ser	
   cortadas	
  em	
   lâminas	
   finas	
  pelas	
  quais	
  a	
  luz	
  consiga	
  passar.	
  	
  Por	
  isso,	
  há	
  todo	
  um	
  processo	
  de	
  preparação	
  de	
  amostras,	
  visando	
  maior	
  resistência	
  e	
  contraste	
  das	
  mesmas,	
  e	
  para	
  que	
  possam	
  ser	
  preservadas	
  por	
  mais	
  tempo:	
  	
   1. Fixação:	
  é	
  o	
  tratamento	
  que	
  preserva	
  as	
  células	
  da	
  decomposição,	
  e	
  elimina	
  qualquer	
  reação	
  bioquímica	
  em	
  andamento.	
  Visa	
  preservar	
  a	
  amostra	
  o	
  mais	
  próximo	
  possível	
  do	
   seu	
  estado	
  natural.	
  	
   2. Desidratação:	
   é	
   a	
   substituição,	
   em	
   etapas,	
   da	
   água	
   presente	
   no	
   interior	
   da	
   célula	
   por	
   um	
  solvente	
  orgânico,	
   como	
  etanol	
   ou	
  metanol.	
  O	
  mesmo	
  pode	
   ser	
   removido	
  deixando	
  a	
   lâmina	
  secar	
  como	
  pode	
  ser	
  substituído	
  por	
  parafina	
  ou	
  outra	
  resina	
  que	
  o	
   torne	
  rígido,	
  permitindo	
  que	
  seja	
  fatiado.	
  	
   3. Microtomia:	
  é	
  o	
  corte	
  preciso	
  de	
  fatias	
  finíssimas	
  que	
  permitam	
  a	
  passagem	
  da	
  luz.	
  	
   4. Coloração:	
   como	
   a	
   maioria	
   das	
   células	
   e	
   seus	
   componentes	
   são	
   transparentes,	
   são	
   usados	
  diversos	
  corantes	
  com	
  afinidade	
  química	
  por	
  determinados	
  componentes	
  celulares,	
  ajudando	
  na	
  identificação	
  dos	
  mesmos.	
  	
  Tipos	
  de	
  microscópios	
  	
  
Microscópio	
   simples	
   (ou	
   de	
   campo	
   claro):	
  é	
  o	
  microscópio	
  mais	
  comum.	
  Em	
  geral	
  requer	
  que	
  a	
  amostra	
  seja	
  fixada	
  e	
  corada	
  antes	
  da	
  observação,	
  mas	
  com	
  o	
  ajuste	
  certo	
  da	
  luz	
  na	
  lente	
  condensadora	
  é	
  possível	
  observar	
  células	
  vivas	
  ou	
  a	
  fresco,	
  sem	
  coloração.	
  	
  
Microscópio	
  de	
   contraste	
  de	
   fase:	
  dispensa	
  o	
  uso	
  de	
  corantes,	
  permitindo	
  a	
  observação	
  de	
  células	
  vivas.	
  Vários	
  filtros	
  (anéis	
  de	
  fase)	
  interferem	
  no	
  caminho	
  da	
  luz,	
  criando	
  um	
  contraste	
  claro/escuro	
   forte	
  nas	
  estruturas	
  celulares.	
  No	
  entanto,	
  com	
  muitas	
  células	
   juntas,	
  a	
   imagem	
  pode	
  ficar	
  um	
  pouco	
  confusa.	
  	
  
Microscópio	
  de	
  contraste	
  interferencial:	
  também	
  cria	
  contraste	
  usando	
  filtros	
  para	
  alterar	
  o	
  caminho	
   da	
   luz.	
   A	
   imagem	
   final	
   é	
   mais	
   agradável,	
   mas	
   o	
   equipamento	
   é	
   mais	
   caro	
   que	
   o	
  contraste	
  de	
  fase.	
  Quando	
  as	
  células	
  estão	
  em	
  camadas,	
  é	
  possível	
  focar	
  num	
  plano	
  específico,	
  obtendo-­‐se	
  assim	
  cortes	
  ópticos	
  sem	
  que	
  o	
  tecido	
  seja	
  cortado.	
  	
  
Microscópio	
   de	
   fluorescência:	
   utiliza	
   luz	
   ultravioleta	
   e	
   requer	
   o	
   uso	
   de	
   corantes	
  fluorescentes.	
  Esses	
  corantes	
  absorvem	
  a	
  luz	
  ultavioleta	
  e	
  a	
  emitem	
  num	
  comprimento	
  onda	
  do	
  espectro	
  visível.	
  Permitem	
  ver	
  estruturas	
  normalmente	
  muito	
   finas	
  para	
   serem	
  vistas	
  na	
   luz	
  visível.	
  	
  
Microscópio	
   confocal	
   de	
   varredura	
   a	
   laser:	
   além	
   da	
   luz	
   visível,	
   possui	
   uma	
   fonte	
   de	
   luz	
  ultravioleta	
   e	
   outra	
   de	
   raio	
   laser.	
   O	
   laser	
   incide	
   sobre	
   a	
   amostra,	
   e	
   um	
   sistema	
   de	
   filtros	
   e	
  aberturas	
   capturam	
   sucessivamente	
   a	
   fluorescência	
   emitida	
   de	
   diversos	
   planos	
   focais.	
   Esse	
  conjunto	
  de	
  imagens	
  é	
  processado	
  digitalmente	
  por	
  um	
  software,	
  e	
  imagens	
  3D	
  são	
  geradas	
  em	
  computador.	
  	
  	
  Aula	
  2	
  –	
  Princípios	
  do	
  Funcionamento	
  dos	
  Microscópios	
  Eletrônicos	
  	
  Principais	
  diferenças	
  entre	
  o	
  microscópio	
  óptico	
  e	
  o	
  eletrônico	
  de	
  transmissão	
  	
  
A	
   fonte:	
   luz	
   vísivel	
   no	
  microscópio	
  óptico	
   e	
   feixes	
  de	
   elétrons	
  no	
  microscópio	
   eletrônico	
  de	
  transmissão.	
   O	
   feixe	
   de	
   elétrons	
   é	
   gerado	
   por	
   um	
   filamento	
   de	
   tungstênio	
   aquecido.	
   O	
  comprimento	
  de	
  onda	
  dos	
  elétrons	
  é	
  muito	
  menor	
  do	
  que	
  o	
  da	
  luz	
  visível,	
  por	
  isso	
  a	
  resolução	
  dos	
  microscópios	
  eletrônicos	
  é	
  bem	
  maior.	
  	
  
O	
  vácuo	
  no	
  coluna	
  do	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  transmissão.	
  Serve	
  pra	
  impedir	
  a	
  combustão	
  do	
   filamento	
  e	
  para	
   impedir	
  a	
  colisão	
  dos	
  elétrons	
  com	
  outros	
  átomos	
  no	
  ar.	
  Por	
  outro	
   lado,	
  impossibilita	
  a	
  observação	
  de	
  células	
  vivas.	
  	
  
As	
   lentes:	
   vidro	
   no	
   microscópio	
   óptico	
   e	
   eletromagnetos	
   no	
   microscópio	
   eletrônico	
   de	
  transmissão.	
   As	
   lentes	
  magnéticas	
   desviam	
   e	
   orientam	
   os	
   elétrons	
   da	
  mesma	
   forma	
   que	
   as	
  lentes	
  de	
  vidro	
  desviam	
  e	
  orientam	
  o	
  feixe	
  de	
  luz.	
  	
  
A	
   espessura	
   da	
   amostra:	
   da	
   ordem	
   de	
   micrometros	
   (μm)	
   no	
   microscópio	
   óptico,	
   e	
  nanometros	
  (nm)	
  no	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  transmissão.	
  Pra	
  seratravessada	
  por	
  elétrons,	
  a	
  fatia	
  da	
  amostra	
  precisa	
  ser	
  muito	
  fina.	
  	
  Preparo	
  de	
  amostras	
  para	
  o	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  transmissão	
  	
  Devido	
   ao	
   vácuo	
   no	
   interior	
   da	
   coluna	
   do	
   microscópio	
   eletrônico	
   de	
   transmissão	
   –	
   que	
   destrói	
  facilmente	
   toda	
   a	
   estrutura	
   celular	
   -­‐,	
   as	
   amostras	
   precisam	
   ser	
   especialmente	
   preparadas	
   para	
  observação:	
  	
   1. Fixação:	
  mergulha-­‐se	
  a	
  célula	
  em	
  solucões	
  que	
  estabilizam	
  as	
  estruturas	
  celulares,	
  em	
  geral	
  o	
  formol	
  e	
  o	
  glutaraldeído	
  (mais	
  forte).	
  Essas	
  substâncias	
  são	
  diluídas	
  em	
  “tampões”,	
  que	
  ajudam	
  a	
  manter	
  o	
  pH	
  e	
  a	
  osmolaridade	
  da	
  solução	
  fixadora	
  o	
  mais	
  próximas	
  possível	
  das	
  condições	
  vitais.	
  Assim	
  evita-­‐se	
  a	
  defromação/rompimento	
  das	
  estruturas	
  celulares.	
  	
   2. Pós-­‐fixação	
  e	
  contrastação:	
  como	
  os	
  seres	
  vivos	
  são	
  basicamente	
  compostos	
  de	
  átomos	
  leves	
  que	
  pouco	
  impedem	
  a	
  passagem	
  de	
  elétrons,	
  para	
  se	
  ter	
  o	
  contraste	
  são	
  utilizadas	
  soluções	
  de	
  sais	
   de	
  metais	
   pesados,	
   que	
   ainda	
   ajudam	
   a	
   preservar	
   a	
   célula.	
   Esses	
   sais	
   se	
   acumulam	
  nas	
  
membranas	
   (ósmio	
   e	
   chumbo),	
   no	
   DNA	
   (urânio)	
   e	
   em	
   outras	
   estruturas,	
   facilitando	
   sua	
  visualização.	
  	
   3. Desidratação,	
   inclusão	
   e	
   microtomia:	
   a	
   hidratação	
   das	
   células	
   é	
   um	
   fator	
   que	
   dificulta	
   a	
  passagem	
  dos	
  elétrons.	
  Para	
  resolver	
  isso,	
  toda	
  a	
  água	
  é	
  substituída	
  por	
  um	
  solvente	
  orgânico	
  (como	
   etanol,	
   metanol	
   ou	
   acetona)	
   diluído	
   em	
   concentrações	
   cada	
   vez	
   maiores.	
   Depois,	
   é	
  aplicada	
  uma	
  resina	
  líquida	
  (polimerização),	
  que	
  endurece	
  ao	
  ser	
  aquecida,	
  permitindo	
  que	
  a	
  amostra	
   seja	
   cortada	
   em	
   fatias	
   finas	
   (ultramicrotomia)	
   o	
   suficiente	
   para	
   que	
   os	
   elétrons	
  possam	
  atravessar	
  as	
  áreas	
  livres	
  do	
  acúmulo	
  dos	
  metais	
  pesados.	
  	
  O	
  Microscópio	
  Eletrônico	
  de	
  Varredura	
  	
  No	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  varredura,	
  o	
  tungstênio	
  aquecido	
  gera	
  um	
  feixe	
  de	
  elétrons	
  que	
  incide	
  sobre	
  a	
  amostra,	
  mas	
   ao	
   invés	
   de	
   atravessá-­‐la,	
   eles	
   “varrem”	
   a	
   amostra	
   extraindo	
  deste	
  outros	
  elétrons	
   (chamados	
   elétrons	
   secundários)	
   que	
   são	
   convertidos	
   em	
   imagem	
   por	
   um	
   software	
   de	
  computador,	
  gerando	
  uma	
  sensação	
  de	
  relevo	
  e	
  profundidade.	
  	
  Preparo	
  de	
  amostras	
  para	
  o	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  varredura	
  	
  Como	
  em	
  geral	
  o	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  varredura	
  é	
  utilizado	
  para	
  gerar	
   imagens	
  da	
  superfície	
  
externa	
   das	
   amostras,	
   estas	
  não	
  são	
   fatiadas.	
  O	
  processo	
  de	
  preparo	
  envolve,	
  depois	
  da	
   fixação,	
  a	
  secagem	
  da	
  amostra	
  (para	
  remover	
  toda	
  água,	
  devido	
  ao	
  vácuo)	
  e	
  seu	
  revestimento	
  com	
  um	
  elemento	
  condutor,	
  para	
  geração	
  do	
  sinal.	
  	
  	
   Aula	
  3	
  –	
  Criofratura	
  	
  
Técnica	
  usada	
  principalmente	
  para	
  a	
  visualização	
  da	
  estrutura	
  das	
  membranas	
  celulares.	
  	
  Uma	
  das	
   limitações	
  do	
  microscópio	
   eletrônico	
  de	
   transmissão	
   sempre	
   foi	
   o	
   fato	
  de	
  que	
  as	
   imagens	
  observadas	
   eram	
   cortes	
   ultrafinos	
   das	
   amostras,	
   isto	
   é,	
   imagens	
   bidimensionais	
   de	
   estruturas	
  (células)	
  tridimensionais.	
  Isto	
  pôde	
  ser	
  contornado	
  com	
  a	
  observação	
  de	
  cortes	
  seriados,	
  uma	
  técnica	
  bastante	
   trabalhosa,	
   e	
   também	
   com	
   a	
   microscopia	
   de	
   varredura.	
   Entretanto,	
   a	
   resolução	
   do	
  microscópio	
  eletrônico	
  de	
  varredura	
  é	
  menor	
  que	
  a	
  do	
  microscópio	
  de	
  transmissão,	
  não	
  permitindo	
  a	
  visualização	
  de	
  vários	
  detalhes,	
  principalmente	
  do	
  interior	
  da	
  célula.	
  	
  
Em	
  cortes	
  ultrafinos,	
  a	
  membrana	
  plasmática	
  aparece	
  sempre	
  como	
  uma	
  faixa	
  clara	
  entre	
  duas	
  
mais	
  escuras.	
  Há	
  muito	
  tempo	
  sabe-­‐se	
  que	
  a	
  membrana	
  celular	
  é	
  composta	
  por	
  proteínas	
  e	
  lipideos,	
  entretanto	
   essa	
   observação	
   ao	
  microscópio	
   levou	
   à	
   conclusão	
   errada	
   que	
   que	
   a	
  membrana	
   celular	
  seria	
  um	
  “sanduíche”	
  de	
  proteínas,	
  com	
  os	
  “pães”	
  sendo	
  os	
  lipídeos.	
  Uma	
  membrana	
  assim	
  seria	
  muito	
  rígida,	
  e	
  além	
  disso,	
  as	
  substâncias	
  hidrofílicas	
  seriam	
  barradas	
  pela	
  camada	
  de	
   lipídeos,	
  da	
  mesma	
  forma	
   que	
   as	
   hidrofóbicas	
   seriam	
   barradas	
   pela	
   camada	
   de	
   proteínas,	
   e	
   portanto,	
   essa	
   idéia	
   não	
  aparentava	
  estar	
  correta.	
  Com	
  o	
  passar	
  do	
  tempo,	
  o	
  desenvolvimento	
  da	
  criofratura	
  trouxe	
  um	
  novo	
  entendimento	
  sobre	
  a	
  dinâmica	
  e	
  o	
  funcionamento	
  das	
  membranas	
  celulares.	
  	
  Essa	
   técnica	
   (criofratura)	
   surgiu	
   na	
   década	
   de	
   60,	
   e	
   consiste	
   em	
   parar	
   instanteneamente	
   a	
  
atividade	
   celular	
   congelando-­‐a	
   em	
   nitrogênio	
   líquido	
   (o	
   que	
   ajudava	
   a	
   reduzir	
   os	
   resíduos	
  decorrentes	
   das	
   fixações	
   químicas	
   por	
   aldeídos,	
   e	
   impedia	
   o	
   processo	
   de	
   decomposição	
   celular)	
   e	
  
então	
   fraturá-­‐las	
   para	
   separar	
   a	
   bicamada	
   lipídica,	
   expondo	
   a	
   face	
   interior	
   da	
   membrana	
  
celular.	
  O	
  processo	
  consiste	
  em	
  quatro	
  etapas:	
  	
   1. Congelamento	
  das	
  células	
  em	
  nitrogênio	
  líquido	
  	
  
2. Fratura	
  das	
  células	
  	
   3. Evaporação	
  da	
  superfície	
  fraturada	
  com	
  platina	
  e	
  aplicação	
  de	
  carbono,	
  formando	
  um	
  “molde”	
  	
  4. Destruição	
  dos	
  restos	
  celulares,	
  de	
  modo	
  que	
  apenas	
  a	
  réplica	
  metálica	
  é	
  obervada	
  no	
  MET.	
  	
  A	
  fratura	
  tem	
  grande	
  chance	
  de	
  ocorrer	
  entre	
  as	
  duas	
  camadas	
  lipídicas	
  da	
  membrana	
  (chamadas	
  face	
  E,	
  em	
  contato	
  com	
  o	
  meio	
  extracelular,	
  e	
  P,	
  em	
  contato	
  com	
  o	
  protoplasma)	
  expondo	
  uma	
  superfície	
  homogênea	
  (os	
  lipídeos)	
  com	
  particulas	
  de	
  diversos	
  tamanhos	
  nela	
  inseridas.	
  Essas	
  partículas	
  que	
  
atravessam	
   as	
   camadas	
   lipídicas	
   (as	
   vezes	
   uma	
   delas,	
   as	
   vezes	
   as	
   duas,uma	
   ou	
   inúmeras	
  
vezes)	
  são	
  as	
  proteinas.	
  	
  	
  Essa	
  metodologia	
  foi	
  importante	
  para	
  a	
  sustentação	
  do	
  modelo	
  de	
  mosaico	
  fluído,	
  proposto	
  de	
  Singer	
  e	
  Nicholson.	
  	
  	
   Aula	
  4	
  –	
  Cultura	
  de	
  Células	
  	
  A	
   cultura	
   de	
   células	
   consiste	
   em	
   manter	
   vivas	
   células	
   retiradas	
   de	
   um	
   organismo,	
   em	
   pequenos	
  recipientes.	
  Elas	
  podem	
  ser	
  preparadas	
  diretamente	
  de	
  tecidos	
  retirados	
  do	
  animal:	
  nesse	
  caso,	
  são	
  chamadas	
   culturas	
   primárias.	
   Grupos	
   de	
   células	
   descendentes	
   das	
   culturas	
   primárias,	
   tranferidos	
  para	
  novos	
  meios	
  de	
  cultura,	
  são	
  chamados	
  culturas	
  secundárias.	
  	
  	
  
Para	
   que	
   as	
   células	
   sobrevivam	
   in	
   vitro	
   (fora	
   de	
   um	
   organismo),	
   devem	
   ser	
   reproduzidos	
  
diversas	
  condições	
  presentes	
  no	
  organismo	
  do	
  qual	
  elas	
  se	
  originaram,	
  tais	
  como	
  temperatura,	
  
umidade,	
  osmoralidade	
  e	
  pH.	
  Além	
  disso,	
  é	
  preciso	
  garantir	
  que	
  a	
  cultura	
  não	
  seja	
  contaminada	
  por	
  bactérias	
  ou	
  outros	
  organismos	
  invasores,	
  como	
  fungos.	
  Não	
  menos	
  importante,	
  é	
  preciso	
  que	
  o	
  meio	
  de	
  cultura	
  contenha	
  todos	
  os	
  nutrientes	
  necessários	
  para	
  o	
  metabolismo	
  das	
  células	
  cultivadas,	
  e	
  que	
  as	
   substâncias	
  excretadas	
   (que	
  podem	
  modificar	
  a	
  acidez	
  do	
  meio	
  e	
   intoxicar	
  ou	
  matar	
  as	
  próprias	
  células)	
   sejam	
  removidas,	
   seja	
  pela	
   substituição	
  periódica	
  do	
  meio	
  de	
   cultura	
  ou	
  pela	
   transferência	
  das	
  células	
  para	
  recipientes	
  com	
  novos	
  meios.	
  
	
  
O	
  meio	
  de	
  cultura	
  é	
  um	
  espécie	
  de	
  “sopa”	
  onde	
  se	
  encontram	
  disponíveis	
  todos	
  os	
  nutrientes	
  
necessários	
   para	
   o	
   desenvolvimento	
   das	
   células	
   em	
   questão,	
   como	
   aminoácidos,	
   açucares,	
  vitaminas	
   e	
   sais	
   minerais.	
   Podem	
   entrar	
   na	
   mistura	
   também	
   proteínas	
   do	
   soro	
   de	
   animais,	
  antibióticos	
  e	
  fungicidas.	
  Osmoralidade	
  e	
  pH	
  também	
  devem	
  estar	
  adequados.	
  	
  Num	
  organismo,	
  cada	
  tipo	
  celular	
  tem	
  suas	
  funções	
  e	
  fisiologia	
  distinta,	
  sendo	
  programado	
  para	
  um	
  determinado	
   número	
   de	
   divisões	
   e	
   tempo	
   de	
   vida.	
   As	
   células	
   da	
   pele,	
   por	
   exemplo,	
   se	
   renovam	
  constantemente,	
  enquanto	
  as	
  células	
  nervosas	
  demoram	
  muito	
  mais.	
  	
  	
  
A	
   cultura	
   de	
   cada	
   tipo	
   celular	
  mantém	
   in	
  vitro	
   as	
  mesmas	
   características	
   que	
   possuiam	
  nos	
  
seus	
  organismos	
  de	
  origem;	
  assim,	
  os	
  fibroplastos	
  (células	
  do	
  tecido	
  conjuntivo)	
  secretam	
  colágeno,	
  células	
  cardíacas	
  se	
  contraem,	
  e	
  as	
  células	
  epiteliais	
  aderem	
  entre	
  si	
   formando	
  uma	
  camada	
  sobre	
  a	
  placa	
  de	
   cultivo.	
  Poder	
   contar	
   com	
   uma	
   população	
   celular	
   homogênea	
   é	
   ideal	
   para	
   testar	
   os	
  
efeitos	
   de	
   diversas	
   condições	
   experimentais,	
   pois	
   elas	
   possuem	
   as	
   mesmas	
   condições	
   de	
   seus	
  tecidos	
  de	
  origem.	
  	
  Geralmente,	
  as	
  culturas	
  celulares	
  só	
  podem	
  ser	
  mantidas	
  por	
  um	
  numero	
  limitado	
  de	
  gerações.	
  Mas	
  
eventualmente,	
  alguns	
  tipos	
  celulares	
  sofrem	
  mutações	
  que	
  tornam	
  ilimitada	
  sua	
  capacidade	
  
de	
   proliferação.	
   Ao	
   contrário	
   das	
   células	
   de	
   câncer	
   que	
   também	
   se	
  multiplicam	
   sem	
   parar,	
   essas	
  células	
  mantém	
  diversas	
  características	
  de	
  suas	
  células	
  de	
  origem.	
  Além	
  das	
  mutações	
  naturais,	
  estas	
  podem	
   ser	
   induzidas	
   por	
   métodos	
   químicos	
   ou	
   infecções	
   virais.	
   Algumas	
   dessas	
   linhagens	
  transformadas,	
  se	
  introduzidas	
  em	
  animais,	
  podem	
  originar	
  tumores,	
  assim	
  como	
  algumas	
  linhagens	
  
transformadas	
  tiveram	
  origem	
  em	
  tumores	
  malignos.	
  Através	
  das	
  linhagens	
  celulares	
  é	
  possível	
  se	
  
obter	
  uma	
  grande	
  quantidade	
  de	
  células	
  homogêneas	
  para	
  experimentos.	
  Estas	
  podem	
  inclusive	
  ser	
  congeladas	
  em	
  nitrogênio	
  líquido	
  e	
  armazenadas	
  para	
  uso	
  posterior.	
  	
  
As	
  células	
  de	
  uma	
  linhagem	
  não	
  são	
  clones	
  das	
  células	
  extraídas	
  de	
  um	
  organismo,	
  pois	
  embora	
  sejam	
  muito	
  semelhantes,	
  não	
  são	
  idênticas.	
  No	
  entanto,	
  uma	
  cultura	
  proveniente	
  de	
  uma	
  única	
  célula	
  é	
  um	
  clone,	
  portanto,	
  vários	
  clones	
  podem	
  ser	
  obtidos	
  de	
  linhagens	
  celulares	
  já	
  estabelecidas.	
  	
  
É	
  possível	
  combinar	
  duas	
  células	
  de	
  origens	
  diferentes,	
  levando	
  a	
  uma	
  única	
  célula	
  que	
  carrega	
  o	
  DNA	
   das	
   duas.	
   Quando	
   as	
   células	
   resultantes	
   contém	
   dois	
   núcleos,	
   são	
   chamadas	
   heterocárions	
  (hetero=diferente,	
   cárion=núcleo),	
   e	
   quando	
   os	
   dois	
   núcleos	
   se	
   fundem	
   num	
   só,	
   temos	
   uma	
   célula	
  
híbrida	
   (ou	
   hibridoma).	
   Essas	
   última	
   são	
   úteis	
   em	
   casos	
   como,	
   por	
   exemplo,	
   quando	
   uma	
   célula	
  híbrida	
   reúne	
   a	
   capacidade	
   de	
   se	
   multiplicar	
   rapidamente	
   (de	
   uma	
   célula	
   cancerosa)	
   aliada	
   à	
  capacidade	
  de	
  secretar	
  linfócitos,	
  sendo	
  utilizada	
  para	
  produzir	
  grandes	
  quantidades	
  de	
  anticorpos.	
  	
  
Células-­‐tronco.	
  São	
  aquelas	
  capazes	
  de	
  se	
  multiplicar	
  e	
  dar	
  origem	
  a	
  qualquer	
  tipo	
  celular.	
  O	
  que	
   induz	
   essa	
   diferenciação	
   é	
   a	
   própria	
   programação	
   genética	
   da	
   célula,	
   assim	
   como	
   os	
   fatores	
  químicos	
  do	
  meio	
  extra-­‐celular.	
  É	
  chamada	
  de	
  pluripotente	
  quando	
  pode	
  dar	
  origem	
  à	
  qualquer	
  tipo	
  celular,	
  e	
  de	
  multipotente	
  quando	
  se	
  diferencia	
  mais	
  ainda	
  assim,	
  pode	
  dar	
  origem	
  a	
  diversos	
  tipos	
  celulares	
  numa	
  mesma	
  categoria.	
  	
  Através	
   das	
   técnicas	
   de	
   cultivo	
   celular,	
   os	
   pesquisadores	
   tentam	
  obter	
   células-­‐tronco	
   e	
   induzir	
   sua	
  diferenciação,	
  in	
  vitro.	
  Com	
  o	
  sucesso	
  dessas	
  pesquisas	
  é	
  possível	
  alcançar	
  a	
  cura	
  para	
  diversos	
  tipos	
  de	
  leucemia	
  (pois	
  as	
  células	
  cancerosas	
  são	
  de	
  um	
  tipo	
  mais	
  diferenciado),	
  fabricar	
  sangue	
  a	
  partir	
  das	
  células-­‐tronco	
  do	
  próprio	
  paciente	
  para	
  utilização	
  em	
  tranfusões	
  e	
  cirurgias.Num	
  futuro	
  ainda	
  mais	
  promissor,	
  existe	
  a	
  possibilidade	
  de	
  regenerar	
  órgãos	
  inteiros,	
  e	
  até	
  mesmo	
  recompor	
  nervos	
  lesados	
  recuperando	
  pessoas	
  paraplégicas	
  ou	
  tetraplégicas.	
  	
  	
   Aula	
  5	
  –	
  Métodos	
  Bioquímicos	
  para	
  o	
  Estudo	
  da	
  Célula	
  	
  Fracionamento	
  Celular	
  	
  Para	
  obter	
  amostras	
  de	
  organelas,	
  é	
  preciso	
  primeiro	
  romper	
  as	
  células.	
  Mas	
  para	
  evitar	
  confusão	
  quanto	
  à	
  de	
  qual	
  tipo	
  celular	
  veio	
  determinada	
  organela,	
  é	
  preciso	
  que	
  a	
  amostra	
  seja	
  homogênea,	
  ou	
  seja,	
  contendo	
  apenas	
  um	
  tipo	
  celular.	
  Essa	
  tarefa	
  será	
  diferente	
  para	
  cada	
  tipo	
  de	
  material.	
  Alguns	
  exemplos:	
  	
  1.	
  	
  2.	
  3.	
  	
  Rompimento	
  Celular	
  	
  No	
  fracionamento	
  celular,	
  o	
  objetivo	
  é	
  romper	
  a	
  membrana	
  plasmática	
  sem	
  romper	
  a	
  membrana	
  das	
  organelas.	
  É	
  difícil	
  fazer	
  isso,	
  mas	
  para	
  cada	
  tipo	
  celular	
  existem	
  técnicas	
  específicas.	
  Dentro	
  os	
  métodos	
  mais	
  usados	
  estão:	
  	
  
Choque	
  osmótico:	
  as	
  células	
  são	
  colocadas	
  em	
  meio	
  hiposmótico	
  (com	
  maior	
  concentração	
  de	
  solutos	
  no	
  exterior	
  do	
  que	
  no	
  interior	
  da	
  célula)	
  até	
  arrebentar.	
  É	
  muito	
  utilizados	
  para	
  romper	
  hemácias.	
  É	
  preciso	
  restaurar	
  a	
  osmolaridade	
  rapidamente	
  para	
  que	
  as	
  membrana	
  das	
  organelas	
  não	
  se	
  rompam	
  também.	
  	
  
Choque	
  térmico:	
  as	
  células	
  são	
  congeladas	
  e	
  descongeladas	
  rapidamente,	
  alternando-­‐se,	
  por	
  exemplo,	
  nitrogênio	
  líquido	
  e	
  água	
  quente.	
  O	
  congelamento	
  da	
  água	
  dentro	
  das	
  células	
  as	
  fazem	
  inchar,	
  e	
  ao	
  serem	
  sbmersas	
  em	
  água	
  quente	
  voltam	
  ao	
  tamanho	
  normal	
  –	
  o	
  repetimento	
  desse	
  processo	
  que	
  rompe	
  as	
  células.	
  	
  
Maceração:	
  pode	
  ser	
  feita	
  com	
  homogeneizadores	
  parecidos	
  com	
  um	
  liquidificador,	
  de	
  modo	
  mais	
  delicado	
  com	
  homogeneizadores	
  de	
  vidro,	
  através	
  do	
  atrito.	
  Pode-­‐se	
  utilizar	
  pequenas	
  pérolas	
  de	
  vidro	
  misturadas	
  à	
  preparação,	
  que	
  ao	
  se	
  chocarem,	
  rompem	
  as	
  células.	
  	
  
Sonificação:	
  todas	
  as	
  estruturas,	
  biológicas	
  ou	
  não,	
  possuem	
  uma	
  frequência	
  de	
  ressonância	
  característica.	
  Uma	
  vibração	
  nessa	
  frequência,	
  com	
  grande	
  intensidade,	
  pode	
  romper	
  a	
  estrutura.	
  Teoricamente	
  é	
  possível	
  usar	
  o	
  ultra-­‐som	
  com	
  uma	
  frequência	
  de	
  vibração	
  e	
  intensidade	
  adequadas	
  ao	
  rompimento	
  da	
  membrana	
  celular,	
  deixando	
  as	
  organelas	
  intactas.	
  Na	
  prática,	
  os	
  aparelhos	
  de	
  ultra-­‐som	
  não	
  possuem	
  controle	
  de	
  intensidade	
  e	
  frequência	
  que	
  permita	
  esses	
  ajustes.	
  	
  
Tratamento	
  com	
  detergente	
  não-­‐iônico:	
  como	
  suas	
  moléculas	
  são	
  anfipáticas	
  (parte	
  hidrofílicas,	
  parte	
  hidrofóbicas),	
  elas	
  conseguem	
  substituir	
  as	
  moléculas	
  de	
  fosfolipídeo	
  na	
  membrana	
  plasmática,	
  causando	
  o	
  rompimento.	
  Os	
  detergentes	
  são	
  usados	
  em	
  baixa	
  concentração	
  e	
  por	
  pouco	
  tempo.	
  	
  Depois	
  do	
  rompimento,	
  os	
  fragmentos	
  de	
  membrana	
  logo	
  se	
  fecham	
  em	
  si	
  mesmos	
  novamente,	
  escondendo	
  da	
  água	
  a	
  porção	
  hidrofóbica	
  da	
  bicamada	
  lipídica,	
  formando	
  pequenas	
  vesículas.	
  Com	
  o	
  rompimento	
  adequado,	
  o	
  resultado	
  é	
  uma	
  solução	
  em	
  que	
  a	
  maioria	
  das	
  células	
  está	
  rompida	
  e	
  as	
  organelas	
  estão	
  livres,	
  e	
  o	
  conteúdo	
  solúvel	
  do	
  citoplasma	
  está	
  misturado	
  no	
  líquido	
  onde	
  as	
  células	
  foram	
  rompidas.	
  	
  Centrifugação	
  diferencial	
  	
  Uma	
  maneira	
  de	
  separar	
  o	
  conteúdo	
  celular	
  em	
  várias	
  frações	
  é	
  usando	
  a	
  força	
  centrífuga,	
  que	
  utiliza-­‐se	
  das	
  diferenças	
  de	
  densidade	
  para	
  separar	
  os	
  componentes	
  celulares.	
  Centrifugando	
  o	
  homogeneizado	
  a	
  baixa	
  velocidade	
  é	
  possível	
  precipitar	
  os	
  componentes	
  mais	
  densos,	
  como	
  as	
  células	
  não	
  rompidas	
  e	
  os	
  núcleos.	
  A	
  uma	
  velocidade	
  maior,	
  conseguiremos	
  precipitar	
  mitocôndrias,	
  lisossomos	
  e	
  cloroplastos,	
  por	
  exemplo.	
  A	
  uma	
  velocida	
  ainda	
  maior,	
  podemos	
  precipitar	
  a	
  chamada	
  fração	
  mitocossomal,	
  formada	
  por	
  vesículas	
  variadas,	
  como	
  a	
  membrana	
  plasmática,	
  o	
  retículo	
  endoplasmático,	
  o	
  complexo	
  de	
  Golgi	
  e	
  os	
  endossomos.	
  Para	
  ter	
  acesso	
  a	
  macromoléculas	
  como	
  o	
  DNA,	
  ribossomos,	
  partículas	
  virais	
  e	
  complexos	
  enzimáticos,	
  são	
  necessárias	
  altíssimas	
  velocidades	
  durante	
  muitas	
  horas.	
  Depois	
  disso,	
  o	
  que	
  resta	
  são	
  os	
  componentes	
  solúveis	
  do	
  citoplasma.	
  	
  Com	
  esse	
  técnica	
  de	
  centrifugação	
  diferencial,	
  não	
  podemos	
  obter	
  organelas	
  totalmente	
  separadas	
  das	
  demais,	
  devido	
  à	
  algumas	
  delas	
  terem	
  densidades	
  muito	
  parecidas.	
  Além	
  disso,	
  organelas	
  do	
  mesmo	
  tipo	
  também	
  podem	
  ter	
  densidades	
  diferentes.	
  Para	
  resolver	
  isso,	
  há	
  um	
  tipo	
  de	
  centrifugação	
  que	
  além	
  da	
  velocidade	
  e	
  do	
  tempo,	
  pode	
  variar	
  também	
  a	
  densidade	
  do	
  meio	
  em	
  que	
  as	
  organelas	
  são	
  centrifugadas.	
  Depois	
  da	
  centrifugação	
  diferencial,	
  e	
  depois	
  recolocamos	
  o	
  produto	
  resultante	
  em	
  soluções	
  gradientes	
  de	
  densidade	
  conhecida,	
  como	
  sacarose	
  para	
  separar	
  organelas,	
  sem	
  exercer	
  efeito	
  osmótico.	
  	
  Nesse	
  último	
  tipo	
  de	
  centrifugação,	
  a	
  medida	
  que	
  a	
  velocidade	
  aumenta	
  o	
  material	
  que	
  está	
  a	
  caminho	
  do	
  fundo	
  encontra	
  densidades	
  cada	
  vez	
  maiores	
  do	
  líquido,	
  tendo	
  mais	
  dificuldade	
  de	
  prosseguir.	
  Quando	
  uma	
  organela	
  encontrar	
  uma	
  região	
  onde	
  a	
  densidade	
  seja	
  igual	
  à	
  sua,	
  entrará	
  em	
  equilíbrio,	
  se	
  estabelecendo	
  ali,	
  podendo	
  ser	
  então	
  recolhida	
  por	
  uma	
  pipeta	
  ou	
  seringa,	
  e	
  dessa	
  forma	
  temos	
  uma	
  porção	
  homogênea	
  de	
  uma	
  determinada	
  organela.	
  	
  O	
  sucesso	
  de	
  todo	
  o	
  processo	
  de	
  fracionamento	
  celular	
  pode	
  ser	
  avaliado	
  de	
  duas	
  maneiras:	
  
	
  
Por	
  microscopia	
  eletrônica,	
  observando	
  em	
  vários	
  momentos	
  quais	
  compentes	
  da	
  célula	
  estão	
  presentes	
  naquela	
  fração,	
  e	
  se	
  eles	
  estão	
  em	
  bom	
  estado	
  ou	
  danificados;Pela	
  dosagem	
  de	
  enzimas	
  marcadoras	
  em	
  todas	
  as	
  frações.	
  Para	
  uma	
  enzima	
  ser	
  marcadora	
  de	
  uma	
  organela,	
  é	
  preciso	
  que	
  ela	
  esteja	
  presente	
  apenas	
  nesta	
  e	
  em	
  nenhum	
  outro	
  lugar	
  da	
  célula,	
  e	
  que	
  essa	
  organela	
  seja	
  encontrada	
  em	
  todos	
  os	
  tipos	
  celulares.	
  	
  A	
  partir	
  dessas	
  frações	
  menores	
  das	
  células	
  contendo	
  organelas	
  purificadas,	
  ou	
  até	
  mesmo	
  de	
  células	
  inteiras,	
  podemos	
  purificar	
  as	
  macromoléculas	
  que	
  desejamos	
  estudar.	
  Existem	
  técnicas	
  adaptadas	
  para	
  proteínas,	
  lipídeos,	
  acidos	
  nucleicos	
  e	
  açucares.	
  Para	
  exemplificar,	
  a	
  seguir	
  estão	
  os	
  princípios	
  das	
  metodologias	
  bioquímicas	
  mais	
  utilizadas	
  em	
  biologia	
  celular:	
  cromatografias	
  e	
  eletroforese.	
  	
  Cromatografia	
  	
  
Cromatografia	
  de	
  partição:	
  é	
  adequada	
  para	
  separação	
  de	
  moléculas	
  pequenas,	
  como	
  lipídeos	
  e	
  aminoácidos.	
  Pode	
  ser	
  feita	
  em	
  papel,	
  com	
  a	
  aplicação	
  da	
  amostra	
  perto	
  de	
  uma	
  das	
  pontas.	
  Mergulhamos	
  essa	
  ponta	
  (mas	
  não	
  a	
  parte	
  em	
  que	
  a	
  amostra	
  está)	
  em	
  um	
  solvente	
  orgânico.	
  Esse	
  solvente	
  vai	
  sendo	
  absorvido	
  pelo	
  papel,	
  e	
  a	
  medida	
  que	
  sobe,	
  dependendo	
  da	
  polaridade	
  (afinidade	
  ou	
  não	
  por	
  água)	
  as	
  moléculas	
  são	
  separadas,	
  de	
  acordo	
  com	
  a	
  facilidade	
  em	
  se	
  diluir	
  no	
  solvente	
  (ou	
  mais	
  de	
  um)	
  utilizado.	
  Quando	
  ao	
  invés	
  do	
  papel	
  se	
  utiliza	
  uma	
  placa	
  coberta	
  por	
  uma	
  fina	
  camada	
  de	
  sílica,	
  chamamos	
  de	
  cromatografia	
  em	
  camada	
  
simples,	
  cujo	
  processo	
  é	
  praticamente	
  o	
  mesmo.	
  	
  
Cromatografia	
  em	
  coluna:	
  preenche-­‐se	
  uma	
  coluna	
  (geralmente	
  de	
  vidro)	
  com	
  resina,	
  e	
  aplica-­‐se	
  a	
  amostra	
  sobre	
  a	
  mesma.	
  A	
  medida	
  que	
  a	
  resina	
  é	
  recolhida	
  no	
  final	
  da	
  coluna	
  e	
  adicionada	
  sobre	
  a	
  amostra,	
  e	
  a	
  medida	
  que	
  esta	
  é	
  obrigada	
  a	
  percorrer	
  toda	
  a	
  coluna,	
  algumas	
  moléculas	
  vão	
  ficando	
  presas	
  na	
  resina.	
  Esse	
  processo	
  é	
  chamado	
  eluição,	
  e	
  pode	
  levar	
  de	
  minutos	
  à	
  dias,	
  dependendo	
  do	
  tamanho	
  da	
  coluna.	
  Diferentes	
  tipos	
  de	
  separação	
  dependem	
  do	
  tipo	
  da	
  resina,	
  que	
  podem	
  ser	
  três:	
  	
   1. Filtração	
  em	
  gel:	
  a	
  resina	
  é	
  formada	
  por	
  microesferas,	
  perfuradas	
  por	
  poros	
  de	
  tamanho	
  definido	
  (dependendo	
  da	
  molécula	
  que	
  se	
  pretende	
  separar).	
  Conforme	
  a	
  amostra	
  vai	
  descendo	
  pelo	
  tubo,	
  as	
  moléculas	
  maiores	
  que	
  esses	
  poros	
  passam	
  direto	
  e	
  logo	
  saem	
  da	
  coluna,	
  enquanto	
  as	
  menores	
  se	
  encaixam	
  nos	
  poros	
  e	
  demoram	
  mais	
  a	
  sair.	
  Assim,	
  separa-­‐se	
  as	
  moléculas	
  pelo	
  tamanho,	
  como	
  por	
  exemplo	
  proteínas	
  de	
  diferentes	
  pesos	
  moleculares.	
  	
   2. Troca	
  iônica:	
  a	
  amostra	
  percorrem	
  uma	
  resina	
  formada	
  por	
  microesferas	
  eletricamente	
  carregadas,	
  e	
  as	
  moléculas	
  com	
  carga	
  oposta	
  à	
  dessas	
  microesferas	
  ficam	
  presas	
  nas	
  mesmas.	
  	
  	
   3. Afinidade:	
  as	
  microesferas	
  da	
  resina	
  são	
  cobertas	
  por	
  moléculas	
  específicas,	
  que	
  se	
  encaixam	
  com	
  as	
  moléculas	
  que	
  se	
  deseja	
  separar	
  na	
  amostra.	
  Em	
  geral,	
  essas	
  microesferas	
  são	
  revestidas	
  com	
  anticorpos,	
  que	
  se	
  encaixam	
  com	
  moléculas	
  específicas.	
  	
  Eletrofosere	
  	
  É	
  uma	
  técnica	
  importante	
  para	
  o	
  estudo	
  de	
  macromoléculas	
  como	
  proteínas	
  e	
  ácidos	
  nucleicos,	
  e	
  se	
  baseia	
  no	
  estudo	
  do	
  comportamento	
  das	
  mesmas	
  num	
  campo	
  elétrico.	
  Serve	
  para	
  medir	
  moléculas	
  pela	
  seu	
  tamanho	
  (massa	
  molecular)	
  e	
  é	
  comumente	
  usado	
  para	
  testar	
  a	
  pureza	
  de	
  uma	
  amostra.	
  	
  	
  
Geralmente	
  as	
  macromoléculas	
  são	
  eletricamente	
  carregadas:	
  os	
  ácidos	
  nucleicos	
  são	
  negativos	
  e	
  as	
  proteínas	
  podem	
  ser	
  positivas	
  ou	
  negativas	
  (dependendo	
  do	
  pH	
  onde	
  estão).	
  Portanto,	
  quando	
  colocados	
  num	
  campo	
  elétrico,	
  os	
  ácidos	
  nucleicos	
  sempre	
  vão	
  pro	
  lado	
  positivo,	
  enquanto	
  as	
  proteínas	
  podem	
  ir	
  para	
  qualquer	
  um	
  dos	
  dois,	
  dependendo	
  do	
  pH.	
  	
  	
  Na	
  eletroforese	
  é	
  usado	
  um	
  suporte	
  sólido,	
  geralmente	
  uma	
  gelatina,	
  ou	
  apenas	
  o	
  gel,	
  que	
  contém	
  poros	
  com	
  o	
  tamanho	
  definido	
  de	
  acordo	
  com	
  as	
  moléculas	
  que	
  passarão	
  em	
  direção	
  ao	
  pólo	
  com	
  a	
  carga	
  oposta	
  à	
  sua.	
  Além	
  disso,	
  as	
  moléculas	
  mais	
  mesadas	
  demoram	
  mais	
  pra	
  passar	
  pela	
  malha	
  do	
  gel.	
  Portanto,	
  ácidos	
  nucleicos	
  ou	
  proteínas	
  são	
  separados	
  pelo	
  seu	
  peso	
  molecular.	
  	
  	
  Dependendo	
  da	
  macromolécula,	
  proteínas	
  ou	
  ácidos	
  nucleicos,	
  a	
  composição	
  do	
  gel	
  é	
  diferente.	
  Para	
  separar	
  o	
  DNA	
  usamos	
  gel	
  de	
  agarose	
  (derivado	
  de	
  amido),	
  para	
  separar	
  proteínas	
  usamos	
  poliacrilamida.	
  No	
  caso	
  dos	
  ácidos	
  nucleicos,	
  como	
  eles	
  são	
  muito	
  grandes,	
  o	
  gel	
  de	
  agarose	
  possui	
  poros	
  grandes	
  o	
  suficientes	
  para	
  permitir	
  a	
  passagem	
  dos	
  mesmos.	
  	
  	
  No	
  caso	
  das	
  proteínas,	
  é	
  adicionado	
  ainda	
  o	
  detergente	
  SDS:	
  ele	
  faz	
  com	
  que	
  a	
  proteína	
  fique	
  quase	
  linear	
  (o	
  que	
  ajuda	
  na	
  passagem	
  pelos	
  poros,	
  e	
  permite	
  considerar	
  apenas	
  sua	
  carga	
  elétrica	
  e	
  massa),	
  e	
  ainda	
  dá	
  a	
  ela	
  carga	
  negativa	
  (nas	
  ligações	
  peptídicas),	
  o	
  que	
  faz	
  com	
  que	
  seja	
  atraída	
  para	
  o	
  pólo	
  positivo	
  durante	
  a	
  eletroforese.	
  	
  O	
  processo	
  ocorre	
  da	
  seguinte	
  maneira:	
  	
   1. Entre	
  duas	
  placas	
  de	
  vidro,	
  é	
  colocado	
  o	
  gel	
  ainda	
  líquido,	
  que	
  endurece	
  com	
  o	
  tempo	
  à	
  temperatura	
  ambiente.	
  Enquanto	
  ainda	
  está	
  líquido,	
  é	
  encaixada	
  no	
  topo	
  entre	
  as	
  duas	
  placas	
  uma	
  peça	
  chamada	
  “pente”,	
  que	
  ao	
  ser	
  retirada	
  depois	
  do	
  gel	
  se	
  solidificar,	
  deixa	
  no	
  mesmo	
  os	
  espaços	
  nos	
  quais	
  serão	
  colocadas	
  as	
  amostras.	
  	
   2. Para	
  que	
  a	
  corrente	
  elétrica	
  possa	
  fluir	
  pelo	
  gel,	
  é	
  colocada	
  uma	
  solução	
  tampão.	
  Em	
  seguida	
  são	
  colocadasas	
  amostras.	
  Um	
  delas	
  é	
  uma	
  amostra	
  padrão,	
  de	
  proteínas	
  de	
  pesos	
  moleculares	
  conhecidos,	
  para	
  servir	
  de	
  comparação.	
  	
   3. O	
  aparelho	
  é	
  ligado,	
  e	
  a	
  corrente	
  elétrica	
  passa	
  pelas	
  amostras	
  separando	
  as	
  moléculas.	
  As	
  moléculas	
  maiores	
  “correm”menos	
  pela	
  trama,	
  enquanto	
  as	
  menores	
  “correm”	
  mais.	
  	
   4. Após	
  isso,	
  o	
  gel	
  é	
  retirado	
  e	
  é	
  utilizado	
  um	
  corante	
  especial	
  para	
  a	
  molécula	
  em	
  questão.	
  Os	
  resultados	
  são	
  entao	
  analizados.	
  	
  Eletrotransferência	
  	
  Ás	
  vezes	
  é	
  necessário	
  testar	
  se	
  algum	
  proteína	
  presente	
  no	
  gel	
  é	
  reconhecida	
  por	
  um	
  anticorpo	
  específico.	
  Como	
  os	
  anticorpos	
  são	
  moléculas	
  grandes	
  demais	
  para	
  entrar	
  no	
  gel	
  (e	
  não	
  se	
  pode	
  desnaturá-­‐las,	
  pois	
  assim	
  não	
  funcionam),	
  precisamos	
  tirar	
  as	
  proteínas	
  do	
  gel	
  sem	
  misturá-­‐las	
  novamente	
  e	
  transferí-­‐las	
  para	
  um	
  papel	
  chamado	
  nitrocelulose.	
  Colocamos	
  a	
  “membrana”	
  de	
  nitrocelulose	
  sobre	
  a	
  placa	
  de	
  gel,	
  mergulhados	
  numa	
  solução	
  tampão,	
  e	
  uma	
  corrente	
  elétrica	
  passa	
  no	
  sentido	
  perpendicular,	
  tranferindo	
  as	
  proteínas	
  do	
  gel	
  para	
  o	
  papel,	
  estando	
  então	
  expostas	
  para	
  os	
  testes	
  com	
  anticorpos.	
  Esse	
  método	
  se	
  chama	
  eletrotransferência,	
  ou	
  Western	
  blottin.	
  	
  DUVIDA:	
  Western	
  blottin	
  direto	
  e	
  indireto,	
  “banda”visível	
  etc	
  	
  Eletroforese	
  bidimensional	
  	
  Citometria	
  de	
  fluxo	
  (ver	
  ultimo	
  exercicio	
  da	
  aula	
  5)	
  	
  	
  
Aula	
  6	
  –	
  O	
  Uso	
  de	
  Anticorpos	
  na	
  Pesquisa	
  	
  Anticorpos	
  (ou	
  imunoglobulinas)	
  são	
  proteínas	
  que	
  marcam	
  substâncias	
  ou	
  partículas	
  estranhas	
  (antígenos),	
  identificando-­‐as	
  para	
  os	
  fagócitos,	
  que	
  por	
  sua	
  vez	
  destroem	
  o	
  antígeno,	
  defendendo	
  nosso	
  organismo.	
  Eles	
  são	
  produzidos	
  por	
  um	
  tipo	
  de	
  leucócito,	
  que	
  é	
  célula	
  sanguínea	
  (assim	
  como	
  as	
  hemácias	
  e	
  as	
  plaquetas)	
  mais	
  conhecida	
  como	
  glóbulo	
  branco.	
  Ele	
  se	
  subdivide	
  em	
  vários	
  tipos:	
  os	
  granulócitos	
  (neutrófilos,	
  eosinófilos	
  e	
  basófilos),	
  monócitos	
  e	
  linfócitos,	
  que	
  no	
  momento	
  são	
  os	
  que	
  interessam	
  aqui.	
  Dentre	
  os	
  linfócitos,	
  existem	
  os	
  do	
  tipo	
  T	
  e	
  B;	
  ambos	
  são	
  produzidos	
  na	
  medula	
  óssea,	
  porém	
  o	
  tipo	
  T	
  amadurece	
  num	
  órgão	
  chamado	
  timo	
  (eis	
  o	
  porque	
  da	
  sigla),	
  um	
  órgão	
  linfático	
  envolvido	
  na	
  defesa	
  do	
  organismo	
  (sistema	
  imunológico).	
  Já	
  o	
  tipo	
  B	
  amadurecem	
  na	
  própria	
  medula	
  óssea	
  (em	
  inglês	
  “bone	
  marrow”,	
  eis	
  o	
  porque	
  da	
  sigla).	
  São	
  eles,	
  os	
  linfócitos	
  B,	
  que	
  quando	
  se	
  
tornam	
  ativos	
  (e	
  então	
  chamados	
  plasmócitos),	
  produzem	
  os	
  anticorpos	
  em	
  resposta	
  à	
  presença	
  de	
  um	
  antígeno.	
  Depois	
  de	
  produzidos,	
  os	
  anticorpos	
  são	
  lançados	
  na	
  corrente	
  sanguínea	
  ou	
  ficam	
  aderidos	
  à	
  superfície	
  do	
  plasmócito.	
  	
  Os	
  anticorpos	
  possuem	
  a	
  forma	
  de	
  Y,	
  com	
  os	
  “braços”	
  ligando-­‐se	
  aos	
  antígenos	
  em	
  questão	
  e	
  marcando-­‐os	
  para	
  serem	
  destruídos,	
  através	
  da	
  “cauda”	
  que	
  é	
  reconhecida	
  por	
  células	
  encarregadas	
  de	
  fagocitar	
  o	
  organismo	
  ou	
  molécula	
  invasora.	
  Na	
  sua	
  estrutura	
  há	
  duas	
  cadeias	
  leves	
  e	
  duas	
  cadeias	
  pesadas	
  idênticas.	
  Nas	
  extremidades	
  dos	
  braços	
  estão	
  as	
  regiões	
  variáveis,	
  que	
  são	
  específicas	
  para	
  cada	
  antígeno.	
  A	
  região	
  constante	
  o	
  distingue	
  em	
  uma	
  das	
  cinco	
  classes	
  de	
  anticorpos.	
  	
  Imunoglobulina	
  G,	
  M,	
  A,	
  etc.	
  Ponte	
  dissulfeto	
  etc	
  	
  
O	
  uso	
  de	
  anticorpos	
  é	
  uma	
  maneira	
  bastante	
  prática	
  de	
  localizar	
  moléculas	
  específicas	
  dentro	
  
das	
  células.	
  Quando	
  uma	
  molécula	
  estranha	
  é	
  introduzida	
  num	
  animal	
  (por	
  exemplo,	
  uma	
  proteína	
  que	
  ele	
  não	
  produz),	
  os	
  linfócitos	
  B	
  (plasmócitos)	
  produzirão	
  grande	
  quantidade	
  de	
  anticorpos	
  para	
  se	
  ligar	
  à	
  molécula	
  invasora.	
  O	
  soro	
  desse	
  animal,	
  agora	
  rico	
  nesses	
  anticorpos	
  específicos,	
  pode	
  então	
  ser	
  usado	
  para	
  detectar	
  essa	
  molécula	
  específica	
  em	
  outras	
  células	
  ou	
  animais.	
  O	
  soro	
  é	
  geralmente	
  extraído	
  do	
  baço	
  do	
  animal,	
  órgão	
  onde	
  os	
  linfócitos	
  são	
  produzidos.	
  	
  Dúvida:	
  os	
  anticorpos	
  dentro	
  do	
  corpo	
  não	
  olham	
  para	
  os	
  novos	
  anticorpos	
  introduzidos	
  como	
  “invasores”?	
  No	
  caso	
  das	
  vacinas,	
  são	
  injetados	
  anticorpos	
  ou	
  linfócitos	
  B	
  produtores	
  desses	
  anticorpos?	
  	
  Nesse	
  ponto,	
  surgem	
  duas	
  questões:	
  primeira;	
  na	
  extração	
  do	
  soro,	
  muitas	
  vezes	
  o	
  animal	
  é	
  sacrificado,	
  e	
  naqueles	
  que	
  sobrevivem,	
  a	
  concentração	
  daquele	
  anticorpo	
  diminui	
  bastante	
  depois	
  de	
  algum	
  tempo,	
  não	
  sendo	
  úteis	
  para	
  uma	
  nova	
  extração.	
  E	
  segunda;	
  um	
  antígeno	
  será	
  reconhecido,	
  através	
  de	
  partes	
  diferentes	
  de	
  si	
  mesmo,	
  por	
  vários	
  linfócitos	
  B	
  (plasmócitos)	
  que	
  a	
  partir	
  daí,	
  vão	
  se	
  dividir	
  e	
  secretar	
  anticorpos	
  capazes	
  de	
  reconhecer	
  determinadas	
  regiões	
  (chamadas	
  epítopos)	
  daquele	
  antígeno.	
  Cada	
  um	
  desses	
  linfócitos	
  estimulados	
  a	
  se	
  dividir	
  estarão	
  gerando	
  clones	
  de	
  si	
  mesmos,	
  mas	
  como	
  todos	
  os	
  anticorpos	
  produzidos	
  serão	
  capazes	
  de	
  reconhecer	
  o	
  mesmo	
  antígeno	
  (mesmo	
  que	
  através	
  de	
  epítopos	
  diferentes),	
  são	
  chamados	
  de	
  policlonais	
  (conjunto	
  de	
  diferentes	
  tipos	
  de	
  clones,	
  voltados	
  para	
  o	
  mesmo	
  antígeno).	
  	
  Já	
  a	
  produção	
  de	
  anticorpos	
  de	
  um	
  único	
  tipo,	
  específicos	
  para	
  determinada	
  região	
  do	
  antígeno,	
  é	
  possível	
  a	
  partir	
  do	
  cultivo	
  de	
  hibridomas,	
  que	
  são	
  culturas	
  celulares	
  resultantes	
  de	
  células	
  híbridas	
  que	
  possuem	
  características	
  interessantes	
  de	
  duas	
  espécies	
  originais.	
  Como	
  esses	
  anticorpos	
  são	
  clones	
  produzidos	
  a	
  partir	
  de	
  um	
  tipo	
  de	
  linfócito	
  apenas,	
  são	
  chamados	
  monoclonais.	
  Além	
  de	
  serem	
  muito	
  específicos,	
  outra	
  vantagem	
  dos	
  anticorpos	
  monoclonais	
  é	
  que,como	
  provém	
  de	
  culturas	
  celulares,	
  sua	
  produção	
  pode	
  ser	
  contantemente	
  mantida	
  (se	
  nada	
  der	
  errado	
  e	
  compormeter	
  o	
  cultivo).	
  Duvida:	
  pode-­‐se	
  gerar	
  anticorpos	
  policlonais	
  a	
  partir	
  de	
  cultura	
  de	
  células?	
  Já	
  a	
  desvantagem	
  é	
  que	
  nem	
  todos	
  os	
  hibridomas	
  secretam	
  anticorpos	
  interessantes,	
  e	
  a	
  seleção	
  dos	
  que	
  interessam	
  é	
  muito	
  trabalhosa.	
  	
  	
  
Como	
  já	
  vimos,	
  para	
  a	
  produção	
  de	
  anticorpos	
  são	
  aplicados	
  antígenos	
  em	
  animais,	
  que	
  depois	
  possuem	
  seu	
  soro	
  extraído	
  rico	
  nos	
  linfócitos	
  B	
  específicos.	
  No	
  entanto,	
  para	
  conseguir	
  linhagens	
  monoclonais,	
  é	
  preciso	
  separar	
  linfócito	
  por	
  linfócito,	
  cada	
  uma	
  isolada	
  num	
  poço	
  diferente	
  de	
  uma	
  placa.	
  Células	
  de	
  mielomas	
  (com	
  rápida	
  e	
  constante	
  capacidade	
  de	
  multiplicação)	
  são	
  misturadas	
  junto	
  com	
  polietilenoglicol	
  (PEG,	
  que	
  promove	
  a	
  fusão	
  de	
  membranas),	
  e	
  são	
  formadas	
  hibridomas,	
  que	
  produzem	
  os	
  anticorpos	
  indefinidamente.	
  Apenas	
  algumas	
  fusões	
  serão	
  bem	
  sucedidas,	
  porém,	
  ao	
  serem	
  cultivadas	
  em	
  meio	
  HAT,	
  só	
  as	
  células	
  híbridas	
  conseguirão	
  prosperar,	
  pois	
  as	
  mielomas	
  não	
  sobrevivem	
  nesse	
  meio,	
  e	
  os	
  linfócitos	
  morrem	
  naturalmente	
  em	
  poucas	
  semanas.	
  Após	
  analisados	
  e	
  descobertos	
  os	
  poços	
  onde	
  os	
  anticorpos	
  estão	
  sendo	
  produzidos,	
  um	
  único	
  linfócito	
  é	
  isolado	
  e	
  a	
  partir	
  dele	
  clones	
  são	
  gerados.	
  	
  	
  Como	
  já	
  se	
  sabe,	
  os	
  anticorpos	
  são	
  umas	
  ferramentas	
  muito	
  útil	
  e	
  prática	
  na	
  identificação	
  de	
  moléculas.	
  Além	
  de	
  também	
  identificar	
  sua	
  função	
  celular,	
  eles	
  mostram	
  a	
  distribuição	
  das	
  moléculas	
  fora	
  e	
  dentro	
  da	
  célula,	
  servindo	
  como	
  marcadores	
  moleculares.	
  	
  	
  Devido	
  aos	
  seus	
  dois	
  braços,	
  os	
  anticorpos	
  tendem	
  a	
  aglutinar	
  as	
  moléculas	
  antígenas,	
  concentrando-­‐as	
  e	
  facilitando	
  sua	
  identificação	
  pelas	
  células	
  fagocitadoras.	
  	
  	
  Epítopo	
  linear	
  e	
  conformacional	
  	
  Há	
  muitas	
  situações	
  em	
  que	
  anticorpos	
  são	
  úteis	
  em	
  pesquisas	
  e	
  análises	
  clínicas.	
  Eles	
  podem	
  detectar	
  antígenos	
  nas	
  células,	
  se	
  ligando	
  à	
  elas	
  e	
  sendo	
  depois	
  utilizado	
  um	
  corante	
  ou	
  fluocromo	
  para	
  identificá-­‐los.	
  Fluocromos	
  são	
  marcadores	
  fluorescentes	
  que	
  se	
  ligam	
  às	
  moléculas	
  que	
  se	
  ligam	
  especificamente	
  a	
  certos	
  compostos	
  celulares,	
  no	
  caso,	
  os	
  anticorpos.	
  Nesse	
  caso	
  dos	
  fluocromos,	
  é	
  utilizado	
  o	
  microscópio	
  de	
  fluorescência.	
  	
  Os	
  anticorpos	
  podem	
  ser	
  utilizados	
  também	
  para	
  purificar	
  amostras,	
  de	
  maneira	
  muito	
  semelhante	
  ao	
  processo	
  de	
  cromatografia	
  por	
  afinidade.	
  Só	
  que	
  a	
  invés	
  de	
  uma	
  coluna,	
  as	
  microesferas	
  cobertas	
  de	
  anticorpos	
  são	
  misturadas	
  à	
  amostra,	
  e	
  a	
  mistura	
  é	
  centrifugada	
  a	
  uma	
  velocidade	
  baixa,	
  apenas	
  para	
  precipitar	
  as	
  microesferas	
  com	
  as	
  proteínas	
  “pescadas”	
  no	
  processo.	
  	
  Por	
  ser	
  muito	
  difícil	
  marcar	
  os	
  anticorpos	
  com	
  uma	
  enzima,	
  ou	
  corante,	
  ou	
  fluocromo,	
  são	
  utilizados	
  
anticorpos	
  secundários,	
  que	
  reconhecem	
  outros	
  anticorpos,	
  estes	
  ditos	
  primários.	
  (quando	
  o	
  fluocromo	
  é	
  utilizado	
  no	
  anticorpo	
  primário,	
  o	
  método	
  é	
  chamado	
  de	
  imunofluorescência	
  direta;	
  se	
  estiver	
  ligado	
  ao	
  secundário,	
  método	
  mais	
  comum,	
  chama-­‐se	
  imunofluorescência	
  indireta).	
  Por	
  exemplo,	
  se	
  injetarmos	
  anticorpos	
  humanos	
  numa	
  cabra,	
  ela	
  produzirá	
  seus	
  próprios	
  anticorpos	
  contra	
  os	
  anticorpos	
  invasores;	
  os	
  anticorpos	
  da	
  cabra	
  seriam	
  anticorpos	
  secundários,	
  que	
  por	
  sua	
  vez	
  serão	
  acoplados	
  à	
  fluocromos,	
  ou	
  enzimas,	
  ou	
  ouro	
  coloidal,	
  e	
  usados	
  como	
  ferramentas	
  para	
  reconhecer	
  onde	
  estão	
  os	
  anticorpos	
  primários,	
  que	
  por	
  sua	
  vez	
  estarão	
  ligados	
  nos	
  antígenos	
  que	
  eles	
  reconhecem.	
  Dúvida:	
  porque	
  os	
  anticorpos	
  primários	
  não	
  tratam	
  os	
  secundários	
  como	
  antígenos?	
  	
  ELISA	
  (não	
  entendi	
  bulhufas)	
  é	
  uma	
  técnica	
  que	
  se	
  baseia	
  no	
  reconhecimento	
  de	
  um	
  antígeno	
  por	
  um	
  anticorpo.	
  O	
  ELISA	
  direto	
  é	
  utilizado	
  para	
  identificar	
  um	
  antígeno	
  presente	
  na	
  amostra,	
  colocando-­‐se	
  um	
  anticorpo	
  primário	
  contra	
  esse	
  antígeno,	
  que	
  irá	
  ou	
  não	
  aderir	
  à	
  este.	
  A	
  identificação	
  é	
  feita	
  com	
  um	
  anticorpo	
  secundário	
  marcado	
  com	
  peroxidase.	
  O	
  ELISA	
  indireto	
  é	
  utilizado	
  para	
  identificar	
  um	
  anticorpo	
  em	
  determinado	
  soro,	
  utilizando-­‐se	
  um	
  antígeno.	
  Se	
  houver	
  um	
  anticorpo	
  compatível,	
  ele	
  irá	
  aderir	
  ao	
  antígeno,	
  e	
  a	
  identificação	
  se	
  dá	
  com	
  um	
  anticorpo	
  secundário	
  marcado	
  por	
  peroxidase.	
  	
  	
   Aula	
  7	
  –	
  Estrutura	
  da	
  Membrana	
  Plasmática	
  
A	
  membrana	
  celular	
  é	
  a	
  base	
  da	
  vida	
  como	
  a	
  conhecemos.	
  Ela	
  delimita	
  o	
  meio	
  intracelular	
  do	
  
extracelular,	
  e	
  por	
  ser	
  fluída,	
  é	
  capaz	
  de	
  “controlar”	
  tudo	
  o	
  que	
  entra	
  (nutrientes)	
  e	
  tudo	
  o	
  que	
  
sai	
  (excreções	
  e	
  secreções)	
  da	
  célula,	
  tendo	
  o	
  objetivo	
  de	
  criar	
  um	
  ambiente	
  diferenciado	
  do	
  
meio	
  exterior.	
  É	
  composta	
  por	
  uma	
  bicamada	
  lipídica,	
  proteínas	
  e	
  carboidratos	
  (também	
  
chamados	
  glicídeos).	
  Dentro	
  das	
  células,	
  as	
  organelas	
  também	
  possuem	
  membrana	
  (neste	
  
caso,	
  ela	
  é	
  chamada	
  endomembrana).	
  	
  Composição	
  química	
  	
  
Lipídios:	
  estão	
  subdivididos	
  em	
  	
  	
  
Fosfolipídios:	
  compõem	
  a	
  maior	
  parte	
  da	
  membrana	
  celular.	
  Seu	
  nome	
  significa	
  que	
  possuem	
  um	
  grupo	
  fosfato	
  (hidrofílico,	
  voltado	
  para	
  o	
  exterior)	
  junto	
  a	
  duas	
  cadeias	
  de	
  ácido	
  graxo	
  (hidrofóbicas,	
  voltadas	
  para	
  o	
  interior	
  da	
  bicamada).	
  Uma	
  dessas	
  cadeias	
  é	
  saturada	
  (sem	
  ligações	
  duplas	
  entre	
  os	
  átomos	
  de	
  carbono),	
  e	
  a	
  outra	
  pode	
  ser	
  tanto	
  saturada	
  quanto	
  insaturada.	
  A	
  estrutura	
  da	
  membrana	
  se	
  deve	
  a	
  essa	
  camada	
  dupla	
  de	
  fosfolipídios,que	
  são	
  responsáveis	
  por	
  sua	
  fluidez	
  e	
  permeabilidade.	
  Por	
  serem	
  ao	
  mesmo	
  tempo	
  polares	
  e	
  apolares,	
  são	
  consideradas	
  moléculas	
  anfipáticas,	
  ou	
  seja,	
  enquanto	
  a	
  parte	
  hidrofílica	
  interage	
  bem	
  com	
  a	
  água,	
  a	
  hidrofóbica	
  busca	
  “esconder-­‐se”	
  da	
  mesma.	
  Há	
  também	
  outros	
  tipos	
  de	
  lipídios	
  na	
  membrana,	
  e	
  são	
  eles:	
  os	
  esteróis	
  e	
  os	
  glicolipídios.	
  	
  
Glicolipídios:	
  quando	
  lipídios	
  em	
  contato	
  com	
  o	
  meio	
  extracelular	
  se	
  ligam	
  à	
  carboidratos,	
  formam-­‐se	
  os	
  glicolipídios.	
  Estes	
  resultam	
  da	
  associação	
  entre	
  um	
  glicídio	
  (hidrofílico)	
  e	
  duas	
  cadeias	
  de	
  ácidos	
  graxos	
  (hidrofóbicos).	
  Estão	
  presente	
  apenas	
  no	
  lado	
  da	
  membrana	
  voltado	
  para	
  o	
  meio	
  extracelular.	
  Se	
  comportam	
  de	
  maneira	
  semelhante	
  aos	
  fosfolipídios	
  em	
  meio	
  aquoso,	
  e	
  são	
  um	
  componente	
  fundamental	
  do	
  
glicocálix,	
  que	
  por	
  sua	
  vez	
  atua	
  no	
  reconhecimento	
  celular.	
  
	
  
Esteróis:	
  o	
  colesterol	
  é	
  o	
  esterol	
  mais	
  importante	
  nas	
  membranas	
  celulares	
  dos	
  animais.	
  Suas	
  moléculas	
  além	
  de	
  rígidas	
  são	
  também	
  anfipáticas,	
  e	
  se	
  dispõem	
  entre	
  as	
  
moléculas	
  dos	
  fosfolipídios,	
  conferindo	
  maior	
  rigidez	
  à	
  membrana	
  e	
  aumentando	
  sua	
  resistência	
  à	
  deformação.	
  Assim,	
  quanto	
  mais	
  ricas	
  em	
  colesterol,	
  mais	
  rígidas	
  são	
  as	
  membranas.	
  No	
  entanto	
  elas	
  dificultam	
  a	
  cristalização	
  da	
  membrana	
  em	
  baixas	
  
temperaturas,	
  por	
  não	
  permitir	
  que	
  os	
  fosfolipídios	
  se	
  aproximem	
  muito,	
  impedindo	
  que	
  se	
  formem	
  os	
  cristais.	
  Isso	
  ajuda	
  muitos	
  organismos	
  sujeitos	
  a	
  grandes	
  variações	
  de	
  temperatura.	
  Membranas	
  de	
  fungos,	
  plantas	
  e	
  alguns	
  protozoários	
  podem	
  conter	
  outros	
  tipos	
  de	
  esterol.	
  	
  
Proteínas:	
  são	
  os	
  principais	
  componentes	
  funcionais	
  da	
  membrana;	
  conferem	
  individualidade	
  à	
  célula,	
  e	
  portanto,	
  delas	
  dependem	
  as	
  atividades	
  específicas	
  de	
  cada	
  tipo	
  celular.	
  Podem	
  se	
  ligar	
  à	
  carboidratos	
  no	
  lado	
  extracelular	
  da	
  membrana,	
  dando	
  origem	
  a	
  glicoproteínas.	
  São	
  como	
  “ilhas”	
  à	
  deriva	
  num	
  mar	
  de	
  lipídios,	
  que	
  “navegam”	
  lateralmente,	
  podendo	
  até	
  girar	
  em	
  seu	
  próprio	
  eixo	
  –	
  aliás,	
  esse	
  conceito	
  é	
  chamado	
  de	
  Modelo	
  do	
  mosaico	
  fluído.	
  Mais	
  detalhes	
  sobre	
  as	
  proteínas	
  estão	
  na	
  próxima	
  aula.	
  
	
  
Carboidratos:	
  também	
  conhecidos	
  como	
  glicídios,	
  sacarídeos	
  ou	
  açucares,	
  estão	
  sempre	
  voltados	
  para	
  o	
  meio	
  extracelular,	
  e	
  formam	
  uma	
  camada	
  chamada	
  glicocálix	
  (juntos	
  com	
  as	
  glicoproteínas).	
  Este	
  é	
  formado	
  pela	
  associação	
  dos	
  carboidratos	
  com	
  as	
  proteínas	
  e	
  os	
  lipídios,	
  formando	
  as	
  glicoproteínas	
  e	
  os	
  glicolipídios,	
  que	
  tem	
  por	
  função	
  o	
  reconhecimento	
  químico	
  da	
  célula	
  em	
  relação	
  ao	
  exterior.	
  Também	
  a	
  lubrifica	
  e	
  aprotege	
  de	
  ácidos	
  e	
  enzimas,	
  evita	
  que	
  alguns	
  tipos	
  de	
  vírus	
  e	
  bactérias	
  ne	
  anexem	
  a	
  membrana,	
  e	
  lhe	
  confere	
  carga	
  negativa.	
  	
  As	
  enzimas	
  que	
  acrescentam	
  os	
  açúcares	
  aos	
  lipídios	
  e	
  às	
  proteínas	
  são	
  produzidas	
  no	
  interior	
  do	
  retículo	
  endoplasmático	
  e	
  do	
  complexo	
  de	
  Golgi,	
  e	
  quando	
  são	
  inseridos	
  na	
  membrana	
  celular	
  o	
  conteúdo	
  interno	
  das	
  vesículas,	
  contendo	
  os	
  açucares	
  produzidos,	
  a	
  atravessam	
  chegando	
  ao	
  meio	
  extracelular.	
  
	
  Os	
  espaços	
  entre	
  as	
  células	
  frequentemente	
  são	
  preenchidos	
  com	
  açúcares	
  especiais,	
  como	
  por	
  exemplo	
  a	
  celulose	
  (formada	
  pela	
  polimerização	
  da	
  glicose),	
  que	
  forma	
  a	
  parede	
  celular	
  dos	
  vegetais.	
  	
  O	
  tecido	
  conjuntivo	
  e	
  o	
  cartilaginoso	
  também	
  são	
  formados	
  em	
  grande	
  parte	
  por	
  carboidratos,	
  formando	
  as	
  proteoglicanas:	
  moléculas	
  muito	
  longas	
  e	
  ramificadas	
  que	
  funcionam	
  como	
  esponjas,	
  ajudando	
  na	
  retenção	
  da	
  água	
  por	
  esses	
  tecidos.	
  	
  	
  A	
  fluidez	
  da	
  bicamada	
  lipídica	
  	
  Nas	
  membranas	
  naturais,	
  é	
  importante	
  que	
  elas	
  não	
  sejam	
  nem	
  muito	
  fluídas	
  nem	
  muito	
  rígidas	
  para	
  desempenharem	
  suas	
  funçoes	
  de	
  maneira	
  eficiente.	
  Os	
  lipídios	
  podem	
  se	
  mover	
  livremente	
  no	
  plano	
  lateral	
  da	
  membrana,	
  assim	
  como	
  rodar	
  em	
  seu	
  próprio	
  eixo,	
  e	
  esses	
  movimentos	
  que	
  dão	
  fluidez	
  à	
  membrana.	
  Além	
  disso,	
  as	
  cadeias	
  carbônicas	
  do	
  ácidos	
  graxo	
  também	
  podem	
  flexionar-­‐se.	
  No	
  entanto	
  é	
  muito	
  raro	
  que	
  um	
  lipídio	
  mude	
  de	
  plano	
  na	
  bicamada	
  (da	
  de	
  cima	
  para	
  a	
  de	
  baixo,	
  ou	
  vice-­‐versa),	
  movimento	
  chamado	
  flip-­‐flop,	
  que	
  requer	
  enzimas	
  específicas	
  e	
  gasto	
  de	
  energia.	
  	
  Existem	
  quatro	
  tipos	
  diferentes	
  de	
  fosfolipídios,	
  cada	
  um	
  com	
  uma	
  temperatura	
  diferente	
  de	
  cristalização.	
  Por	
  isso,	
  mesmo	
  em	
  temperatura	
  variadas,	
  por	
  ser	
  formada	
  de	
  vários	
  lipídios	
  diferentes,	
  a	
  membrana	
  não	
  se	
  cristaliza.	
  Essa	
  mistura	
  de	
  fosfolipídios	
  é	
  essencial	
  principalmente	
  para	
  células	
  expostas	
  a	
  ambientes	
  com	
  temperatura	
  muito	
  variável.	
  	
  A	
  fluidez	
  da	
  membrana	
  varia	
  de	
  acordo	
  com	
  o	
  número	
  de	
  duplas	
  ligações	
  (insaturadas)	
  dos	
  ácidos	
  graxos,	
  pois	
  isso	
  infuencia	
  na	
  distância	
  mínima	
  entre	
  os	
  fosfolipídios.	
  Portanto,	
  quanto	
  maior	
  o	
  número	
  de	
  lipídios	
  com	
  cadeias	
  insaturadas	
  (a	
  “perninha	
  torta”),	
  maior	
  será	
  a	
  fluidez	
  da	
  membrana.	
  Entretanto,	
  quanto	
  mais	
  compridas	
  forem	
  essas	
  cadeias	
  menos	
  fluída	
  é	
  a	
  membrana,	
  pois	
  ao	
  se	
  emaranharem,	
  uma	
  limita	
  o	
  movimento	
  da	
  outra.	
  	
  Animais	
  exotérmicos,	
  incapazes	
  de	
  regular	
  a	
  própria	
  temperatura,	
  possuem	
  um	
  metabolismo	
  capaz	
  de	
  alterar	
  a	
  composição	
  de	
  ácidos	
  graxos	
  de	
  sua	
  membrana	
  de	
  acordo	
  com	
  a	
  variação	
  de	
  temperatura,	
  concentrando	
  mais	
  cadeias	
  insaturadas	
  (instáveis,	
  mais	
  fluídas)	
  em	
  baixa	
  temperatura	
  e	
  mais	
  cadeias	
  saturadas	
  em	
  temperaturas	
  elevadas	
  (estáveis,mais	
  rígidas),	
  aumentando	
  ou	
  diminuindo	
  a	
  fluidez	
  da	
  membrana,	
  compensando	
  as	
  mudanças	
  de	
  temperatura.	
  Nos	
  animais	
  homeotérmicos	
  a	
  fluidez	
  é	
  controlada	
  apenas	
  pelo	
  colesterol	
  presente	
  entre	
  os	
  fosfolipídios,	
  que	
  impede	
  as	
  cadeias	
  de	
  ácidos	
  graxos	
  de	
  se	
  movimentarem	
  livremente	
  em	
  relação	
  a	
  temperatura.	
  	
  Domínios	
  de	
  membrana	
  	
  Uma	
  questão	
  que	
  intrigou	
  os	
  pesquisadores	
  por	
  muito	
  tempo	
  foi	
  o	
  porque	
  de	
  algumas	
  partes	
  da	
  membrana	
  possuírem	
  características	
  diferentes	
  do	
  todo	
  -­‐	
  por	
  exemplo,	
  os	
  neurônios,	
  que	
  recebem	
  estímulos	
  por	
  toda	
  a	
  mebrana	
  celular,	
  mas	
  só	
  os	
  transmitem	
  pela	
  extremidade	
  do	
  axônio.	
  	
  O	
  motivo	
  disso	
  é	
  que	
  algumas	
  regiões	
  da	
  membrana	
  possuem	
  fluidez	
  menor	
  do	
  que	
  o	
  resto	
  da	
  bicamada	
  lipídica.	
  Essa	
  menor	
  fluidez	
  é	
  resultado	
  do	
  acúmulo	
  de	
  fosfolipídios	
  com	
  cadeias	
  
longas	
  de	
  ácidos	
  graxos,	
  e	
  a	
  maior	
  concentração	
  de	
  colesterol	
  nessas	
  regiões	
  (o	
  que	
  também	
  
aumenta	
  a	
  espessura	
  da	
  bicamada).	
  Essas	
  regiões	
  são	
  denominadas	
  lipid	
  rafts,	
  ou	
  plataformas	
  
lipídicas,	
  e	
  ocorrem	
  em	
  todos	
  os	
  tipos	
  celulares,	
  possuindo	
  funções	
  específicas	
  dependendo	
  do	
  
tipo	
  celular.	
  Elas	
  reunem	
  perto	
  de	
  si	
  um	
  mesmo	
  conjunto	
  de	
  elementos	
  da	
  membrana,	
  como	
  proteínas	
  de	
  uma	
  mesma	
  reação,	
  e	
  devido	
  a	
  espessura	
  dessas	
  áreas	
  ser	
  maior,	
  apenas	
  algumas	
  proteínas	
  conseguem	
  se	
  encaixar	
  nessas	
  regiões.	
  	
  	
  A	
  importância	
  da	
  assimetria	
  da	
  bicamada	
  lipídica	
  	
  
Os	
  dois	
  folhetos	
  lipídicos	
  da	
  bicamadas,	
  ao	
  contrário	
  de	
  suas	
  muitas	
  representações	
  em	
  desenhos	
  didáticos,	
  não	
  são	
  simétricos	
  e	
  uniformes,	
  pois	
  a	
  composição	
  das	
  faces	
  extracelular	
  e	
  intracelular	
  são	
  diferentes	
  em	
  relação	
  às	
  proteínas,	
  carboidratos	
  e	
  lipídios.	
  Além	
  das	
  plataformas	
  lipídicas	
  (domínios	
  de	
  membrana),	
  a	
  presença	
  de	
  diferentes	
  tipos	
  de	
  lipídios,	
  como	
  glicolipídios	
  apenas	
  na	
  parte	
  superior	
  da	
  membrana	
  e	
  um	
  outro	
  tipo	
  específico	
  de	
  lipídio	
  na	
  parte	
  inferior,	
  são	
  responsáveis	
  pela	
  assimetria.	
  Quando	
  essa	
  disposição	
  é	
  perturbada,	
  no	
  caso	
  das	
  hemácias	
  e	
  do	
  leucócitos,	
  o	
  aparecimento	
  na	
  bicamada	
  exterior	
  de	
  um	
  fosfolipídio	
  que	
  deveria	
  estar	
  na	
  camada	
  interior,	
  sinaliza	
  que	
  a	
  célula	
  está	
  morrendo	
  e	
  é	
  um	
  dos	
  fatores	
  reconhecidos	
  pelas	
  células	
  fagocitadoras.	
  	
  	
   Aula	
  8	
  –	
  Proteínas	
  de	
  Membrana	
  	
  Apesar	
  de	
  todas	
  as	
  membranas	
  serem	
  bicamadas	
  lipídicas,	
  as	
  proteínas	
  de	
  cada	
  tipo	
  celular	
  são	
  únicas.	
  São	
  elas,	
  junto	
  aos	
  carboidratos,	
  que	
  dão	
  identidade	
  à	
  células.	
  	
  Elas	
  desempenham	
  funções	
  importantes:	
  o	
  transporte	
  de	
  substâncias	
  que	
  não	
  conseguem	
  atravessar	
  a	
  membrana,	
  a	
  adesão	
  e	
  o	
  reconhecimento	
  celular.	
  Nos	
  tecidos,	
  as	
  a	
  interação	
  entre	
  as	
  proteínas	
  de	
  membrana	
  que	
  permitem	
  que	
  as	
  células	
  se	
  unam	
  umas	
  às	
  outras	
  ou	
  a	
  matriz	
  celular.	
  	
  As	
  proteínas	
  da	
  membrana	
  são	
  classificadas	
  em	
  dois	
  grupos:	
  transmembrana	
  (ou	
  integrais),	
  quando	
  atravessam	
  (total	
  ou	
  parcialmente)	
  a	
  bicamada	
  lipídica,	
  e	
  periféricas	
  quando	
  estão	
  totalmente	
  fora	
  da	
  membrana,	
  associadas	
  à	
  outras	
  proteínas	
  integrais	
  ou	
  aos	
  lípidios	
  por	
  ligações	
  fracas	
  (não-­‐covalentes).	
  As	
  proteínas	
  transmembrana	
  podem	
  ser	
  classificadas	
  em	
  proteínas	
  unipasso	
  (quando	
  atravessam	
  a	
  bicamada	
  lipídica	
  apenas	
  uma	
  vez)	
  ou	
  multipasso	
  (quando	
  a	
  atravessam	
  repetidas	
  vezes).	
  As	
  proteínas	
  unipasso	
  atuam	
  como	
  receptores,	
  enquanto	
  as	
  multipasso	
  criam	
  dentro	
  de	
  si	
  um	
  ambiente	
  hidrofílico	
  que	
  permite	
  a	
  passagem	
  de	
  água	
  e	
  outras	
  moléculas	
  pela	
  membrana.	
  	
  Algumas	
  proteínas	
  se	
  prendem	
  à	
  bicamada	
  apenas	
  por	
  uma	
  ligação	
  covalente	
  a	
  um	
  dos	
  lipídios	
  da	
  membrana,	
  e	
  são	
  chamada	
  proteínas	
  ancoradas.	
  São	
  consideradas	
  integrais,	
  e	
  não	
  periféricas,	
  por	
  não	
  estarem	
  associadas	
  à	
  outras	
  proteínas,	
  mas	
  sim	
  diretemente	
  “ancoradas”	
  na	
  membrana.	
  	
  Para	
  serem	
  separadas	
  dos	
  lipídios	
  da	
  bicamada,	
  no	
  caso	
  das	
  transmembranas,	
  são	
  utilizados	
  detergentes	
  que	
  solubilizam	
  a	
  bicamada	
  lipídica.	
  Já	
  as	
  proteínas	
  periféricas	
  se	
  soltam	
  facilmente,	
  bastando	
  alterar	
  o	
  pH/força	
  iônica	
  do	
  meio.	
  As	
  ancoradas	
  só	
  podem	
  ser	
  removidas	
  com	
  o	
  uso	
  de	
  enzimas	
  específicas	
  da	
  familía	
  das	
  fosfolipases,	
  que	
  cortam	
  as	
  “âncoras”.	
  	
  	
  Atravessando	
  a	
  bicamada	
  	
  As	
  partes	
  da	
  proteínas	
  voltadas	
  para	
  fora	
  da	
  bicamada	
  são	
  naturalmente	
  hidrofílicas.	
  Mas	
  o	
  que	
  acontece	
  com	
  a	
  parte	
  da	
  proteína	
  que	
  atravessa	
  a	
  parte	
  interior	
  hidrofóbica	
  da	
  membrana?	
  Essa	
  parte	
  da	
  proteína	
  é	
  composta	
  principalmente	
  por	
  aminoácidos	
  cujas	
  cadeias	
  laterais	
  são	
  hidrofóbicas,	
  podendo	
  então	
  ficar	
  voltados	
  para	
  a	
  parte	
  interior	
  apolar	
  da	
  membrana.	
  No	
  entanto	
  as	
  ligações	
  peptídicas	
  são	
  hidrofílicas,	
  e	
  estando	
  voltadas	
  pra	
  dentro	
  formam	
  pontes	
  de	
  hidrogênio,	
  o	
  que	
  lhes	
  dá	
  um	
  formato	
  espiralado	
  de	
  alfa-­‐hélice.	
  	
  A	
  parte	
  hidrofóbica	
  da	
  proteína	
  é	
  chamada	
  de	
  domínio	
  apolar,	
  enquanto	
  a	
  hidrofílica	
  é	
  chamada	
  de	
  domínio	
  polar.	
  	
  Complexos	
  de	
  proteínas	
  	
  Além	
  das	
  proteínas	
  multipasso,	
  que	
  criam	
  um	
  ambiente	
  hidrofílico,	
  muitas	
  proteínas	
  formam	
  complexos	
  na	
  membrana,	
  podendo	
  ser	
  composto	
  apenas	
  de	
  proteínas	
  iguais	
  ou	
  não.	
  Esses	
  complexos	
  
também	
  formam	
  uma	
  área	
  hidrofílica	
  pela	
  qual	
  passam	
  moléculas	
  como	
  íons	
  ou	
  açúcares,	
  que	
  normalmente	
  são	
  barrados	
  pela	
  membrana.	
  	
  A	
  mobilidade	
  das	
  proteínas	
  	
  Já	
  vimos	
  que	
  as	
  proteínas	
  movem-­‐se	
  livremente	
  pela	
  membrana	
  (noplano	
  lateral)	
  e	
  que	
  podem	
  girar	
  em	
  seu	
  próprio	
  eixo.	
  Porém	
  existem	
  restrições	
  quanto	
  à	
  esses	
  movimentos,	
  de	
  acordo	
  com	
  regiões	
  chamadas	
  domínios	
  de	
  membrana,	
  os	
  quais	
  podem	
  estar	
  separados	
  por	
  barreiras.	
  Essas	
  restrições	
  existem	
  por	
  vários	
  motivos,	
  como	
  por	
  exemplo	
  no	
  caso	
  do	
  espermatozóide,	
  que	
  possui	
  proteínas	
  específicas	
  na	
  região	
  da	
  cabeça	
  que	
  fará	
  contato	
  com	
  o	
  óvulo,	
  que	
  não	
  estão	
  presentes	
  na	
  cauda	
  e	
  vice-­‐versa.	
  Os	
  mecanismos	
  responsáveis	
  por	
  essas	
  restrições	
  são	
  os	
  seguintes:	
  	
   1. Formação	
  de	
  complexos:	
  várias	
  proteínas	
  se	
  associam	
  formando	
  complexos,	
  que	
  só	
  podem	
  se	
  deslocar	
  como	
  um	
  todo.	
  	
   2. Associação	
  ao	
  citoesqueleto	
  ou	
  à	
  matriz	
  extracelular:	
  algumas	
  proteínas	
  tem	
  sua	
  mobilidade	
  lateral	
  limitada	
  por	
  estarem	
  associadas	
  a	
  macromoléculas	
  do	
  meio	
  intra	
  ou	
  extracelular,	
  como	
  elementos	
  do	
  citoesqueleto	
  os	
  da	
  matriz	
  extracelular.	
  	
   3. Ligação	
  entre	
  proteínas:	
  as	
  proteínas	
  de	
  duas	
  células	
  podem	
  ligar-­‐se,	
  limitando	
  a	
  mobilidade	
  de	
  ambas.	
  As	
  proteínas	
  de	
  uma	
  célula	
  podem	
  se	
  ligar	
  também	
  à	
  moléculas	
  do	
  meio	
  extracelular.	
  	
  Muitos	
  domínios	
  são	
  consequência	
  da	
  existência	
  de	
  barreiras.	
  Estas	
  são	
  formadas	
  por	
  arranjos	
  de	
  proteínas	
  que	
  impedem	
  a	
  livre	
  movimentação	
  de	
  outras	
  proteínas	
  ou	
  lipídeos	
  entre	
  elas.	
  As	
  proteínas	
  se	
  movimentam	
  livremente	
  dentro	
  de	
  um	
  determinado	
  domínio,	
  mas	
  não	
  conseguem	
  passar	
  para	
  os	
  domínios	
  vizinhos.	
  As	
  proteínas	
  que	
  ligam	
  um	
  conjunto	
  de	
  células	
  também	
  podem	
  constituir	
  barreiras.	
  	
  	
   Aula	
  9	
  –	
  Permeabilidade	
  da	
  Membrana	
  	
  Sabemos	
  que	
  a	
  membrana	
  celular	
  funciona	
  como	
  uma	
  barreira,	
  separando	
  o	
  meio	
  extracelular	
  do	
  intracelular.	
  Entretanto	
  a	
  célula	
  interage	
  com	
  o	
  meio	
  exterior	
  de	
  diversas	
  maneiras,	
  seja	
  na	
  respiração	
  (absorvendo	
  oxigênio	
  e	
  liberando	
  gás	
  carbônico)	
  ou	
  na	
  absorção	
  de	
  nutrientes.	
  Para	
  permitir	
  essa	
  interação	
  com	
  o	
  meio	
  extracelular,	
  a	
  membrana	
  é	
  dotada	
  de	
  permeabilidade	
  seletiva,	
  o	
  que	
  não	
  significa	
  que	
  a	
  célula	
  seleciona	
  tudo	
  aquilo	
  que	
  precisa,	
  mas	
  sim	
  que	
  a	
  passagem	
  das	
  moléculas	
  
depende	
  apenas	
  de	
  suas	
  características	
  fisico-­‐químicas.	
  	
  Essa	
  permeabilidade	
  está	
  diretamente	
  relacionada	
  a	
  natureza	
  lipídica	
  da	
  membrana,	
  e	
  a	
  seleção	
  das	
  moléculas	
  que	
  a	
  atravessam	
  é	
  feita	
  em	
  função	
  de	
  seu	
  tamanho,	
  polaridade	
  e	
  carga.	
  	
  
Tamanho:	
  quanto	
  menor	
  a	
  molécula,	
  mais	
  facilmente	
  atravessará	
  a	
  membrana.	
  	
  
Polaridade:	
  como	
  a	
  bicamada	
  é	
  apolar,	
  as	
  moléculas	
  apolares	
  tem	
  muito	
  mais	
  faclidade	
  em	
  atravessá-­‐la	
  do	
  que	
  as	
  moléculas	
  polares.	
  	
  DUVIDA	
  IMPORTANTE:	
  Não	
  é	
  o	
  lado	
  hidrofílico	
  da	
  membrana	
  que	
  fica	
  voltado	
  pra	
  fora	
  e	
  pra	
  dentro	
  (afinal,	
  as	
  próprias	
  proteínas	
  tem	
  aminoácidos	
  com	
  cadeias	
  laterais	
  hidrofóbicas	
  quando	
  passam	
  no	
  interior	
  hidrofóbico	
  da	
  membrana)?	
  Ou	
  seja,	
  ela	
  é	
  hidrofilica	
  em	
  ambos	
  os	
  lados,	
  e	
  hidrofóbica	
  no	
  meio,	
  certo?	
  Como	
  as	
  moleculas	
  apolares	
  passam	
  pela	
  parte	
  hidrofilica	
  da	
  membrana?	
  	
  
Carga:	
  moléculas	
  dotadas	
  de	
  carga,	
  como	
  os	
  íons,	
  mesmo	
  sendo	
  muito	
  pequenas,	
  não	
  atravessam	
  a	
  membrana.	
  	
  	
  Com	
  esses	
  três	
  fatores	
  atuando,	
  as	
  moléculas	
  que	
  passam	
  pela	
  membrana	
  com	
  mais	
  facilidade	
  são	
  aquelas	
  bem	
  pequenas,	
  apolares	
  e	
  sem	
  carga;	
  exemplos	
  de	
  moléculas	
  assim	
  são	
  o	
  O2	
  e	
  o	
  CO2,	
  no	
  entanto	
  vários	
  solventes	
  orgânicos	
  também	
  se	
  enquadram	
  nesses	
  quesitos	
  e	
  são	
  prejudiciais	
  às	
  células.	
  	
  Os	
  íons	
  Ca,	
  K	
  e	
  Cl,	
  embora	
  sejam	
  moléculas	
  muito	
  pequenas,	
  são	
  hidrofílicos,	
  “prendendo”	
  em	
  volta	
  de	
  si	
  muitas	
  moléculas	
  de	
  água,	
  o	
  que	
  aumenta	
  muito	
  seu	
  tamanho	
  e	
  os	
  impede	
  de	
  atravessar	
  a	
  bicamada.	
  Duvida:	
  mas	
  só	
  de	
  ser	
  hidrofílico	
  não	
  seria	
  o	
  suficiente	
  pra	
  impedi-­‐los	
  de	
  passar?	
  	
  Duvida:	
  Os	
  lipídios	
  são	
  moléculas	
  apolares	
  (?).	
  Porém	
  os	
  lipidios	
  da	
  membrana,	
  no	
  lado	
  exterior,	
  são	
  hidrofilicos,	
  sendo	
  hidrofobicos	
  só	
  no	
  espaço	
  entre	
  a	
  bicamada,	
  certo?	
  	
  Difusão	
  simples	
  	
  Além	
  desses	
  três	
  fatores	
  principais,	
  há	
  um	
  quarto	
  fator,	
  a	
  concentração.	
  Assim,	
  as	
  moléculas	
  de	
  oxigênio	
  só	
  passarão	
  ao	
  interior	
  da	
  célula	
  se	
  no	
  meio	
  extracelular	
  houver	
  uma	
  concentração	
  maior	
  do	
  que	
  no	
  meio	
  intracelular.	
  Isso	
  explica	
  porque	
  as	
  plantas	
  liberam	
  oxigênio,	
  afinal,	
  elas	
  o	
  produzem	
  dentro	
  de	
  suas	
  células.	
  Todo	
  esse	
  processo	
  se	
  dá	
  sem	
  o	
  gasto	
  de	
  energia,	
  e	
  é	
  chamado	
  difusão	
  
simples	
  (que	
  é	
  um	
  tipo	
  de	
  transporte	
  passivo).	
  	
  
Osmose	
  é	
  o	
  nome	
  dado	
  quando	
  o	
  processo	
  de	
  difusão	
  simples	
  acontece	
  com	
  a	
  água,	
  que	
  apesar	
  de	
  ser	
  polar,	
  não	
  possui	
  carga	
  e	
  é	
  pequena	
  o	
  suficiente	
  pra	
  passar	
  pela	
  membrana.	
  A	
  água	
  sempre	
  irá	
  do	
  meio	
  com	
  menor	
  concentração	
  de	
  soluto	
  em	
  direção	
  ao	
  meio	
  com	
  maior	
  concentração	
  de	
  soluto.	
  	
  Mas	
  a	
  difusão	
  simples	
  não	
  dá	
  conta	
  de	
  suprir	
  todas	
  as	
  necessidades	
  da	
  célula.	
  Há	
  muitas	
  moléculas	
  necessárias	
  para	
  o	
  bom	
  funcionamento	
  do	
  funcionamento	
  da	
  mesma,	
  que	
  não	
  passam	
  pela	
  bicamada	
  lipídica.	
  Nesses	
  casos,	
  entram	
  em	
  ação	
  as	
  proteínas	
  transportadoras.	
  	
  	
   Aula	
  10	
  –	
  As	
  Proteínas	
  Transportadoras	
  	
  Dentre	
  as	
  proteínas	
  presentes	
  na	
  membrana	
  celular,	
  são	
  de	
  especial	
  importância	
  aquelas	
  que	
  possibilitam	
  a	
  passagem	
  das	
  moléculas	
  que	
  não	
  são	
  capazes	
  de	
  atravessar	
  a	
  bicamada	
  lipídica.	
  Todas	
  as	
  proteínas	
  transportadoras:	
  	
   1. São	
  proteínas